Corso di Biologia Molecolare I. Elia Ranzato Tel:

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1 Corso di Biologia Molecolare I Elia Ranzato ranzato@unipmn.it Tel:

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4 Il campo della biologia molecolare si interseca anche con altre discipline non biologiche: per esempio con l'informatica per l'elaborazione dell'enorme mole di dati che vengono prodotti con tecniche ad high-throughput o con la fisica nello studio delle biomolecole a livello di struttura tridimensionale (biologia strutturale)

5 Definizioni Acidi nucleici: molecole che codificano l informazione genetica. DNA, RNA Gene: segmento di DNA che codifica per una catena polipeptidica Genoma: insieme delle sequenze di DNA di un organismo

6 Biologia Molecolare In che modo viene conservato il materiale genetico? Come viene decodificata l informazione contenuta nel materiale genetico?

7 IL GENOMA Il genoma è l'insieme di tutte le informazioni biologiche necessarie alla costruzione e al mantenimento di un organismo vivente. Genomi a DNA Organismi unicellulari e pluricellulari Genomi a RNA Alcuni virus

8 IL GENOMA NUCLEARE Il genoma umano, similmente ai genomi di tutti gli animali pluricellulari, è costituito da due componenti distinte, il genoma nucleare e il genoma mitocondriale. Genoma nucleare Contiene circa 3 miliardi di nucleotidi raggruppati in molecole lineari (Cromosomi): 22 coppie di autosomi (coppie di cromosomi uguali) 1 coppia di cromosomi sessuali, X e Y XX nelle donne, XY negli uomini Le cellule sessuali, o gameti, sono aploidi, contengono cioè solo una copia per cromosoma (23 cromosomi in tutto) a differenza delle cellule somatiche che sono diploidi (46 cromosomi).

9 IL GENOMA MITOCONDRIALE E' una molecola di DNA circolare di circa 16 mila nucleotidi, presente in copie numerose nei mitocondri, gli organelli che generano energia. Contiene informazioni per la sintesi di molecole di rrna e trna.

10 IL PROGETTO GENOMA UMANO Il Genoma è fatto di DNA, molecola costituita da 4 diversi tipi di nucleotidi (A, C, G, T). Obiettivo del progetto: determinare la sequenza nucleotidica dell'intero genoma nucleare umano. Progetto pubblico, finanziato da governi e organizzazioni di tutto il mondo. Progetto privato: Celera Genomics. Risultati pubblicati nel Sequenziato circa l'84% del genoma umano, ad esclusione di alcune regioni telomeriche (estremità dei cromosomi) e prossimali ai centromeri (centro del cromosoma).

11 IL GENOMA: ATCGGACTGACTAGCATACAG Ciascun progetto genoma ha prodotto oltre 2 miliardi e mezzo di sequenze di coppie di basi. L'intera sequenza del genoma umano, scritta in Times New Roman, dimensione 12, avrebbe una lunghezza di 5000 km! Ogni essere umano ha una propria sequenza genomica individuale, ad eccezione dei gemelli omozigoti. Principali differenze tra i genomi di due individui diversi: Polimorfismi (Posizioni nella sequenza contenenti nucleotidi differenti) Microsatelliti (Sequenze ripetute di nucleotidi, differenti in numero tra un individuo ed un altro)

12 LA SEQUENZA DEL GENOMA La sequenza nucleotidica del genoma è presente su ciascuno dei due filamenti della doppia elica del DNA. I due filamenti sono antiparalleli, uno in direzione 5'-3' e l'altro in direzione 3'-5': 5'- AGATCGATACGAAAGTAC -3' 3'- TCTAGCTATGCTTTCATG -5' Dato un filamento è possibile costruire l'altro per complementarità: ciascun filamento contiene la stessa informazione!

13 COSA C'È SCRITTO NEL GENOMA? Il genoma contiene tutte le informazioni necessarie al funzionamento di un intero organismo. Ogni cellula contiene una copia del Genoma. Alcune informazioni sono utilizzate allo stesso modo da ogni tipo di cellula, altre sono invece caratteristiche di determinati tipi cellulari. Un neurone ed un leucocita (globulo bianco) contengono lo stesso genoma e quindi le stesse informazioni, ma non le utilizzano tutte allo stesso modo.

14 COM'È ORGANIZZATO IL GENOMA? Il Progetto Genoma di un organismo ci rivela la sua sequenza nucleotidica: a quel punto occorre riuscire ad interpretarla correttamente! La sequenza di un Genoma è apparentemente una successione casuale di nucleotidi; in realtà sono distinguibili diversi tipi di elementi, strutturati in maniera ben precisa, ciascuno preposto ad una ben determinata funzione.

15 ELEMENTI TIPICI DI UN GENOMA Geni Pseudogeni Sequenze ripetute Microsatelliti

16 I GENI Un gene è un segmento di genoma contenente l'informazione per la sintesi di una proteina. Gene Trascrizione/Traduzione La sequenza nucleotidica del gene contiene la "ricetta" per la sintesi della proteina. Proteina

17 I GENI (2) L'espressione dei geni coinvolge un intermediario chiamato RNA messaggero, che copia la sequenza del gene e la porta fino al citoplasma, dove la sequenza viene tradotta affinché avvenga la sintesi della proteina (nei ribosomi). Non tutti i geni però codificano proteine. Alcuni di essi infatti specificano vari tipi di RNA non codificante, alcuni dei quali verranno introdotti più avanti.

18 GLI PSEUDOGENI Gli pseudogeni sono copie non funzionali di geni. Sono una sorta di relitti evolutivi. Gli pseudogeni convenzionali sono geni inattivati in seguito ad una o più mutazioni nella loro sequenza nucleotidica. Una volta che uno pseudogene è diventato completamente non funzionale si degraderà per accumulazione di ulteriori mutazioni e potrebbe addirittura non essere più riconosciuto come relitto genico.

19 JUNK DNA Circa il 62% del genoma umano è costituito da regioni intergeniche, parti del genoma che si trovano tra i geni e la cui funzione è sconosciuta. Queste sequenze venivano chiamate Junk DNA (DNA spazzatura), perché non se ne conosceva la funzione. Ricerche recenti tendono invece a rivalutare tali sequenze, che si rivelano potenzialmente coinvolte in numerosi processi: non è detto che ciò di cui non capiamo ancora la funzione sia poco importante!

20 RIPETIZIONI DISPERSE E MICROSATELLITI La grande maggioranza del DNA intergenico è rappresentata da sequenze ripetute di vario tipo. Il DNA ripetitivo può essere diviso in due categorie: Ripetizioni intersperse DNA ripetuto in tandem

21 RIPETIZIONI INTERSPERSE Esistono 4 tipi di ripetizioni disperse nel genoma: SINE LINE Elementi LTR Trasposoni a DNA Ciascun tipo di queste ripetizioni sembra derivare da un elemento trasponibile, un segmento mobile di DNA in grado di spostarsi da una posizione ad un'altra del genoma, lasciando una propria copia.

22 MICROSATELLITI I microsatelliti sono ripetizioni in tandem di DNA. In un microsatellite l'unità ripetuta è generalmente breve, fino a 13 bp (base pairs paia di basi). Non si sa se i microsatelliti hanno una funzione. Derivano da un errore del processo di replicazione del genoma durante la divisione cellulare, quindi potrebbero rappresentare semplicemente un prodotto inevitabile della replicazione genomica.

23 IL GENOMA UMANO

24 I GENOMI DEGLI EUCARIOTI Le strutture di base di tutti i genomi eucariotici sono simili, ad eccezione della dimensione. Funghi: Mb Protozoi: 190 Mb Invertebrati: Mb Vertebrati: Mb Piante: Mb

25 GRANDE GENOMA = MOLTI GENI? La dimensione del genoma è correlata al numero di geni che esso contiene? Non è detto! Saccharomyces cerevisiae (lievito) Homo sapiens (uomo) Genoma: 12 Mb (0,004 volte la grandezza del genoma umano) Genoma: 3200 Mb Geni: 5800 Geni: Se dimensione e numero di geni fossero correlate, il lievito dovrebbe contenere, in proporzione a quello umano, solo 100 geni, mentre ne contiene 5800!

26 IL PARADOSSO DEL VALORE C Con valore C si intende la quantità di DNA per genoma; non c è un'ovvia correlazione fra la complessità degli organismi e la quantità di DNA del genoma. In realtà nei genomi degli organismi meno complessi si risparmia spazio in quanto i geni sono più vicini tra loro. Confrontando il genoma umano con quello del lievito, emerge che l'organizzazione di quest'ultimo è molto più economica di quella del genoma umano: I geni sono più compatti Le sequenze intergeniche sono più piccole Le ripetizioni disperse e le altre sequenze non codificanti occupano molto meno spazio Il genoma del lievito è più "concentrato"!

27 I GENOMI DEI PROCARIOTI I genomi dei procarioti sono molto differenti da quelli degli eucarioti: Sono molto più piccoli Sono molto più compatti Sono contenuti in una singola molecola di DNA circolare Alcuni geni possono essere localizzati su molecole indipendenti di DNA più piccole, chiamate plasmidi.

28 I GENI Il gene è l'unità ereditaria e funzionale degli organismi viventi. La maggior parte dei geni codifica proteine, che sono le macromolecole maggiormente coinvolte nei processi biochimici e metabolici della cellula. Altri geni non codificano proteine, ma producono RNA non codificante, che può giocare un ruolo fondamentale nella sintesi delle proteine e nell'espressione genica (La trascrizione del DNA in RNA e la traduzione dell'rna in proteina). Parte del contenuto dei geni non viene trascritto, ma può coordinare la stessa espressione genica. Tra queste regioni figurano i promotori, i terminatori e gli introni.

29 DNA PERCORSO STORICO LE TAPPE CHE HANNO PORTATO A IDENTIFICARE NEL DNA IL MATERIALE EREDITARIO

30 1865 I geni sono dei fattori particolati Primi studi chimici sul DNA 1903 I cromosomi sono unità ereditarie 1910 I geni sono localizzati nei cromosomi 1913 I cromosomi contengono degli insiemi lineari di geni 1927 Le mutazioni sono dei cambiamenti fisici nei geni 1931 La ricombinazione è causata dal crossing-over 1944 Il DNA è il materiale genetico 1945 Un gene codifica una proteina 1953 Il DNA ha una struttura a doppia elica 1958 Il DNA si replica in maniera semiconservativa 1961 Il codice genetico è costituito da triplette di basi 1977 Sequenziamento del DNA 1997 Sequenziamento di interi genomi

31 Un passo indietro Johan Friedrich Miescher ( ) è stato un biologo svizzero, che isolò per la prima volta gli acidi nucleici. Egli evidenziò infatti nel 1869, la presenza di vari composti chimici ricchi in fosfato all'interno dei nuclei dei leucociti. La scoperta di tali molecole, che egli denominò nucleina, aprì la strada all'identificazione del DNA come molecola responsabile della conservazione e della trasmissione dei caratteri ereditari.

32 LA DOMANDA DEL MONDO SCIENTIFICO in quale parte del cromosoma sono contenute le informazioni dell organismo? Nella frazione proteica?...o nella frazione zuccherina? Ci vorranno 40 anni di ricerche per rispondere

33 Un principio trasformante converte il ceppo R in S

34 Avery: il fattore Trasformante è il DNA (per sei anni non gli crede Nessuno)

35 conduce alla scoperta di un fattore in grado di trasformare pneumococchi non virulenti in pneumococchi virulenti. Griffith lo chiamò FATTORE TRASFORMANTE, fattore in grado di contenere le informazioni di un organismi

36 +estratto cellulare S

37 1865 I geni sono dei fattori particolati 1903 I cromosomi sono unità ereditarie 1910 I geni sono localizzati nei cromosomi 1913 I cromosomi contengono degli insiemi lineari di geni 1927 Le mutazione sono dei cambiamenti fisici nei geni 1931 La ricombinazione è causata dal crossing-over 1944 Il DNA è il materiale genetico 1945 Un gene codifica una proteina 1953 Il DNA ha una struttura a doppia elica 1958 Il DNA si replica in maniera semiconservativa 1961 Il codice genetico è costituito da triplette di basi 1977 Sequenzamento del DNA 1997 Sequenzamento di interi genomi

38 LA CERTEZZA ASSOLUTA: LE INFORMAZIONI SONO CONTENUTE NEL DNA (ESPERIMENTI DI ALFRED HARSHEY E MARTHA CHASE)

39 MECCANISMO DI INFEZIONE VIRALE

40 La regola di Chargaff: la quantità di A è uguale alla quantità di T la quantità di G è uguale alla quantità di C la quantità di G+A è uguale alla quantità di C+T

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42 Rosalin Franklin(1952): ad un passo dalla soluzione

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44 Rosalind Franklin 1952

45 LE SCOPERTE DELLA FRANKLIN Il Dna è composto da due catene Le due catene sono avvolte ad elica attorno ad un asse La distanza tra le due eliche è 2 nanometri

46 Struttura errata a tripla elica proposta da Pauling nel 1952

47 Accoppiamento di basi proposto da Watson e Crick A-T G-C

48 Accoppiamenti complementari delle basi del DNA L adenina si lega alla timina con 2 legami idrogeno. La citosina si lega alla guanina con 3 legami idrogeno. Ogni coppia di basi è costituita da una purina e una pirimidina.

49 Watson e Crick (1953): L intelligenza della visione d insieme nel modello a doppia elica

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53 ELEMENTI CHIAVE DELLA STRUTTURA DEL DNA Elica a doppio filamento con diametro uniforme Elica destrorsa I due filamenti sono antiparalleli Le basi sono all interno dell elica, perpendicolari all asse dell elica e formano coppie di basi complementari

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55 Watson, Crick, and Wilkins were awarded the 1962 Nobel Prize in Physiology or Medicine "for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material.

56 OGNI PARTICOLARE AL POSTO GIUSTO I geni sono contenuti nel Dna Il Dna è composto da 4 tipi di nucleotidi Ogni nucleotide è composto da uno zucchero pentoso, un gruppo fosfato e una base azotata In qualsiasi genoma cambia la quantità di nucleotidi ma resta fisso il rapporto 1:1 tra adenina timina e guanina citosina Il legame a idrogeno può mantenere stabili le strutture organiche Il DNA è una doppia elica con distanza tra le due fibre pari a 2 nanometri

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58 La struttura chimica del DNA

59 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007

60 Componenti chimici degli acidi nucleici 5 CH2OH O OH 5 CH2OH O OH desossiribosio ( 2-deoxyribose ) 3 OH 2 3 OH 2 OH ribosio 1 N N 8 N NH 2 N H N O N 2 N 3 4 N H 9 N N H H 2 N purina adenina guanina N N H 3 N 4 5 N NH 2 H N O H N O CH 3 2 N 1 6 O N H pirimidina citosina uracile timina O N H O N H

61 O O O - O P O - O P O - O P O - O CH2 O γ β α OH OH

62 Struttura Zucchero Base Azotata Fosfato Nucleoside Nucleotide Nucleotide Nucleotide Nucleotide Nucleotide Acido Nucleico

63 Zucchero. Il DNA contiene il D-2- desossiribosio RNA contiene il D-ribosio Gruppi Fosfato

64 Nucleoside Zucchero Nucleoside Base Azotata NH 2 Legame dell N1 della Base Azotata con il C1 dello Zucchero HO O N N N N 64 OH OH

65 Nucleotide Fosfato Nucleotide Nucleoside 65 Legame estereo dell Acido Fosforico con l ossidrile in C5 dello Zucchero O O - P O - H 3 C O O OH O N N H O

66 Ciascun nucleotide è formato da tre molecole Gruppo fosfato Zucchero pentoso Base azotata Fosfato Base azotata Zucchero Lo zucchero (un pentoso) è: Il Desossiribosio nel DNA Il Ribosio nel RNA I diversi nucleotidi sono legati tra loro attraverso il gruppo fosfato 66 Acidi Nucleici

67 Desossiribonucleotidi NH 2 O O - O P O - O O N N N N O - O P O - O O N N N NH NH 2 OH OH 2 -Deossiadenosina 5 -fosfato 2 -Deossiguanosina 5 -fosfato NH 2 O H 3 C H O N O N O - P O O N O O - P O O N O O - O - 67 OH OH 2 -Deossicitidina 5 -fosfato 2 -Deossitimidina 5 -fosfato

68 Ribonucleotidi NH 2 O O - O P O - O O N N N N O - O P O - O O N N N NH NH 2 68 OH OH OH OH Adenosina 5 -fosfato Guanosina 5 -fosfato NH 2 O O - O P O - N O N O O N O N O OH OH OH OH Citidina 5 -fosfato Uridina 5 -fosfato O - O P O - H O

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72 Struttura primaria degli acidi nucleici Come per le proteine, gli acidi nucleici hanno una struttura primaria, costituita dalla sequenza di basi e una direzionalità che presenta un estremità 5' libera da un lato ed una 3' libera dall'altro. Per convenzione le sequenze degli acidi nucleici sono scritte a partire dalla 5' finendo alla 3'. Secondo questa convenzione i legami fosfodiesteri vanno dal 3' al 5'

73 Sequenza Si descrive attraverso l ordine delle Basi Azotate partendo dall estremità 5 fino all estremità 3 Adenosina (Base Azotata) Timina (Base Azotata) Citosina (Base Azotata) Fosfato Zucchero Fosfato Zucchero Fosfato Zucchero Fosfato -A-T-C-

74 La struttura secondaria del DNA La doppia elica Studi ai raggi X Sistema regolare che si ripeteva con una certa periodicità Le quantità di A e di T erano sempre uguali e che le quantità di G e C erano uguali

75 Struttura secondaria del DNA La struttura secondaria non è casuale ma è dovuta ai legami ad idrogeno che si formano tra le basi

76 Struttura secondaria DNA - Gli spettri mostravano la presenza di un'elica - la spaziatura tra le macchie mostravano che c'erano 10 basi per giro d'elica - la densità delle fibre indicava la presenza di due molecole per elica. Watson e Crick proposero che la doppia elica fosse stabilizzata dalla formazione di legami ad idrogeno tra le basi presenti sui filamenti opposti secondo lo schema A- T e G-C

77 Modello di Watson e Crick Il DNA è costituito da due catene polinucleotidiche a elica avvolte intorno a un asse comune. Le eliche sono destrogire e i due filamenti si sviluppano in direzioni opposte, con riferimento alle loro estremità 3' e 5'. 77

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79 Le basi puriniche e pirimidiniche si trovano all'interno dell'elica, su piani che sono perpendicolari all'asse dell'elica, mentre i gruppi deossiribosio e fosfato formano la parte esterna dell'elica. Le due catene sono tenute insieme da coppie di basi puriniche-pirimidiniche, legate con legami idrogeno. L'adenina (A) è sempre accoppiata conla timina (T) e la guanina (G) è sempre accoppiata con la citosina (C). 79

80 L'adenina (A) è accoppiata con la timina (T) con due legami ad idrogeno La guanina (G) è accoppiata con la citosina (C) con tre legami ad idrogeno. 80

81 DNA Il DNA è simile per struttura all RNA ma: 1) Al posto dell uracile c è la timina 2) Il DNA è costituito da un doppio filamento Tra le basi dei due filamenti si formano legami idrogeno che li tengono uniti 81 Nel DNA le basi appartenenti ai due filamenti sono appaiate in modo caratteristico ( timina con adenina, guanina con citosina)

82 Conoscendo la sequenza di un filamento..

83 .. si può desumere la sequenza del filamento complementare 83

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85 85 Il risultato è una lunga molecola di DNA

86 Un appaiamento Guanina-Citosina caratterizzato da 3 legami idrogeno. Un appaiamento Adenina-Timina caratterizzato da 2 legami idrogeno.

87 Il diametro dell'elica è di 20 Å. Le coppie di basi adiacenti sono separate di 3,4 Å e si succedono ad ogni avanzamento dell'elica di 36º. Ci sono perciò 10 coppie di basi per ogni giro completo dell'elica (360º) e la struttura si ripete ogni 34 Å. Non c'è nessuna limitazione alla sequenza di basi lungo una catena polinucleotidica. Dalla sequenza esatta però dipende l'informazione genetica.

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93 Stabilità della doppia elica La formazione della doppia elica è favorita da Interazioni idrofobiche derivanti dall'impaccamento delle basi dalla formazione di legami ad Idrogeno tra le coppie di basi. La formazione della doppia elica è sfavorita da: Repulsione elettrostatica dei fosfati che si trovano sullo scheletro dei filamenti Dall'entropia conformazionale Formazione di legami ad Idrogeno con l'acqua.

94 Le eliche del DNA (Tutte le molecole qui illustrate contengono dodici coppie di basi ) A DNA B DNA Z DNA Tipo d'elica destrosa destrosa destrosa Diametro ~26 Å ~20 Å ~18 Å Coppie/giro Viste laterali Viste dall'alto 94

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96 RNA L RNA è costituito da un singolo filamento I nucleotidi non sono tutti uguali ma differiscono per la base Ci sono 4 differenti tipi di basi: Adenina Citosina Guanina Uracile 96 L informazione contenuta negli acidi nucleici è codificata nella sequenza di basi che compongono il filamento (un alfabeto di 4 lettere)

97 RNA: struttura secondaria e terziaria L'RNA esiste sottoforma di tre maggiori tipi: trna o RNAtransfer, rrna o RNA ribosomiale, mrna o RNA messaggero. Altre forme meno importanti servono nello splicing dell'rna RNAtransfer (trna) sono costituiti da nucleotidi e servono nella sintesi delle proteine. DNA e RNA a singolo filamento tendono ad assumere una conformazione random coil. Comunque tali molecole a filamento singolo contengono regioni con sequenze auto complementari (trna)dove la molecola può formare zone a doppio filamento trna contiene basi modificate. RNA Ribosomiale (rrna) Il ribosoma è un organello cellulare coinvolto nella sintesi proteica e consiste di due subunità, una piccola ed una grande, dove rrna è parte integrante. - RNA messaggero (mrna) Il mrna è una copia-stampo per la sintesi delle proteine. Viene assunta una struttura del tipo A o a singolo filamento. mrna non contiene basi modificate.

98 Differenza tra DNA e RNA Nel DNA, le basi sono legate al 2'desossiribosio con un legame N1'glicosidico a formare un desossinucleotide Nell' RNA, le basi sono legate al ribosio per formare un nucleotide con un legame N1'glicosidico I desossiribonucleotidi sono degli esteri fosforici in posizione 5' dei desossinucleosidi I ribonucleotidi sono dei monoesteri fosforici dei nucleosidi Gli acidi nucleici sono polimeri dei fosfati dei nucleotidi. I polimeri DNA e RNA sono formati da legami fosfodiestere tra gli OH 5' di un nucleotide e il 3' di un idrossile seguente. I nucleotidi sono acidi forti in quanto i due pka del fosfodiestere sono tra 0.7 ed 1 e 6.1 e 6.3.Di conseguenza lo scheletro dell'rna e DNA sono normalmente carichi negativamente.

99 La struttura terziaria del DNA A causa dell'estrema lunghezza del DNA, la sua struttura terziaria è molto complessa. Comunque si possono discutere alcune strutture. Superavvolgimento Il DNA di batteri, mitocondri, plastidi e alcuni virus è costituito da un anello chiuso. Il DNA circolare può assumere un aspetto incurvato o avvolto come dalle seguenti immagini al microscopio.

100 Il DNA Dna in coppia di cromosomi Un gene (una serie di coppie di nucleotidi in un particolare punto su un cromosoma) contiene la ricetta per una proteina Nucleo cellula Coppie di nucleotidi Mitocondri Una coppia di nucleotidi che varia da individuo ad individuo viene chiamata Snp o snip Cellula La maggior parte delle cellule contiene istruzioni complete per costruire un essere umano, il Dna è in gran parte nel nucleo, ma ce n è dell altro nei mitocondri delle cellule. Cromosomi Nel nucleo,il Dna è disposto in 23 coppie di pacchetti a forma di bastoncino, chiamati cromosomi (una serie proviene della madre, l altra dal padre). Ogni cromosoma contiene un filamento di Dna. Se venisse svolto, il Dna di una cellula sarebbe lungo più di 2,04 metri

101 Il DNA nei cromosomi non e lineare fibra di 30 nm cromatina decondensata (collana di perle)

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103 Il DNA, insieme a diverse proteine si organizza in una struttura che è detta CROMOSOMA. I cromosomi sono costituiti da cromatina, che consiste di fibre contenenti DNA e proteine. Quando una cellula non è in divisione, la cromatina si trova sotto forma di lunghi filamenti. Durante la divisione le fibre di cromatina si condensano e si rendono visibili come strutture distinte. Nelle cellule umane i cromosomi si possono osservare durante la divisone cellulare e distinguere per forma e dimensioni.

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105 Il numero dei cromosomi è tipico per ogni specie. Specie umana: 46 cromosomi

106 OGNI COPPIA DI CROMOSOMI CONTIENE UN CROMOSOMA DI ORIGINE PATERNA E UN CROMOSOMA DI ORIGINE MATERNA I cromosomi sono presenti in coppie nelle cellule somatiche e i membri di una coppia sono i cromosomi omologhi. Se una cellula contiene 2 cromosomi di ogni tipo, cioè due serie di cromosomi, si dice che possiede un corredo cromosomico diploide; se invece è presente un cromosoma di ogni coppia di omologhi, si dice che il corredo è aploide. Nell uomo il numero diploide è 46 e il numero aploide è 23

107 Profase: Inizia quando i lunghi filamenti di cromatina cominciano a condensarsi mediante processi di spiralizzazione nel quale i cromosomi diventano contemporaneamente più corti e più spessi. Ogni cromosoma è stato duplicato durante la precedente fase S e consiste di una coppia di unità identichecromatidi fratelli. Ogni cromatide contiene una regione chiamata centromero.

108 Metafase: i cromosomi sono allineati lungo il piano equatoriale della cellula (piastra metafasica) e prendono contatto con i microtubuli. Per la corretta separazione dei cromosomi si forma una connessione tra i microtubuli del cinetocoro e i cromosomi replicati. Il cinetocoro è un insieme di proteine che aderisce al centromero.

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111 IL DNA ED I CROMOSOMI Different levels of DNA condensation. 1. Double-strand DNA. 2. Chromatin strand (DNA with histones). 3. Chromatin during interphase with centromere. 4. Condensed chromatin during prophase. (Two copies of the DNA molecule are now present) 5. Chromosome during metaphase.

112 Cromosomi umani condensati

113 Proteine associate al DNA Istoni: sono le proteine + abbondanti nei cromosomi. Il loro ruolo è di legarsi al DNA cromosomico carico negativamente, infatti sono proteine molto basiche (25% LYS ed ARG) 5 tipi di istoni sono associati al DNA eucariotico (H1, H2A, H2B, H3 ed H4). Sono tra le proteine più altamente conservate (un solo aa di differenza in H3 di riccio di mare e vitello!). Proteine non istoniche: ne esistono di diversi tipi; alcune hanno ruolo strutturale, altre sono implicate nella regolazione dell espressione genica (per es. RNA polimerasi). Al contrario degli istoni differiscono notevolmente in numero e tipo, tra un tipo cellulare ed un altro entro un organismo, in momenti diversi nello stesso tipo cellulare ed in organismi diversi.

114 Compattazione del DNA nel nucleo 1. Nucleosoma: è la struttura fondamentale della cromatina 11 nm 200 bp = 145 bp avvolte + 55 bp di DNA linker 1. Fibra di cromatina di 30 nm (avvolgimenti destrorsi impilati della collana di perle )

115 Compattazione del DNA nel nucleo 3. Domini ad anse 300 nm

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117 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

118 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

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120 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

121 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

122 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

123 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

124 Regolazione della struttura della cromatina

125 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

126 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

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128 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

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131 Metilazione degli istoni La metilazione degli istoni aumenta lo stato di idrofobicità e la basicità delle porzioni N terminali degli istoni: questo ne aumenta l affinità per proteine specifichee fattoriditrascrizione. Le metilasi necessitano di cofattori: es. la s- adenosilmetionina Generalmente la metilazione degli istoni si associa a repressione dellaespressionegenica, tuttaviaci sonoesempiin cui la metilazione si associa a attivazione della espressione genica

132 MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI Zhang Y, Reinberg D Genes Dev. 2001;15:

133 PROCESSI DI ACETILAZIONE E DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA DELLA CROMATINA ESPRESSIONE GENICA E GENERALMENTE ASSOCIATA CON ACETILAZIONE

134 L acetilazione dei residui di lisina al terminale NH degli istoni rimuove le cariche positive riducendo quindi l affinità degli istoni per il DNA: per questo l acetilazione degli istoni facilita i processi trascrizionali, al contrario, la deacetilazionereprime la trascrizione. Acetilazione e deacetilazione del residuo lisinico ACETIL TRANSFERASI ISTONICHE :histone acetyltransferases(hats) DEACETILASI ISTONICHE: histone deacetylases(denotedby HDsor HDACs); numerose deacetilasisono associate a repressori della trascrizione;

135 Fosforilazione degli istoni la funzione della fosforilazione degli istoni rimane da essere pienamente compresa: è stato riportato che la fosforilazione degli istoni puo facilitare l attacco di HATs Enzimi quali le ERK possono fosforilare gli istoni legando signaling di recettori di membrana allo stato di fosforilazione degli istoni