Francesca Giacobbi Laura Fiume

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1 La ricerca colturale della legionella in campioni d acqua L esperienza dell ARPA in ambito sanitario Francesca Giacobbi Laura Fiume Sezione Provinciale di Bologna Dipartimento Tecnico

2 Attività del Laboratorio di Riferimento Regionale - indagini ambientali in collaborazione con l'ausl o su incarico della Magistratura nei casi di malattia o decesso, - monitoraggio dei punti critici di contaminazione degli impianti idrici e di condizionamento di strutture nosocomiali e che forniscono prestazioni sanitarie, ambienti di vita comunitaria ed abitazioni private, e rilascio di pareri, - partecipazione alla definizione di piani di decontaminazione, - centro di riferimento tecnico per i Laboratori di Base,

3 (segue) - centro di raccolta e conservazione dei ceppi isolati nella Regione da inviare su richiesta al Centro di Riferimento Nazionale, - creazione di un database dei dati risultanti dall'attività svolta, - collaborazione con il Centro di Riferimento Nazionale per centralizzare il flusso informativo e sviluppare il know-how (soprattutto per la definizione di Linee Guida sempre più attuali), - partecipazione attiva ad iniziative rivolte al mondo scientifico, organizzazione di corsi di formazione per gli operatori del settore e preparazione di materiale divulgativo.

4 Ricerca colturale - (G.U. n /5/00) Principio: riconoscimento delle caratteristiche morfologiche nutrizionali e sierologiche di Legionella spp. Campione 1-5 l Filtrazione nylon 0.2 µm Raschiamento e risospensione in 10 ml Trattamento termico 50 per 30 Isolamento BCYE α (base +) Colonie sospette Incubazione in microaerofilia fino a 11 gg Semina per spatolamento MWY Isolamento CYE agar (base ) Incubazione in microaerofilia per h Base + crescita Base no crescita Conferma sierologica

5 Riconoscimento attraverso metodi di PCR Estrazione del DNA Amplificazione mediante metodi PCR 1 copia 1'000'000 copie Ricerca qualitativa - Nested PCR (gene amplificato 16S): Legionella spp. - Nested PCR (gene amplificato mip): Legionella pneumophila Ricerca quantitativa - Real-Time PCR (gene amplificato mip): Legionella pneumophila

6 Campioni indagati per anno % % 38% 36% 29% (9 m) Totale campioni % positivi

7 Tipologia di campioni esaminati suddivisi per matrice Matrice Campioni Campioni totali positivi Impianti di distribuzione % Torri di raffreddamento % Boiler % Vasche di accumulo % Riuniti % Apparecchi per inalazioni 5 1 Idromassaggi, piscine 5 2 Filtri 28 0 Condensa condizionatori 10 0 Biofilm % Incrostazioni % Acqua da bere %

8 Strutture indagate n Struttura Provincia Negative Positive 11 Ospedali e case di cura 9 BO 1 PC RA 46 Studi odontoiatrici BO Terme BO Alberghi 14 RA 12 BO 4 FO MO 1 FE 28 Abitazioni 19 BO 9 RA Ditte 8 BO 1 RA MO 3 Impianti sportivi e ludici BO Fiere ed esposizioni BO 1 0

9 L esperienza del Laboratorio nelle Strutture Ospedaliere - Ospedali contaminati: 9 su 10 - Aree indagate esenti da contaminazione: 20-30% - Campioni esaminati: 3600 (88% di quelli esaminati dal Laboratorio) - Campioni positivi: 1582 (44%) - Alla data dello studio nessun caso di legionellosi nosocomiale

10 Ospedali - Impianti di distribuzione (docce, rubinetti) 3333 campioni UFC/l campioni % Positivi: 1548 (46%) Valore max: UFC/l Valore min: 10 UFC/l Negativi: 1795 < > % 100% Lp3: 85% Lp6: 9% Lp1: 5% Lp7-14: 1% Lboz: <1%

11 Ospedali - Boiler 35 campioni UFC/l campioni % Positivi: 21 (60%) Valore max: UFC/l Valore min: 50 UFC/l Negativi: 14 < > % 100% Lp6: 62% Lp3: 33% Lp7-14: 5% Non è mai stata reperita L. pneumophila sierogruppo 1

12 Ospedali - Vasche di accumulo 14 campioni UFC/l campioni Positivi: 5 (36%) Valore max: UFC/l Valore min: 600 UFC/l Negativi: 9 < > Lp7-14 Lp6 Non è mai stata reperita L. pneumophila sierogruppo 1

13 Ospedali - Torri di raffreddamento 173 campioni UFC/l campioni Positivi: 7 (4%) Valore max: UFC/l Valore min: 20 UFC/l Negativi: 166 < > Lp1 Lp3 Lp6 Lp7-14

14 Confronto della frequenza di positività tra la diagnosi molecolare in PCR nested e la diagnosi colturale di Legionella pneumophila Risposta all esame diagnostico Diagnosi molecolare Diagnosi colturale Campioni positivi Campioni negativi Vantaggi nell'utilizzo dei metodi in PCR: Riduzione del tempo di esecuzione dell'analisi da giorni a 48 ore Aumento della sensibilità Aumento della specificità Riduzione dei rischi per l'operatore

15 La misurazione della contaminazione degli impianti: il problema del rilascio intermittente

16 (segue) - rischio di sottostima: nel caso di esiguo rilascio di cellule dal biofilm al momento della misura o per precedente distacco massivo (falsi negativi), - rischio di sovrastima: nel caso di massivo rilascio di cellule dal biofilm al momento della misura.

17 Lo studio del 2003 in ambiente ospedaliero Protocollo applicato nello studio: - 5 prelievi al giorno per 7 giorni consecutivi (invece di non più di 4 prelievi distribuiti in un anno), - 65 punti di prelievo (con e senza filtri) esaminati, - numero totale di campioni: 2275.

18 Punti di prelievo privi di filtro - Nessun punto di prelievo precedentemente positivo ha fornito risultati tutti negativi; almeno alcuni (la maggior parte o tutti) sono risultati positivi: il problema del "rilascio intermittente" è tutt'altro che trascurabile! - Diversi punti precedentemente negativi hanno mostrato risultati positivi dimostrando la reale esistenza di punti di prelievo "falsi negativi".

19 Esempio di un reparto dedicato ad un'utenza sensibile lun mar mer gio ven sab dom 8:00 < 50 9'600 2'100 < 50 8'500 < 50 5'000 10:30 < 50 4'200 2'600 < 50 7' :00 < 50 < 50 3'000 < 50 4' :30 7'000 < 50 < 50 < < :00 4'500 < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 2'000 Il monitoraggio eseguito negli anni precedenti allo studio non aveva evidenziato il reperimento di Legionella nel reparto mentre è evidente che: 17 prelievi su 35 (49%) sono falsi negativi 14 prelievi su 35 (40%) indicano una contaminazione dell'ordine di 10 3 (soglia d'attenzione indicata dalle Linee Guida)

20 Punti di prelievo con filtro - Solo 2 punti sono risultati contaminati (uno con 2 valori positivi e l altro con 3) a causa di uno scorretto utilizzo dello strumento filtrante (l'integrità ed il corretto posizionamento sono fondamentali fattori di efficacia). - L efficacia dei filtri si è ulteriormente dimostrata nella loro successiva adozione nei punti che ne erano privi, tuttora monitorati.

21 L esperienza del Laboratorio alle terme Campioni esaminati: 35 - campioni positivi 14 (40%) Terme - Vasche di accumulo acqua termale 17 campioni UFC/l campioni Positivi: 6 (35%) Valore max: UFC/l Valore min: 90 UFC/l Negativi: 11 < > Lp7-14 Lp3 Lgor Non è mai stata reperita L. pneumophila sierogruppo 1

22 Terme - Impianti di distribuzione acqua termale 13 campioni UFC/l campioni Positivi: 7 (54%) Valore max: UFC/l Valore min: 100 UFC/l Negativi: 6 < > Lp1 Lp3 Terme - Apparecchi per inalazioni Su 5 campioni 1 è risultato positivo per L. pneumophila sierogruppo 5 (180 UFC/l)

23 L esperienza del Laboratorio negli studi odontoiatrici Studi odontoiatrici - Riuniti 57 campioni UFC/l campioni Positivi: 7 (12%) Valore max: UFC/l Valore min: 90 UFC/l Negativi: 50 < > Lp7-14 Lboz Lp6 Non è mai stata reperita L. pneumophila sierogruppo 1

24 Conclusioni - Sebbene le Linee Guida non suggeriscano alcuna verifica della contaminazione degli impianti in assenza di casi segnalati, la valenza positiva di tale verifica sarebbe la sensibilizzazione dei clinici nella ricerca attiva di eventuali casi. - L'adozione di programmi di monitoraggio degli impianti idrici e di condizionamento dovrebbe essere realizzata da Ospedali di qualità che desiderino offrire al cittadino garanzie di salvaguardia della salute pubblica, mostrando di predisporre strategie d'intervento nel controllo delle infezioni nosocomiali.

25 Fine