TERRENI DI COLTURA E SUPPLEMENTI PER LEGIONELLA LEGIONELLA BCYE AGAR BASE

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1 N B I 8 5/2011 pag. 1 di 5 TERRENI DI COLTURA E SUPPLEMENTI PER LEGIONELLA LEGIONELLA BCYE AGAR BASE LEGIONELLA BCYE -GROWTH SUPPLEMENT LEGIONELLA BCYE -GROWTH SUPPLEMENT W/O CYSTEINE LEGIONELLA GVPC SELECTIVE SUPPLEMENT LEGIONELLA MWY SELECTIVE SUPPLEMENT LEGIONELLA BMPA SELECTIVE SUPPLEMENT Terreno di base in polvere e pronto per l uso in flacone, supplementi di crescita e supplementi selettivi per l isolamento di spp. LEGIONELLA BCYE AGAR BASE FORMULA TIPICA (g per litro) Carbone attivo 2,0 Estratto di lievito 10,0 Agar 13,0 LEGIONELLA BCYE GROWTH SUPPLEMENT Tampone ACES /Potassio idrossido 6,4 g Pirofosfato ferrico 125 mg L-Cisteina HCl 200 mg Acido alfa-chetoglutarico 0,5 g LEGIONELLA BCYE GROWTH SUPPLEMENT W/O CYSTEINE FORMULA (per fiala da 500 ml) Tampone ACES /Potassio idrossido 6,4 g Pirofosfato ferrico 125 mg Acido alfa-chetoglutarico 0,5 g LEGIONELLA GVPC SELECTIVE SUPPLEMENT FORMULA (per fiala da 500 ml) Glicina 1,5 g Vancomicina 0,5 mg UI Cicloeximide 40 mg LEGIONELLA MWY SELECTIVE SUPPLEMENT Glicina 1,5 g Vancomicina 0,5 mg 3,2 mg Natamicina 100 mg Bromotimolo blu Bromocresolo porpora LEGIONELLA BMPA SELECTIVE SUPPLEMENT Cefamandolo 2,0 mg Natamicina 100 mg PREPARAZIONE DEI TERRENI IN POLVERE Sciogliere 12,5 g di BCYE Agar Base (cod ) in 450 ml di acqua distillata fredda. Portare delicatamente ad ebollizione sotto agitazione fino a dissoluzione completa del terreno. Autoclavare a 121 C quindi raffreddare a C ed aggiungere: TERRENO SELETTIVO PER L ISOLAMENTO: BCYE- GVPC * il contenuto di un flacone di BCYE -Growth Supplement (cod ) ricostituito secondo le * il contenuto di un flacone di GVPC Selective Supplement (cod ) ricostituito secondo le TERRENO SELETTIVO PER L ISOLAMENTO: BCYE- MWP * il contenuto di un flacone di BCYE -Growth Supplement (cod ) ricostituito secondo le

2 N B I 8 5/2011 pag. 2 di 5 * il contenuto di un flacone di MWY Selective Supplement (cod. 42ISLG2-A), ricostituito secondo le indicazioni riportate sui flaconi. TERRENO SELETTIVO PER L ISOLAMENTO BCYE-BMPA * il contenuto di un flacone di BCYE -Growth Supplement (cod ) ricostituito secondo le * il contenuto di un flacone di BMPA Selective Supplement (cod. 42ISLG3-A), ricostituito secondo le indicazioni riportate sui flaconi. TERRENO NON SELETTIVO COMPLETO DI CISTEINA PER LA PROVA DI CONFERMA: BCYE * il contenuto di un flacone di BCYE -Growth Supplement (cod ) ricostituito secondo le TERRENO NON SELETTIVO PRIVO DI CISTEINA PER LA PROVA DI CONFERMA: BCYE W/O CYSTEINE * il contenuto di un flacone di BCYE -Growth Supplement w/o Cysteine (cod ) ricostituito secondo le Mantenendo il terreno sotto agitazione, distribuire in piastre Petri sterili. Il terreno appare omogeneamente opaco di colore nero. Il ph dei terreni così preparati deve essere 6,9 ± 0,1 PREPARAZIONE DEL TERRENO PRONTO ALL USO IN FLACONE In un bagnomaria termoregolato a 100 C introdurre i flaconi richiesti e riscaldare fino ad ebollizione ed a dissoluzione completa. Raffreddare a C, addizionare i supplementi richiesti come indicato nel capito precedente frazionando il contenuto delle fiale dei supplementi. Miscelare bene e versare in piastre sterili. INTRODUZIONE Le Legionelle sono bacilli Gram-negativi aerobi obbligati non fermentanti, mobili per uno o più flagelli sia laterali sia polari, generalmente delle dimensioni di 1,5-5 per 0,3-0,9 µm, ma che possono presentare anche forme filamentose. Sono microrganismi difficilmente coltivabili che richiedono terreni contenenti L-cisteina, sali di ferro, carbone attivo ed estratto di lievito e che possono essere resi selettivi mediante l aggiunta di antibiotici ed antimicotici. Le Legionelle sono sempre state isolate in ambiente umido e mai in ambiente secco. Sono associate all acqua superficiale, termale e a quella delle apparecchiature dell aria condizionata, ma sono state comunque riscontrate anche nell acqua potabile in modo particolare in quella di rubinetti, docce e nebulizzatori di ambienti ospedalieri. Legionelle sono state isolate da campioni di masse d acqua (laghi, fiumi, corsi d acqua, acque termali) e di acque stagnanti a temperature comprese fra 5,7 C e 63 C e a ph compresi tra 5,4 e 8,1. Esistono prove sicure che pneumophila ha la capacità di moltiplicarsi nell acqua (specialmente in quella calda) dei sistemi di distribuzione dell acqua potabile, sia di grandi dimensioni (a livello di ospedali, alberghi, ecc.) sia di piccole dimensioni (a livello di case private). Le sezioni caldo-umide dei sistemi di raffreddamento per il condizionamento dell aria e gli umidificatori dell aria stessa nei sistemi di ventilazione costituiscono una nicchia ecologica rilevante quali veicoli di diffusione di spp Alcune epidemie di legionellosi sono state imputate all utilizzo di acqua riscaldata, contaminata da pneumophila in vasche da idromassaggio e/o piscine. Legionellosi è la definizione di tutte le forme morbose causate da batteri Gram-negativi aerobi del genere. Essa si può manifestare sia in forma di polmonite, sia in forma febbrile extrapolmonare o in forma subclinica. La specie più frequentemente coinvolta in casi umani è pneumophila. Oltre a L. pneumophila, di cui si conoscono 15 sierogruppi differenti, sono state isolate altre specie di nel corso di infezioni nell uomo, quali L. micdadei e L. feeleii (entrambe responsabili di casi sporadici di pneumopatia acuta), L. bozemanii, L. jordanis e L. hackeliae (tutte responsabili, probabilmente, sia di casi di pneumopatia sia di febbre di Pontiac) La coltura è la tecnica di riferimento per la diagnosi di laboratorio, possiede specificità del 100 % ed una sensibilità variabile con le caratteristiche del campione studiato e con le procedure adottate. Infatti la carica batterica è spesso minima, l eventuale flora batterica contaminante può mascherare la presenza di, la selettività dei terreni può ostacolare la crescita di alcune specie. Sono consigliabili per un esecuzione ottimale sia l uso di terreni selettivi che non selettivi, il pretrattamento per campioni contaminati e una minima diluizione che serve per allontanare sostanze inibenti la crescita. Per quanto riguarda la diluizione va ricordato che la soluzione fisiologica può inibire lo sviluppo di. I terreni selettivi raccomandati per la ricerca di in campioni clinici ed ambientali sono quelli che impiegano i supplementi selettivi GVPC o MWY.

3 N B I 8 5/2011 pag. 3 di 5 PROCEDURE Procedura per la coltura su materiali non contaminati (aspirato transcricotiroideo, spazzolato bronchiale protetto, omogenato da biopsia polmonare ) : 1. diluire 1:5 in Mueller Hinton Broth 2. vortexare per 5-10 secondi e seminare 0,1 ml su BCYE selettivo e su BCYE non selettivo. Procedura per la coltura su materiali potenzialmente contaminati (espettorato, aspirato bronchiale, broncolavaggio alveolare ) : 1. non utilizzare gli usuali criteri microscopici di valutazione dell idoneità dell espettorato alla coltura ed analizzare sempre il campione 2. diluire 1 :10 espettorato o aspirato tracheale in Mueller Hinton Broth. Il broncolavaggio alveolare va prima centrifugato a 1500 g per 15 minuti e si utilizzano i residui 2 ml dopo risospensione con vortex. 3. vortexare per 5-10 secondi e seminare 0,1 ml su BCYE non selettivo, su BCYE selettivo. 4. ripetere le stesse procedure di diluizione e agitazione con Vortex con la soluzione acida a ph 2,2 e seminare le stesse piastre Procedura per campioni ambientali (acqua, incrostazioni, filtri da impianti di condizionamento ecc.) Seminare 0,1 ml di campione tal quale e 0,1 ml di campione trattato con acidi o a caldo, in doppio su terreno selettivo. Trattamento acido: 1. Centrifugare 10 ml di campione a 3000 r.p.m. per 20 minuti ed asportare il sovranatante lasciandone circa 1 ml. 2. Al sedimento aggiungere 9 ml di tampone HCl-KCl ph 2,2, agitare delicatamente e lasciare a temperatura ambiente per 5 minuti. Tampone HCl-KCl ph 2,2: 3,9 ml di HCl 0,2M + 25 ml di KCl 0,2 M - Aggiustare a ph 2,2 con KOH 1M. Trattamento a caldo: Incubare 10 ml di campione a 50 C per 30 minuti. Tempi e ambiente di incubazione incubare a C in atmosfera <5% di CO 2 (il CO 2 è tossico per concentrazioni > 5%; piuttosto che concentrazioni di CO 2 5% meglio incubare in aria) e con umidità elevata. Se si utilizza un termostato a CO 2 verificare l acqua nella vaschetta, se si utilizza una giara creare umidità con una provetta aperta di acqua distillata; in alternativa chiudere le piastre in buste di plastica per evitarne l essiccamento. Leggere giornalmente e protrarre l osservazione fino a 10 giorni prima di considerare negativa la coltura. Per analisi di campioni di acque in regime di accreditamento, seguire le istruzioni delle norme ISO applicabili (ISO ed ISO ). INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Le colonie di appaiono rotonde con bordi interi, lucenti, bombate con diametro da 1 a 4 mm. Generalmente e soprattutto nei primi 2 giorni di incubazione il bordo mostra una iridescenza rosa o blu- verde mentre il centro è grigio opalescente con un aspetto simile al vetro tagliato. Osservate sotto lampada UV (366 nm), alcune specie mostrano un autofluorescenza blu-bianca, altre un autofluorescenza rosso vivo. L.pneumphila e le legionelle comuni, normalmente non mostrano autofluorescenza. Con il prolungamento del tempo d incubazione, le colonie diventano più larghe, il centro assume un colore bianco crema e perdono gran parte della loro iridescenza. Una caratteristica comune alle colonie di è la difficoltà a prelevarle con l ansa dalla superficie dell agar. TEST DI CONFERMA Un primo criterio per differenziare le colonie di è costituito dalla loro incapacità di crescere, con rare eccezioni, su terreno BCYE privo di cisteina o su agar-sangue. Le colonie coltivate sui terreni selettivi (almeno 3-5 colonie per piastra) devono quindi essere trapiantate sulle seguenti piastre : Terreno non selettivo BCYE completo (preparato come sopra descritto) Terreno non selettivo BCYE senza cisteina (preparato come sopra descritto) Incubare detti terreni a 36 C ± 2 C per 2 giorni Le colonie che crescono su terreno non selettivo BCYE completo e non crescono su terreno non selettivo BCYE senza cisteina sono da considerare come appartenenti al genere. Su tali colonie eseguire una colorazione Gram modificata, utilizzando come colorante di contrasto la fucsina basica della colorazione Ziehl Neelsen: Crystal Violet (17PL7000) Soluzione di Lugol (17PL7052) Ziehl Neelsen Carbol Fucsina (17PL7018)

4 N B I 8 5/2011 pag. 4 di 5 TEST DI IDENTIFICAZIONE Eseguire il test DFA per la conferma di, utilizzando anticorpi monoclonali polivalenti (sierogruppi 1-14) coniugati con fluoresceina (Prolab cat. n 17PL242). L impiego di anticorpi monoclonali assicura una sensibilità ed una specificità elevatissime. In caso di risposta positiva eseguire la determinazione del sierogruppo 1 con lo specifico anticorpo monoclonale coniugato con fluoresceina ( test DFA Prolab cat n 17PL241) o se necessario la sierotipizzazione con i singoli anticorpi monovalenti per i sierogruppi dal 1 al 14 (Prolab cat. n 17PL205-17PL283). Nel caso si desideri utilizzare la tecnica di agglutinazione su vetrino eseguire sulle colonie sospette il test al latice per il sierogruppo 1 (Prolab cat.n 17PL226 Latex Test con anticorpi monoclonali.) NOTE E consigliabile l utilizzo di piastre con terreno selettivo e non selettivo. I terreni di coltura qui descritti sono impiegati per l isolamento e l identificazione presuntiva di ; è suggerita l esecuzione degli appropriati test per un identificazione completa. Quando si manipolano campioni in cui si sospetta la presenza di evitare la formazione di aerosol, pulire e disinfettare l area di lavoro. Criteri di identificazione di (*) pneumophila bozemanii micdadei dumoffii gormanii lonbeachae. jordanis BCYE agar (crescita) Terreno senza cisteina o Agar sangue Fluorescenza 366 nm Ossidasi ± Catalasi Ureasi Gelatinasi β-lattamasi + ± ± + Idrolisi ippurato (*) Regione Lombardia Direzione Generale della Sanità, Servizio Prevenzione Sanitaria. Sorveglianza e Controllo delle legionellosi, 5 Novembre CONTROLLO QUALITÀ DELL UTILIZZATORE (TERRENI SELETTIVI) Microrganismo Incubazione Risultati L.pneumphila ATCC ore 35 C, aerobiosi crescita, colonie bianco-grigie/blu-grigie CONSERVAZIONE Terreno in polvere: conservare a C al riparo della luce, in luogo asciutto. In queste condizioni il terreno è valido fino alla data di scadenza indicata in etichetta. Non utilizzare oltre questa data. Una volta aperto, conservare il prodotto mantenendo il tappo del contenitore ben chiuso. Eliminare se vi sono segni evidenti di deterioramento della polvere (modifiche del colore, indurimento della polvere ecc.). Conservare le piastre preparate in laboratorio per un massimo di 7 giorni a 2-8 C. Supplementi: conservare il supplemento fino alla data di scadenza indicata sull etichetta, a 2-8 C. Terreno pronto in flacone e piastre pronte: conservare a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. PRECAUZIONI E SICUREZZA DEGLI OPERATORI Terreno in polvere: il preparato qui descritto non è classificato come pericoloso ai sensi della legislazione vigente né contiene sostanze pericolose in concentrazioni 1%. Come per tutti i terreni in polvere anche la manipolazione di questo terreno deve essere effettuata con una adeguata protezione delle vie respiratorie. Supplementi: BCYE -Growth Supplement e BCYE -Growth Supplement non sono classificati come pericolosi ai sensi della legislazione vigente né contengono sostanze pericolose in concentrazioni 1%. GVPC Selective Supplement contiene cicloeximide ed è classificato come T (tossico) ai sensi della legislazione vigente. Consultare la scheda di sicurezza prima dell impiego. Piastre pronte e flaconi all uso: i preparati qui descritti non sono classificati come pericolosi ai sensi della legislazione vigente né contengono sostanze pericolose in concentrazioni 1%. I prodotti qui descritti sono per uso diagnostico in vitro e devono essere usati in laboratorio, da operatori adeguatamente addestrati, con metodi approvati di asepsi e di sicurezza nei confronti degli agenti patogeni. Sterilizzare le piastre dopo il loro uso e prima dell eliminazione come rifiuto.

5 N B I 8 5/2011 pag. 5 di 5 BIBLIOGRAFIA Balows at al. ( 1991) Manual of Clinical Microbiology. ASM, Washington, D.C. BSI Document 85/53406 Dennis, P.J.L. et al. (1988) A Laboratory Manual of. Edelstein, P.H. (1982) J.Clin.Microbiol. 16, 697 Edelstein, P.H. et al. (1981) J.Clin.Microbiol. 14, 298. Feeley J. et al (1978) J.Clin.Microbiol. 8, 320 Feeley J. et al (1979) J.Clin.Microbiol. 10, 437. ISO 11731: 1998 Water quality Detection and enumeration of. ISO : 2004 Water quality Detection and enumeration of Part 2 Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts. Pasculle et al. (1980) J. Inf. Dis. 141, 727 Regione Lombardia Direzione Generale della Sanità, Servizio Prevenzione Sanitaria. Sorveglianza e Controllo delle legionellosi, 5 Novembre Wadoswsky et al. (1981) Appl.Envir. Microbiol. 42, 768 CONFEZIONI TERRENO DI BASE IN POLVERE LEGIONELLA BCYE AGAR BASE 500 g (20 l) CODICE CND W TERRENO DI BASE PRONTO IN FLACONE LEGIONELLA BCYE AGAR BASE 6 flaconi da 180 ml LEGIONELLA BCYE AGAR BASE 6 flaconi da 90 ml CODICE CND W SUPPLEMENTI DI CRESCITA LEG. BCYE GROWTH SUPPLEMENT 4 fiale ciascuna per 500 ml di terreno LEG.BCYE GROWTH SUPPL. W/O CYTEINE 4 fiale ciascuna per 500 ml di terreno CODICE CND W SUPPLEMENTI SELETTIVI LEGIONELLA GVPC SEL. SUPPL. 4 fiale, ciascuna per 500 ml di terreno 42ISLG2-A LEGIONELLA MWY SEL. SUPPL. 10 fiale, ciascuna per 500 ml di terreno * 42ISLG3-A LEGIONELLA BMPA SEL. SUPPL. 10 fiale, ciascuna per 500 ml di terreno * CODICE CND W PIASTRE PRONTE ALL USO LEGIONELLA SELECTIVE AGAR (GVPC) 20 piastre LEGIONELLA AGAR 20 piastre LEGIONELLA AGAR W/O CYSTEINE 20 piastre CODICE CND W * MWY e BMPA : Produttore : Abteck (UK) IVD