DEL BATTERIO Legionella. Laboratorio Sanità Pubblica ASL della Provincia di Mantova

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1 CARATTERISTICHE E ASPETTI DEL BATTERIO Legionella Dott. Attilio Bertolotti Laboratorio Sanità Pubblica ASL della Provincia di Mantova 1

2 Premessa Generalità Fattori di rischio Patogenicità Sistemi di controllo Prevenzione Campionamento Analisi 2

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6 Legionella 6

7 Legionella morfologia Bacillo Gram-negativo Aerobio Mobile Dimensioni variabili 1,5 5 µm 48 specie, 70 sierogruppi Legionella pneumophila 7

8 Le colorazioni Gram positivo 8

9 Le colorazioni Gram negativo 9

10 Legionellosi In Europa e in USA vengono infettate circa persone ogni anno riconducibili a viaggi e soggiorni alberghieri,infezioni nosocomiali Nel 2011 vi sono stati 4897 casi in Europa (UE) di malattia dei legionari con tasso di mortalità 10% 10

11 Diffusione Acqua superficiale e di falda Reti distribuzione Impianti idrici Impianti di climatizzazione Piscine Fontane Terreno umido 11

12 Riproduzione Tra i 25 C ei42 C in habitat acquatici caldi In ambiente naturale anche all interno di protozoi ciliati Nel biofilm degli impianti idrici 12

13 biofilm Legionella pneumonie è un batterio patogeno opportunistico; ti questo batterio utilizza il biofilm generato da altri microrganismi per proteggersi, nutrirsi e prolificarsi; approfitta poi, della presenza dei protozoi e delle amebe ancorate al biofilm per colonizzarne la struttura ed utilizzandoli quale veicolo di diffusione 13

14 Legionella in biofilm 14

15 Tetrahymena 15

16 Acathamoeba 16

17 Fattori di rischio e patogenicità Microrganismo Ospite Ambiente 17

18 Fattori di rischio e patogenicità Penetrazione nell ospite Entro l organismo Legionellosi: la malattia dei legionari, la febbre di Pontiac 18

19 Penetrazione nell ospite 19

20 Penetrazione nell ospite legionelle infettanti macrofagi 20

21 Riproduzione Ameba con legionella 21

22 Legionellosi la malattia dei legionari la febbre di Pontiac 22

23 Sistemi di controllo: la disinfezione Mezzi fisici Mezzi chimici 23

24 Disinfezione con mezzi fisici: Temperatura Radiazione UV Filtrazione 24

25 Disinfezione con mezzi chimici Agenti ossidanti Ipoclorito Biossido di cloro Clorammine Ozono Bromo Perossido di idrogeno Agenti non ossidanti Disinfettanti i ti organici i 25

26 Prevenzione e controllo della contaminazione del sistema idrico: metodi Quando? Commenti Ricerca della Legionella nell'impianto idrico Nelle strutture recettive: inpresenzadi1opiù casi Rischio elevato di infezioni nosocomiali nel caso in cui In ospedale: monitoraggio periodico nei reparti ad alto la concentrazione di legionelle sia 10 3 UFC/L rischio Trattamento termico: Aumento della T dell'acqua calda a C continuativamente per tre giorni consecutivi con scorrimento per 30 minuti al giorno (shock termico) oppure Mantenimento di una temperatura tra i C nella rete dell'acqua calda In caso di infezioni da Legionella sp. e in presenza di massiva contaminazione dell'impianto Quando si mette in funzione il sistema idrico Indispensabili controlli microbiologici, da ripetere periodicamente Controlli periodici della temperatura in punti periferici rappresentativi dell'impianto. Controlli microbiologici in presenza di uno o più casi Clorazione: In caso di infezioni da Legionella sp. e in presenza di Disinfezione sistemica, con una concentrazione Iperclorazione shock: immettere cloro nell'acqua fino ad ottenere concentrazioni di cl residuo di mg/l. Periodo di contatto: 2 ore con 20mg/L oppure 1 ora con 50mg/L. massiva contaminazione dell'impianto disinfettante residua. Azione corrosiva del cloro sulle tubature Minimizza la colonizzazione di legionella nei punti distali oppure Iperclorazione continua: aggiungere cloro in modo che la concentrazione residua sia compresa tra 1-3 mg/l. Raggi ultravioletti Misura di riserva applicabile in circostanze particolari Metodo relativamente costoso. I raggi UV hanno solo un effetto locale e sono possibili contaminazioni distali Ionizzazione rame/argento In presenza di contaminazione da Legionella sp nell'impianto idrico o come misura preventiva in alternativa alla disinfezione termica Facile applicazione e non influenzato dalla T dell'acqua Verificare che la concetrazione degli ioni Cu e Ag non superi la CMA prevista dalla legislazione vigente Perossido d idrogeno e argento stabilizzati In presenza di contaminazione da Legionella sp Tecnica recente che necessita di ulteriori conferme nell'impianto idrico o come misura preventiva in sperimentali alternativa alla disinfezione termica o con cloro. Biossido di cloro In presenza di contaminazione da Legionella sp nell'impianto i idricoi o come misura preventiva in alternativa alla disinfezione termica o all iperclorazione. Indicato per contrastare la crescita di biofilm Tecnica recente che necessita di ulteriori i conferme sperimentali 26

27 Prevenzione Linee guida ISS e EWGLI (European Working Group for Legionella Infections) Corretta progettazione reti idriche Accurata pulizia e disinfezione dei filtri dei condizionatori Accurata manutenzione Sostituzione tubature obsolete Decalcificazione i dei diffusori i delle docce Svuotamento e disinfezione dei serbatoi di accumulo Monitoraggio periodico della presenza di legionella negli impianti di climatizzazione 27

28 Procedure per il campionamento Impianti idrici (circuito acqua calda) Impianti idrici i i (circuito it acqua fredda) Impianti di climatizzazione Fontane Apparecchiature Docce 28

29 Modalità di prelievo Acqua Depositi Incrostazioni i Filtri 29

30 Legionella: dove campionare Nel corso degli ultimi tempi il nostro laboratorio ha isolato Legionelle da vari siti : alberghi, ospedali, case di riposo, abitazioni private, piccoli impianti i sportivi, i case di riabilitazione i e recupero sia dai punti terminali della rete di distribuzione dell acqua calda e fredda (docce, rubinetti), sia da serbatoi d accumulo, sia da incrostazioni e biofilm presenti nei bulbi e nei rompigetto. In ambiente ospedaliero e stata isolata anche da siti particolarmente a rischio come sale operatorie e reparti per dialisi 30

31 Legionella: cosa campionare acqua del circuito d acqua calda e fredda quando la temperatura è superiore ai 20 C, incrostazioni e biofilm da tubazioni, serbatoi, rompigetto dei rubinetti, bulbi doccia, rubinetti, doccette con tubi flessibili pendenti, depositi da serbatoi d accumulo accumulo, piscine (vasche e spogliatoi), acqua di condensa e filtri in impianti di condizionamento 31

32 Legionella: come campionare Tutti i campionamenti devono essere condotti in condizioni di sicurezza per gli Operatori che dovranno utilizzare i Dispositivi di Protezione Individuali previsti (guanti, maschere filtranti, occhiali protettivi). ACQUA: utilizzare bottiglie sterili con capacita minima i 1 litro, in polietilene (monouso) o in vetro ( autoclave per 15 a 120 C) utilizzare bottiglie incartate esternamente per prelievi ad immersione (es. piscine/serbatoi). In un sistema di distribuzione l acqua dovrà essere campionata nei punti distali della rete (rubinetti-docce) e nei serbatoi di accumulo e/o scambiatori di calore. La scelta dei punti e le tecniche di campionamento sono in funzione degli obiettivi dell indagine 32

33 Legionella: come campionare Pre-flush: un prelievo effettuato dal rubinetto appena aperto, senza scorrimento dell acqua e senza flambatura ( 2 litri) indicativo della contaminazione di quel tratto terminale Post-flush: un ulteriore successivo prelievo dopo aver allontanato parti mobili (rompigetto), pulito meccanicamente il punto di sbocco, flambato esternamente e aver fatto scorrere l acqua per almeno 5. Annotare la temperatura nel verbale di prelievo. Questo campionamento può essere indicativo di una colonizzazione all interno dell impianto Un prelievo misto raccogliendo nella stessa bottiglia una prima parte in pre-flush e una seconda in post-flush, (2 litri), rappresentativo di una realistica situazione all uso. Questo tipo di prelievo appare indicato per le verifiche post bonifica e per le indagini di valutazioni del rischio 33

34 Legionella: come campionare Rompigetto/incrostazioni/bulbi docce: se possibile asportare in modo asettico con strumenti idonei (spatole, pinzette, tamponi) e trasferire in contenitori sterili di adatte dimensioni con l aggiunta di alcuni ml di acqua distillata sterile. Altrimenti consegnare al laboratorio le parti intere avendo cura di lasciare all interno l acqua d origine, trasferendo in sacchetti sterili (tipo presto-chiuso per alimenti). Piscine, cisterne, serbatoi, pozzi : prelievo per immersione con bottiglie sterilizzate in apposite buste/carta autoclavabile. Tamponi: passare le superfici con un tampone sterile, con movimenti rotatori, ed inserirlo direttamente in provetta con terreno di mantenimento Filtri: asportare i filtri, soprattutto se umidi e non sostituiti di recente, inserendoli in sacchetti di plastica sterili, con l aggiunta di 5-10 ml di acqua distillata sterile. Acqua di condensa: prelevarne la massima quantità possibile con siringhe o pipette sterili. 34

35 Acqua fredda o calda Depositi in serbatoi Incrostazioni in tubature e depositi Tamponi effettuati su rubinetti rompi getto ecc. Acqua di condensa degli impianti da aria condizionata Filtri di impianti di alimentazione Acqua di sgocciolamento da torri di raffreddamento I campioni vanno conservati a temperatura ambiente, al riparo della luce ACQUA Da 1 a 5 litri raccolti in recipienti sterili. Se acqua clorata aggiungere tiosolfato di sodio al 10% (0,1 per 100 ml di acqua). Flambare il punto di prelievo, dopo aver fatto scorrere l acqua per almeno 5 minuti solo se si desidera esaminare l acqua dell intero impianto DEPOSITI INCROSTAZIONI Prelevare l acqua dallo scarico o quella dal fondo dopo averlo sufficientemente svuotato Raccogliere il materiale da tubi o serbatoi in recipienti sterili TAMPONI Raccogliere il materiale da superfici e trasferire i tamponi in apposite provette contenenti circa 5 ml di acqua dell impianto stesso FILTRI Depositarli in sacchetti di plastica 35

36 Dopo il prelievo Trasporto Tecniche analitiche 36

37 Conservazione, trasporto e consegna del campione al laboratorio, in tutte la fasi successive al prelievo, il campione deve essere mantenuto in condizioni tali da prevenirne l alterazione o comunque da potere influire sui risultati ti del processo analitico. Consegnare il campione al laboratorio nel più breve tempo possibile, preferibilmente entro le 24 ore e comunque non oltre le 48 ore dal campionamento. Se la consegna avviene entro le 24 ore dal campionamento, il trasporto del campione deve avvenire, fino alla consegna in laboratorio, a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Se la consegna avviene tra le ore dal campionamento il trasporto del campione deve avvenire, fino alla consegna in laboratorio, a temperatura di 5 ± 3 C e sempre al riparo dalla luce. In questo caso il campione di acqua calda deve essere raffreddato direttamente dopo il prelievo 37

38 Legionella: analisi microbiologica 2 litri è, in genere, la quantità minima da filtrare; quantità maggiori possono essere utilizzate e possono richiedere l utilizzo di più membrane. Terminata la filtrazione la membrana viene posta in un contenitore sterile di idonee dimensioni contenente da 5 a 10 ml di acqua campione o di diluente al fine del distacco e della omogenizzazione dei microrganismi che vi sono rimasti trattenuti, che avviene con una energica agitazione passando al vortex per non meno di due minuti (metodo nazionale standard). Il campione cosi ottenuto rappresenta il concentrato da utilizzare per l inoculo. Questa fase e forse la più critica di tutto il processo e può influire in maniera significativa sulla percentuale di recupero delle cellule batteriche. 38

39 Legionella: analisi microbiologica Semina su terreni di coltura: aliquote da 0,1 a 0,5 ml sono inoculate su piastre di terreno di coltura selettivo MWY o GVPC (29) distribuendo sulla superficie in maniera omogenea con una spatola sterile oppure direttamente la membrana filtrante se utilizzata tecnica ISO Incubazione delle piastre a (36 1) C in termostato, in ambiente umido 39

40 Legionella: analisi microbiologica Lettura con identificazione presuntiva: le colonie di Legionella in genere non crescono prima di 3 gg di incubazione su terreno selettivo; si presentano di piccole dimensioni, di colore bianco grigio, leggermente convesse, con margini regolari, e soprattutto evidenziano i il tipico i aspetto a vetro smerigliato quando osservate allo stereo microscopio con luce laterale a bassa intensità. La lettura va eseguita ad intervalli di 2-3 gg, fino al decimo giorno di incubazione. Le colonie con queste caratteristiche sono considerate sospette e vanno trasferite sia su BCYE- agar base (o Agar Sangue/MK) sia su BCYE+ con supplemento (cisteina e ferro) per la crescita differenziale, incubandole per h a 36 C. 40

41 La presenza di crescita sul terreno con cisteina e l assenza di crescita sul terreno colturale che ne è privo consentono di identificare il microrganismo isolato come PRESUNTA LEGIONELLA CONFERMA: test di agglutinazione 41

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