Doping ematico: passato, presente e futuro

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1 SPORT SICURO? Fossano, 22 settembre 2012 Doping ematico: passato, presente e futuro Dr. Paolo Borrione Università degli Studi di Roma Foro Italico CCA-CONI NADO Centro Regionale Antidoping e di Tossicologia A. Bertinaria

2 TECNICHE PER AUMENTARE IL TRASPORTO E/O LA CESSIONE DI OSSIGENO AI TESSUTI

3 EMOGLOBINA (HB) L emoglobina è una proteina tetramerica (α 2 β 2 ) di circa Dalton presente negli eritrociti. Funzione:legareO 2 etrasportarlodaipolmoniaitessuti.

4 EMOGLOBINA L emoglobina deve legare efficientemente l ossigeno alla pressione parziale presente nei polmoni (~100 mm di Hg) e cederne una frazione apprezzabile nei tessuti in condizioni di pressione parziale di ~30 mm di Hg. Questo fa si che presenti una curva di saturazione sigmoide: a basse P O2 si ha una bassa affinità (legame debole) e ad alte P O2 una elevata affinità(legame forte).

5 EMOGLOBINA (HB) Il grafico di Hill evidenzia come l Hb abbia un comportamento allosterico: l occupazione di uno dei siti di legame da parte di O 2 aumenta l affinità per O 2 dei siti ancora liberi. C è una comunicazione tra i siti di legame. Ne risulta una curva sigmoide (mentre il grafico della Mioglobina è una retta in quanto non lega O 2 in modo cooperativo)

6 EMOTRASFUSIONE Esistono due tipi di trasfusione: - omologa: gli eritrociti di un donatore compatibile vengono prelevati, concentrati e trasfusi nell atleta prima della competizione - autologa: l atleta preleva i suoi stessi eritrociti (generalmente un mese prima della competizione) e li re-introduce poco prima della gara. Quando i globuli rossi vengono introdotti nell organismo dell atleta ecco che aumenta notevolmente la quantità di ossigeno nel sangue. Rilascio di ossigeno ai tessuti = output cardiaco x contenuto arterioso di ossigeno Contenuto arterioso di ossigeno = Hbx %saturazionex 1.34

7 EMOTRASFUSIONE: RISCHI -Incompatibilità: Allo -Reazioni febbrili: Auto, Allo -Trasmissione di infezioni: -Sovraccarico del circolo: Auto, Allo -Tromboflebiti: Auto, Allo dal donatore Allo da contaminazione Auto, Allo -Per trasfusioni di grandi volumi: Ipotermia Intossicazione da citrato Diluizione fattori della coagulazione Microaggregati

8 EMOSOSTITUTI: HBOCs HBOCs: Hemoglobin Based Oxygen Carriers L Hb può essere facilmente estratta dai globuli rossi ma se inserita nel corpo come tale e causa tossicità. HBOCs sono ottenuti attraverso una sterilizzazione chimica dell Hb estratta da diverse fonti (bovina, ricombinante umana, transgenica umana,da cadavere donatore).

9 HBOCs Tramite cross-link biotecnologico, modificazioni ricombinanti, microincapsulazioni, l Hb viene stabilizzata e si producono diversi emosostituti che hanno diversi impieghi clinici.

10 HBOCs Tre tipi di HBOCs sono attualmente in stadi avanzati di test: una soluzione derivata dall Hb bovina e due dall Hb umana. Sono stati messi a punto come agenti terapeutici trasportanti O 2 da utilizzare in chirurgia e in caso di emergenza al posto delle trasfusioni. Ovviamente questi agenti emosostituti possono aiutare gli atleti d elite a migliorare le loro performance atletiche e quindi possono essere un potenziale target per il doping.

11 Proprietà Sangue HBOCs Aumento volume Si Si Trasporto O2 Si Si Vita terapeutica 1-2 mesi 1-2 giorni Conservazione 1 mese 6-24 mesi Alterazioni nella Conservazione Si No Tipo specifico Si No Inattivazione virale No Si Dimensioni Grande Piccola Viscosità Alta Bassa

12 HBOCs: RISCHI - Infezioni - Immunomodulazione - Ipertensione polmonare - Vasocostrizione - Tossicità d organo (disfunzioni renali) - Danni ossidativi - Attivazione delle PLTS

13 EMOSOSTITUTI: PERFLUOROCARBONATI (PFCs)

14 PERFLUOROCARBONATI PFCs sono idrocarburi che, al posto degli idrogeni, hanno la fluorina. Sono liquidi chimicamente inerti, insolubili in acqua. Gli atomi di fluorina fanno si che i PFTs abbiano poche interazioni intramolecolari e una ridotta tensione di superficie. Questo fa si che siano degli eccellenti solventi per gas. PFCs sono stati proposti come trasportatori di O 2 nel 1966 quando si è dimostrata la capacità di questi fluidi di sostenere la vita animale facendogli respirare dei liquidi.

15 PERFLUOROCARBONATI Le emulsioni di PFCs sono tra le sostanze terapeutiche trasportanti O 2 più utilizzate sul mercato. Si compongono di PFCs emulsionati con acqua e sali. Hanno la proprietà di dissolvere significative quantità di diversi gas, tra cui appunto l ossigeno. E possibile generare delle emulsioni stabili di PFCs con particelle molto piccole(diametro medio<0.2 µm)

16 Le caratteristiche di trasporto dell O 2 dei PFCs sono profondamente diverse da quelle del sangue. Il sangue presenta una curva di dissociazione sigmoidale, i PFCs lineare. Ciò comporta che siano necessarie elevate po 2 arteriose per massimizzareiltrasportodio 2 deipfcs. Figure 1. Comparison of oxygen capacity of whole blood, HBOC, soluble unmodified human Hb at 7 g/l (dotted line), and two PFC blood substitutes vs oxygen tension. Adapted from Winslow RM. In: Nance SJ, ed. Blood safety: current challenges. Bethesda, MD: American Association of Blood Banks, 1992:

17 PFCs: LIMITAZIONI La quantità di ossigeno che i PFC dissolvono, e quindi trasportanoèdirettamentecorrelataallapressioneparzialedio 2. Quantità clinicamente significative di O2 possono essere trasportate solo se la pressione parziale è particolarmente elevata. Da ciò deriva una difficile applicazione nello sport. Inoltre la prolungata respirazione di O 2 ad alte concentrazioni risulterebbe tossica.

18 ERITROPOIETINA (EPO) L EPOèunaglicoproteinadi166aa,dalpesodi30.4kDa. Funzione: stimola la produzione di globuli rossi. Vienesintetizzataper80%dallapartecorticaledelreneeperil20%dal fegato, la sua produzione è regolata dal livello di ossigenazione dei tessuti(aumenta in caso di ipossia) Emivita plasmatica: 4-13 ore La segnalazione di EPO è attivata da un recettore omodimerico: EPO-R.

19 ERITROPOIETINA (EPO) L'eritropoietina, pur non essendo l'unico fattore di crescita responsabile dell'eritropoiesi, rappresenta il più importante regolatore della proliferazione dei progenitori eritroidi; interagendo con recettori specifici presenti sulle cellule Burst- forming unit - erytroid (BFU-E) e sulle cellule Colony - forming unit - erythroid (CFU-E) ne prolunga la sopravvivenza e ne promuove la maturazione terminale. BFU-Es: pochi EPO-Rs, azione mitogena CFU-Es: maggiore quantità di EPO-Rs, azione di mantenimento vitalità durante differenziamento Il numero di EPO-Rs diminuisce gradualmente durante i successivi stadi maturativi della linea eritroide. Reticolociti ed eritrociti maturi: pochi EPO-Rs

20 ERITROPOIETINA (EPO) L espressione di EPO viene indotta da HIF (Hypoxia-Inducible Transcription Factors) che è un dimero composto dalle subunità α e β. L attività di HIF è regolata negativamente dalle Prolyl- Hydroxylases(HIF-PH) Normossia: HIF-α è instabile e viene degradato dalle prolil-idrossilasi Ipossia: le prolil-idrossilasi sono inattive, pertanto HIF-α non viene degradataepuòlegarehif-βeregolareigenibersaglio,tracuiepo

21 STIMOLANTI ERITROPOIESI: rhuepo Olimpiadi 2012: l atleta Alex Schwarzer è stato trovato positivo all EPO.

22 rhuepo Lo sviluppo delle tecnologie ricombinanti ha permesso di produrre EPO su larga scala. Esistono tre tipo di rhuepo: -rhuepo-α -rhuepo-β -rhuepo-ω Poche differenze strutturali, effetti simili minor quantità di legami O2 zuccheri, minor acidità, diversa idrofilicità rispetto alle altre due Approvata come prodotto farmaceutico per il trattamento di: anemie da malattie renali, chemioterapia, AIDS. Modalità somministrazione: iniezioni endovenose o sottocutanee Effetti: incrementa l ematocrito per 6 settimane o più

23 rhuepo: RISCHI crampi, infezioni vie respiratorie superiori, mal di testa, iperviscosità del sangue Tendenza alla trombofilia, indipendente dal valore di ematocrito (aumento viscosità, aumento conta piastrinica, inibizione dei fattori della coagulazione del sangue, per esempio la proteina S). Anche con ematocrito basso si potrebbero verificare dei trombi. Tendenza alla trombofilia, dipendente dal valore dell'ematocrito. Potenziale incremento delle resistenze vascolari nelle zone profonde del cervello, con possibile invecchiamento precoce delle strutture Ipertensione, con conseguente sclerosi vascolare (nei diversi distretti ed organi corporei, come fegato, reni e polmoni), accresciuto rischio di infarto e encefalopatia ipertensiva Convulsioni Leucoencefalopatia(modificazioni della sostanza bianca cerebrale) Lungo termine: aplasia pura della serie rossa, si formano degli Ab contro rhuepo che sono in grado di neutralizzare anche l EPO nativa; assenza di precursori della serie rossa nel midollo.

24 STIMOLANTI ERITROPOIESI: NESP Darbepoietina-α o NESP: Novel Erythropoiesis-Stimulating Protein Proteina sintetica analoga di EPO iperglicosilata (differiscono per 5aa): contiene 5 catene oligosaccaridiche N-linked, ovvero 2 in più rispetto all EPO, e contiene 22 residui di acido sialico contro i 14 dell EPO nativa. NESP lega EPO-R allo stesso modo di EPO inducendo la stessa segnalazione intracellulare. Maggiore emivita rispetto all EPO e maggiore attività biologica (bastano quindi dosi minori per avere lo stesso effetto) Modalità somministrazione: iniezioni endovenose o sottocutanee Effetti collaterali: simili a quelli riscontrabili con l rhuepo

25 STIMOLANTI ERITROPOIESI: CERA CERA: Continuous Erythropoietin Receptor Activator Proteina sintetica utilizzata dal 2007 per curare pazienti affetti da insufficienza renale. Nel 2008 diventa famosa nelle cronache sportive perché assunta da alcuni ciclisti come doping

26 CERA Maggiore emivita rispetto all EPO e maggiore attività biologica in vivo La maggior attività di questa molecola non è dovuta solo all estesa emivita ma anche ad una diversa cinetica di attivazione del recettore EPO-R: CERA è in grado di legarsi e dissociarsi da EPO-R, attivando più volte il recettore. Maggior stimolatore dell eritropoiesi, sia in magnitudine che in durata, in confronto all rhuepo standard Modalità somministrazione: iniezioni endovenose o sottocutanee Effetti collaterali: simili a quelli riscontrabili con l rhuepo

27 STIMOLANTI ERITROPOIESI: HEMATIDE Peptide sintetico EPO-mimetico peghilato stimolante l eritropoiesi. E in fase di sperimentazione per il trattamento delle anemie. Hematide comprende un peptide dimerico, non in relazione con la sequenza dell EPO nativa o ricombinante, in grado di legare EPO-R. Maggior emivita e clearance ridotta rispetto alle altre EPO ricombinati. Studi clinici dimostrano che Hematide è in grado di provocare un significativo e duraturo aumento dei livelli di emoglobina. Può essere somministrato una volta al mese senza rischi di PRCA (Pure Red Cell Aplasia) Facilità nel trasporto(è stabile a temperatura ambiente)

28 STIMOLANTI ERITROPOIESI: DOPING GENETICO Attualmente alcuni sistemi basati sui vettori virali sono in grado di garantire un espressione transgenica stabile in diversi tipi cellulari e tessuti. In campo ematologico la trasfezione di geni codificanti per EPO nel corpo degli atleti (al fine di aumentare il numero di eritrociti) potrebbe diffondersi come pratica dopante nel prossimo futuro. In modelli animali si è osservato che l espressione stabile e duratura del gene EPO aumenta la sintesi di eritrociti e corrisponde al alti livelli di ematocrito in topo e scimmia. Con le attuali metodologie antidoping non sarebbe possibile individuare la presenza di un gene EPO trasfettato in un atleta.

29 REGOLAZIONE GENICA Agenti che stabilizzano HIF L attività di HIF è regolata negativamente da Prolyl-Hydroxylases (HIF- PH) Sono in via di sviluppo delle piccole molecole capaci di inibire HIF-PH. Due di queste (FG-2216 e FG-4592) sembrano essere ben tollerate instudidifaseiproduconounaumentodeilivellidihb. Queste molecole hanno il vantaggio di poter essere somministrate oralmente e hanno bassi costi, inoltre stimolano un eritropoiesi completa. Manipolazione biochimica e genetica di HIF: promettente approccio terapeutico per patologie caratterizzate da un alterazione del metabolismo dell O 2 (quali cancro, infiammazione, infarto miocardio) ma potenziale target per il doping ematico.

30 STIMOLANTI ERITROPOIESI: REGOLAZIONE GENICA Agenti che stabilizzano HIF - Cloruro di Cobalto (utilizzato a partire dal medioevo, attualmente non si usa più per la sia tossicità): composto solubile in acqua, tradizionalmente usato per trattare le anemie. Induce una risposta simile all ipossia anche se il preciso meccanismo d azione non è conosciuto: probabilmente aumentalacapacitàdihif-1αdilegareildna. Risultato: aumentata produzione di EPO e stimolazione dell eritropoiesi.

31 MODULATORI ALLOSTERICI dell EMOGLOBINA RSR13 e RSR4 sono dei modulatori allosterici sintetici dell Hb, sono analoghi dei farmaci antilipidemici clofibrato e bezofibrato. RSR13 è attualmente in studio in un trial clinico di fase III come agente radioenhancing. RSR13 è in grado di aumentare l uptake massimo di ossigeno (VO 2 max) in un modello canino. Questo fa si che sia un potenziale agente che migliora le performance per gli atleti di resistenza (poiché VO 2 max è un indice di capacità aerobica)

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