RISCHIO BIOLOGICO LEGIONELLA PRESSO STRUTTURE SANITARIE DI ROMA E PROVINCIA BIOHAZARD LEGIONELLA IN HEALTH CARE FACILITIES IN ROME AND PROVINCE

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1 RISCHIO BIOLOGICO LEGIONELLA PRESSO STRUTTURE SANITARIE DI ROMA E PROVINCIA BIOHAZARD LEGIONELLA IN HEALTH CARE FACILITIES IN ROME AND PROVINCE Doriana Antonella Giorgi MD 1, Sabina Palmieri 1, Gianluigi Renzi 1, Francesco Massoni 2, Serafino Ricci 2 1 ARPALazio Servizio Ambiente e Salute Sezione provinciale di Roma 2 Dipartimento di Scienze anatomiche, istologiche, medico legali e dell apparato locomotore Università degli studi Sapienza di Roma Keywords: Legionella, Pneumonia, Biohazard Abstract Background Legionella is a causative agent of bacterial pneumonia, a risk factor for pneumonia for patients, but also for workers. Objectives The authors describe the cases arising from the activities of prevention and control operating within the province of Rome by the Lazio Regional Environmental Protection Agency (ARPALazio). Methods 4354 samples were analyzed, as follows: 27.65% in 2007, 35% in 2008 and 37.35% in The activity sampling was evenly distributed between 25% and 30% in each quarter of year. Results In 2007 the non-compliant samples are 10.60%, to become 24.57% in 2008 and finally 26.63% in The level of contamination is low in 13%, 11% medium and high in 3% of the total. Conclusions The Legionella contamination does not present a specific distribution in the four quarters of time considered for each year or a specific distribution for the type of health facility, and the level of contamination settles on medium-low values. Abstract Introduzione La legionella è un agente eziologico di polmonite batterica, un fattore di rischio di polmonite per i pazienti, ma anche per lavoratori. Obiettivi Gli Autori procedono ad una valutazione del rischio infezione da legionella mediante una descrizione epidemiologica dei casi di positività derivanti dall attività di prevenzione e controllo operata in provincia di Roma dall Agenzia Regionale Protezione Ambiente Lazio (ARPALazio). Metodi Sono stati analizzati 4354 campioni, così ripartiti: 27,65% nel 2007, 35% nel 2008 e 37,35% nel L attività di prelievo è stata uniformemente distribuita, tra 25% e 30%, nei singoli trimestri. Risultati Nel 2007 i campioni non conformi risultano il 10,60%, nel 2008 diventano il 24,57% ed infine il 26,63% nel Il livello di contaminazione risulta basso nel 13%, medio nell 11% ed alto nel 3% del totale. Conclusioni La contaminazione da Legionella non presenta una specificità di distribuzione temporale nei quattro trimestri considerati per ogni anno o una specificità di distribuzione per quanto riguarda il tipo di struttura sanitaria, ed il livello di contaminazione nel complesso si assesta su valori bassi-medi. Introduzione La Legionella è un agente eziologico di polmonite batterica. Un bacillo Gram-negativo, lungo fino a 20 μm, aerobio, asporigeno, mobile in quanto munito di uno o più flagelli. Comprende 53 specie ripartite in oltre 70 sierogruppi. La specie pneumophila comprende 16 sierogruppi (Diederen, 2008) e rientra nell eziologia di oltre il 90% dei casi di polmonite batterica da legionella, più precisamente il sierogruppo 1 di oltre l'84%. Segue il 3,9% di polmoniti da L. longbeachae ed il 2,4% da L. bozemanae. Il 2,2% si devono a L. micdadei, L. dumoffii, L. feeleii, L. wadsworthii e L. anisa (Yu et al., 2002). Uno studio ha evidenziato che L. pneumophila sierogruppo 1 si ritrova nell'ambiente in misura ridotta (dal 18 al 45%), mentre gli altri sierogruppi sono più frequenti (Borella et al., 2004).

2 I casi notificati rappresentano il 2-15% di tutte le polmoniti comunitarie ed il 15-20% di quelle nosocomiali, con una letalità rispettivamente del 20 e 40% (Fields et al., 2002; Roig et al., 2003). In Italia, fino al 1998 erano notificati non più di 100 casi l'anno, poi le segnalazioni sono aumentate con 325 casi nel 2001, 639 nel 2002 e 600 nel 2003 (Rota et al., 2003; Rota et al., 2004). La via di trasmissione è quella aerea, ovvero goccioline di aerosol contenenti i batteri generate dall apertura di rubinetti come la doccia o lavandino, oltre che da vasche idromassaggio e piscine, bagni turchi e saune, etc.. Soprattutto in ambiente sanitario l infezione da Legionella è particolarmente sentita. Tra i fattori predisponenti la malattia, infatti, risultano l età avanzata, il fumo di sigaretta, la presenza di malattie croniche, l immunodeficienza, ma anche il grado di intensità dell esposizione, rappresentato dalla quantità di legionelle presenti e dal tempo di esposizione. In questo senso gli operatori sanitari e figure operanti in strutture sanitarie, ad esempio gli addetti ai servizi di igiene e manutenzione, possono costituire una categoria a rischio. Un indagine sulla prevalenza di anticorpi anti-legionella in soggetti che lavorano in strutture contaminate ha visto una positività sierologica, riguardante i sierogruppi 7-14, maggiormente presenti nell'acqua calda delle strutture indagate (Borella et al., 2004). L Istituto Superiore di Sanità (ISS) il 5 maggio 2000 ha elaborato le Linee guida per la prevenzione ed il controllo della legionellosi (G.U. n. 103 del 5 maggio 2000). Tale strumento costituisce un valido punto di riferimento in materia di prevenzione e sorveglianza per ospedali e case di cura. Sono seguite, nel 2005, le Linee guida recanti indicazioni ai laboratori con attività di diagnosi microbiologica e controllo ambientale della legionellosi (GU n. 29 del 5 febbraio 2005). L obiettivo dello studio è quello di presentare i risultati delle analisi effettuate dall Agenzia Regionale Protezione Ambiente Lazio (ARPALazio) su prelievi eseguiti presso strutture sanitarie dislocate sul territorio di Roma e provincia nel corso del triennio e, quindi, una valutazione del Rischio Relativo rispetto alle altre strutture interessate dall attività di prevenzione e controllo dell ARPA. Materiale e metodi Nelle strutture sanitarie dislocate sul territorio di Roma e provincia sono stati raccolti 283 campioni, rappresentati da acqua e tamponi su superficie, nel 2007, nel 2008 sono stati 297 e 214 nel Le strutture sanitarie coinvolte sono state suddivise per tipo: 113 prelievi presso case di cura, 634 presso ospedali, 11 negli studi odontoiatrici, 10 negli studi medici e 26 nei poliambulatori medici. Ed i campioni in base ai punti di prelievo: docce e lavandini. Terreni di coltura impiegati per la semina sono GVPC-agar, BCYE-agar e CYE agar base in confezione originale che, forniti di certificato di qualità, rispondono alle esigenze di qualità più rigorose. Infatti, da parte della ditta produttrice sono sottoposti a controlli qualitativi su ciascun lotto. Mentre i reagenti per la preparazione del campione sono una soluzione di Ringer o compresse di Ringer, per il trattamento di decontaminazione è stato usato tampone acido HCl/KCl a ph 2,2, ed infine per l identificazione definitiva di Legionella pneumophila (siero gruppi 1, 2-14) e species il Legionella Latex Test ed il Slidex Legionella Kit. I terreni ed i reagenti sono conservati, al riparo dalla luce, in frigorifero a T C=4±4 o nell armadio a temperatura ambiente secondo le relative caratteristiche, fino alla data di scadenza indicata sull etichetta (1 settimana nel caso in cui il terreno CYE agar base dovesse essere preparato in laboratorio). Il procedimento utilizzato è il seguente. Dal campione originale si prelevano 10 ml che vengono messi in un contenitore sterile con tappo a vite. Il resto del campione viene sottoposto a filtrazione per mezzo di rampe filtranti, con l uso di imbuti e bicchieri sterilizzati mediante flambatura prima e dopo il loro utilizzo. Essendo le rampe di filtrazione costituite da più stazioni filtranti collegate in serie e munite di rubinetto autonomo, è possibile la filtrazione simultanea di più campioni d acqua. Dopo la filtrazione, la membrana (o le membrane nel caso fosse necessario utilizzarne più di una in successione), viene posta nel contenitore sterile contenente i 10 ml prelevati all inizio e sottoposta all azione dell agitatore (15 minuti a 150 rpm: formazione del concentrato) per consentire il distacco dei batteri catturati e la loro risospensione. Il concentrato, prima di essere conservato al buio, in frigorifero a T C=6±2 per non oltre 14 giorni, viene analizzato come tal quale (si tratta di una semina diretta su terreno di coltura selettivo che non prevede alcun trattamento particolare del concentrato) e dopo trattamento a caldo (si tratta di una semina su terreno di coltura selettivo dopo il trattamento di decontaminazione che prevede il trasferimento di 1,5 ml in contenitore sterile, in bagnomaria a T C =50±1, per 30±2 min.). In caso d intervento di campioni che provengono da circuiti di acqua calda, il trattamento a caldo viene sostituito dal trattamento di decontaminazione con acido. Tale trattamento prevede: il trasferimento di 4ml in provetta sterile, la centrifuga a 3000 giri per un tempo di 30±1 min. o 6000 giri per un tempo di 10±1 min., l estrazione di 3 ml di sovranatante, l aggiunta di 3 ml di tampone acido HCl/KCl a ph 2,2, l agitazione delicata e la posa a temperatura ambiente per 5±0.5 min., la semina su terreno di coltura selettivo. La semina del campione d acqua concentrato viene effettuata su un terreno colturale di tipo selettivo. Si tratta del GVPC-agar che, per la presenza di L-cisteina ed alcuni antibiotici, favorisce la crescita della Legionella e l allontanamento della flora batterica concomitante.

3 La quantità d inoculo da seminare è pari a 0,1 ml. L incubazione delle piastre avviene in aerobiosi, in termostato a T C =37±1, con 2,5% di CO2 e in ambiente umido per un tempo massimo di 10 giorni. La crescita batterica viene monitorata dal personale tecnico ogni 2/3 giorni. In caso di piastre molto contaminate (crescita batterica >200), che ostacolerebbero la corretta identificazione ed enumerazione delle colonie, si procede con diluizioni in base 10 del concentrato, precedentemente conservato, mediante acqua distillata sterile o soluzione di Ringer ed alla semina delle relative piastre di GVPC-agar. Dalla lettura delle piastre, le colonie che già dopo 2-3 giorni di incubazione crescono su terreno selettivo GVPC-agar e si presentano di piccole dimensioni, di colore bianco-grigio, leggermente convesse e con margini regolari, passano prima attraverso un identificazione presuntiva e poi attraverso un identificazione definitiva. Le colonie cresciute su terreno selettivo GVPC-agar, con le caratteristiche sopra descritte, sono considerate Legionelle spp SOSPETTE (S) e vengono isolate su due terreni colturali di tipo non selettivo quali il BCYE-agar (con L-cisteina) che sviluppa Legionella, e CYE agar base (o BCYE-Cys: privo di L-cisteina) sul quale, invece, le colonie di Legionella non crescono per assenza del supplemento di crescita. La semina avviene nel seguente modo: dalle piastre di terreno GVPC-agar più rappresentative per la presenza di maggiore crescita di colonie sospette, si prelevano 5 colonie e si trapiantano su entrambi i terreni BCYE-agar e CYE Agar Base (il numero di colonie da testare si riduce a 2 per tipo nel momento in cui sono presenti differenti tipi di colonie sospette). Dopo 2 giorni (24h+24h) di incubazione a T C =37±1, se si osserva una crescita differenziale con sviluppo delle colonie esclusivamente su terreno contenente cisteina, allora le colonie che inizialmente erano delle sospette Legionelle vengono identificate come PRESUNTE (P) (Legionella spp) Le colonie riconosciute come presunte Legionelle e con un diametro di almeno 1 mm sono sottoposte al test di agglutinazione al lattice. Si tratta di un metodo di screening semplice e rapido che sfrutta particelle di lattice blu sensibilizzate con anticorpi specifici di coniglio che reagiscono con gli antigeni presenti sulla parete cellulare di Legionella pneumophila e Legionella species, formando un evidente precipitato. Le particelle che agglutinano in non più di 1 minuto confermano la presenza di Legionella pneumophila, sierogruppi 1 o 2-14, o Legionella species (Legionelle DEFINITIVE (D)). Risultati Nel 2007 i campioni non conformi risultano il 10,60%, nel 2008 diventano il 24,57% ed infine il 26,63% nel Figura 1.

4 Il livello di contaminazione risulta basso (tra 100 ufc e 1000 ufc) nel 13%, medio (tra 1000 ufc e10000 ufc) nell 11% ed alto(>10000 ufc) nel 3% del totale. Figura 2. Nel 2007 l indagine è stata effettuata esclusivamente su strutture ospedaliere, di cui l 89% dei prelievi è risultato conforme, mentre l 11% non conforme. Nel 2008 i non conformi sono diventati il 31%, che si accompagnano ad un 5% nelle case di cura esaminate. I prelievi effettuati presso odontoiatri e poliambulatori sono risultati conformi nella totalità. Infine nel 2009 i prelievi non conformi hanno interessato il 23% dei prelievi ospedalieri, il 30% delle case di cura, ed infine l 80% dei poliambulatori. Figura 3. I punti di prelievo sui quali si è concentrata l attenzione degli Autori sono nel particolare docce e lavandini. Nel 2007 un livello di contaminazione basso ha riguardato il 7% dei prelievi da lavandino ed il 10% da doccia; un livello medio il 4% da lavandino ed un 7% da doccia; alto solo il 3% da lavandino.

5 Figura 4. Nel 2008 un livello basso di contaminazione ha riguardato il 16% dei lavandini campionati ed il 13% delle docce. I livelli medi di contaminazione il 13% dei lavandini e l 11% delle docce. Alto l 1% dei lavandini ed il 2% delle docce. Figura 5. Nel 2009 il 13% dei prelievi da lavandino sono risultati con un basso livello di contaminazione, il 17% delle docce esaminate. Il 13% dei lavandini un medio livello di contaminazione, il 7% delle docce. Il 2% dei lavandini ha presentato un alto livello di contaminazione, il 7% delle docce. Figura 6. Il Rischio Relativo di Legionella presso strutture sanitarie rispetto a strutture ricettive (camping, hotel, residenza religiosa), abitazioni private, ed altre strutture (aereo, cantiere, carcere, caserma, circolo sportivo, nave, residenza studenti, ristorazione, scuola, spogliatoio, ufficio, etc.) risulta essere (intervallo di confidenza al 95%: ). Conclusioni La contaminazione da Legionella non presenta una specificità di distribuzione temporale nei quattro trimestri considerati per ogni anno e l incremento del numero di campioni non conformi va interpretato considerando il contestuale aumento dell attività di campionamento nel biennio rispetto al Il livello di contaminazione nel complesso si assesta su valori bassi-medi. Anche il coinvolgimento sostanziale delle strutture ospedaliere e case di cura, quindi di ambienti contraddistinti da un contesto di persone più numerose rispetto a studi odontoiatrici o poliambulatori, risente di una attività di controllo e campionamento decisamente più significativi.

6 Stessa conclusione si può trarre per quanto concerne il punto di prelievo, anche se, a riguardo, è presumibile una maggiore contaminazione dei lavandini rispetto alle docce, anche in funzione del diverso indice di utilizzazione di questi, probabilmente maggiore nell uno, il lavandino, piuttosto che nell altro, la doccia. Tuttavia questi risultati, che comunque rilevano una positività del campionamento e delle successive analisi, hanno indotto gli Autori ad approfondire lo studio valutando un rischio relativo di positività alla Legionella. E da questa valutazione emerge una associazione, statisticamente significativa, tra Legionella e strutture sanitarie, rispetto ad altri tipi di sedi quali strutture ricettive ed abitazioni private. Le motivazioni vanno ricercate nelle circostanze, quali la carica batterica, il periodo di esposizione e lo stato di salute degli utenti esposti, che rendono tale habitat un contesto favorevole alla contaminazione, giustificando in questo modo le sollecitazioni, rivolte agli operatori sanitari, di ricorrere a tutte le necessarie misure di sorveglianza nei riguardi del rischio biologico da Legionella. In questo senso, le Linee guida elaborate dall Istituto Superiore di Sanità il 5 maggio 2000 costituiscono un efficace e valido strumento a disposizione dei soggetti coinvolti. Innanzitutto si parla di casa presunto nell eventualità di segni di polmonite rilevabili all esame clinico e/o esame radiologico, con almeno uno di questi parametri aggiuntivi: incremento di almeno 4 volte o superiore a 1:256 del titolo anticorpale specifico per il sierogruppo 1 ovvero immunofluorescenza diretta condotta su materiale patologico positiva. Si definisce, invece, caso accertato qualora all esame clinico e/o radiologico positivi fanno seguito o l isolamento del microrganismo da materiale organico quale secreto respiratorio, broncolavaggio, campione tissutale polmonare, essudato pleurico, essudato pericardico, sangue, etc., o l immunofluorescenza diretta o microagglutinazione positive per un incremento di almeno 4 volte del titolo anticorpale specifico e condotte su due sieri prelevati a distanza di almeno 10 giorni oppure la positività delle urine per l antigene specifico. La legionellosi è soggetta a notifica obbligatoria in classe II in base al D.M. 15/12/90 da parte del medico segnalatore, entro 48 ore, al Servizio di Igiene e Sanità Pubblica (SISP) dell Azienda USSL. Successivamente il SISP provvederà, una volta validata la diagnosi, a trasmettere il modello 15 alla Regione che informerà della notifica individuale il Ministero della Sanità ed all'istat. Nell eventualità di focolai epidemici, ovvero qualora fossero accertati almeno due casi ricollegabili ad una stessa esposizione nell arco di sei mesi, si dovrà procedere alla notifica obbligatoria in classe IV. Il medico segnalatore entro 24 ore dovrà notificare il caso al SISP della ASL di diagnosi, che trasmetterà il modello 15 alla Regione, al Ministero della Sanità, all'istituto Superiore di Sanità ed all'istat. Inoltre il medico che accerta la diagnosi dovrà provvedere alla compilazione della scheda di sorveglianza (Circolare 400.2/9/5708 del 29/12/93) da inviare al SISP dell Azienda USSL da parte della Direzione Sanitaria dell Ospedale ed all I.S.S. da parte o della Direzione Sanitaria dell Ospedale o dal SISP dell Azienda USSL di competenza. Il SISP provvederà alla trasmissione mensile delle schede alla Regione. I ceppi isolati e sospetti di Legionella dovranno essere inviati per la conferma al Laboratorio di Batteriologia e Micologia Medica dell ISS, che è il laboratorio nazionale di riferimento per la legionellosi. Bibliografia - Borella P et al: Indagine multicentrica sui fattori di rischio correlati alla presenza di Legionella spp. nell acqua di strutture pubbliche e private. Journal of Preventive Medicine and Hygiene 2004; 45 (4):328 - Borella P et al: Sieropositività per Legionella spp. in gruppi di popolazione a diverso rischio espositivo. Journal of Preventive Medicine and Hygiene 2004; 45(4): Diederen BMW: Legionella spp and Legionnaires' disease. J Infect 2008;56(1):1 12. Fields BS et al: Legionella and Legionnaires Disease: 25 year of Investigation. Clin Microbiol Rev 2002; 15(3): Roig J et al: Legionella spp.: community acquired and nosocomial infections. Curr Opin Infect Dis 2003; 16(2): Rota MC et al: La legionellosi in Italia nel Rapporto annuale. Notiziario ISS 2004; 17(10): Rota MC et al: Rapporto annuale sulla legionellosi in Italia nel Notiziario ISS 2003; 16(12):3-8 - Yu VL et al: Distribution of Legionella species and serogroups isolated by culture in patients with sporadic community-acquired legionellosis: an international collaborative survey. J Infect Dis 2002;186(1): Autore di riferimento: Serafino Ricci Viale Regina Elena, Roma tel serafino.ricci@uniroma1.it