DANNO CELLULARE E RECUPERO FUNZIONALE NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE: IMPLICAZIONI PER LA NEURORIABILITAZIONE

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1 DANNO CELLULARE E RECUPERO FUNZIONALE NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE: IMPLICAZIONI PER LA NEURORIABILITAZIONE Responsabile scientifico di progetto DIEGO CENTONZE Università di Roma Tor Vergata Fondazione Santa Lucia U.O.1 Diego Centonze U.O.3 Francesca R. Fusco U.O.4 Tilmann Achsel U.O.5 Francesco Cecconi Fondazione Santa Lucia RF06.69 Finanziamento 2006 Ministero della Salute Ricerca Finalizzata Art. 12 e 12bis D.Lgs. 502/92

2 Sezione III: Attività per progetti UNITÀ OPERATIVE U.O.1 Laboratorio di Neurofisiologia, Fondazione Santa Lucia (Roma) Diego Centonze U.O.2 Divisione di Farmacologia, Università Federico II (Napoli) Lucio Annunziato U.O.3 Laboratorio di Neuroanatomia, Fondazione Santa Lucia (Roma) Francesca R. Fusco U.O.4 Laboratorio di Neurochimica, Fondazione Santa Lucia (Roma) Tilmann Achsel U.O.5 Laboratorio di Neuroembriologia molecolare, Fondazione Santa Lucia (Roma) Francesco Cecconi U.O.6 Dipartimento di Medicina Sperimentale, Università di Roma La Sapienza Matteo Antonio Russo RAZIONALE La attivazione del programma di morte cellulare nel sistema nervoso dell adulto è un fattore comune alle diverse malattie neurodegenerative e coinvolge differenti fenomeni genici (trascrizionali e traduzionali) e molteplici molecole effettrici. L individuazione del ruolo dei fenomeni nucleari e delle molecole coinvolte nello sviluppo del danno cellulare costituisce il presupposto per interventi terapeutici razionali, tra i quali i trattamenti di tipo neuroriabilitativo. Una crescente mole di dati, infatti, ha recentemente consentito di suggerire che specifici interventi riabilitativi sono in grado di interferire efficacemente con il processo di danno neuronale, opponendosi in vario modo ai meccanismi di morte cellulare. Questo è per esempio il caso degli effetti dell esercizio in alcuni modelli animali di malattie neurodegenerative: in tali condizioni cliniche, la progressione della morte cellulare si associa ad una progressiva ipofunzione del sistema endocannabinoide, mentre il trattamento riabilitativo rallenta l evoluzione della malattia e ripristina la funzionalità dei recettori per tali molecole [Glass M. et al. (2004) Neuroscience 123: ]. In molteplici condizioni patologiche, poi, lo sviluppo del danno neuronale degenerativo si associa ad una sostanziale ipoattività delle neurotrofine (tra cui principalmente il BDNF), che al contrario vengono stimolate dai trattamenti neuroriabilitativi [Gómez-Pinilla F. et al. (2002) J Neurophysiol 88: ]. Allo stesso modo, l esercizio è in grado di attivare a livello neuronale la via della camp response element binding protein (CREB) [Gómez-Pinilla F. et al. (2002) J Neurophysiol 88: ], che si trova in uno stato di inibizione durante lo sviluppo del danno eccitotossico e degenerativo [Giampà C. et al. (2006) Eur J Neurosci 23: 11-20]. Ulteriori recentissimi progressi verso la comprensione dei meccanismi di neurodegenerazione riguardano l individuazione delle alterazioni dello splicing alternativo come importante conseguenza del danno mitocondriale e la

3 scoperta del ruolo della cosiddetta autofagia alla base di alcuni fenomeni di morte neurodegenerativa. L obiettivo complessivo della presente ricerca consiste nella identificazione di nuovi determinanti molecolari e cellulari coinvolti nel danno neuronale degenerativo e potenzialmente bersaglio di interventi terapeutici riabilitativi. In particolare ci proponiamo di: 1. Precisare le alterazioni del sistema endocannabinoide coinvolte nel danno cellulare degenerativo e negli effetti terapeutici del trattamento di tipo riabilitativo. 2. Identificare nuovi meccanismi molecolari responsabili dell effetto neuroprotettivo e neuroriabilitativo delle neurotrofine Akt-dipendenti. 3. Verificare in quali condizioni di danno eccitotossico variazioni della CREB possano influenzare la degenerazione neuronale, e se strategie atte ad aumentare il livelli di CREB possano contrastare la morte neuronale eccitotossica. 4. Comprendere il contributo dei cambiamenti nello splicing alternativo nella morte neurodegenerativa e se tali alterazioni sono influenzabili dalla neuroriabilitazione. 5. Identificare nuove molecole coinvolte nei meccanismi di apoptosi e di autofagia. 6. Studiare le potenzialità di un recupero funzionale in cellule con danno subletale preapoptotico. OBIETTIVI Danno cellulare e recupero funzionale nel sistema nervoso centrale: implicazioni Il nostro progetto si propone l obiettivo di approfondire le conoscenze dei meccanismi di danno neuronale e di recupero funzionale. In particolare ci proponiamo i seguenti obiettivi: U.O. 1 La caratterizzazione del ruolo funzionale del sistema degli endocannabinoidi nella fisiopatologia del danno neurale. In considerazione del ruolo della ipofunzione del sistema endocannabinoide nello sviluppo del danno neuronale degenerativo, caratterizzeremo gli effetti della stimolazione dei recettori cannabinoidi in modelli murini di tali patologie, sottoposti o meno a trattamenti che mimano interventi di tipo riabilitativo (arricchimento ambientale). U.O. 2 Stabilire se l attivazione dello scambiatore sodio-calcio (NCX) fa seguito all attivazione di Akt da parte delle neurotrofine rilasciate dal tessuto cerebrale danneggiato e se questo meccanismo media effetti neuroprotettivi. Il rilascio di neurotrofine è uno degli effetti meglio caratterizzati del trattamento riabilitativo, ed è verosimile che NCX sia coinvolto in tali effetti. U.O. 3 Caratterizzare quali situazioni patologiche causano modificazioni della CREB. Verificheremo inoltre se attraverso trattamenti in grado di aumentare i livelli di CREB (mimando il trattamento riabilitativo) è possibile ottenere una riduzione della morte neuronale eccitotossica

4 Sezione III: Attività per progetti U.O. 4 - Studiare gli eventuali cambiamenti di splicing in modelli murini di malattie neurodegenerative. Intendiamo individuare la via di regolazione coinvolta in tali cambiamenti e studiare un caso specifico di splicing alternativo cruciale per la neurodegenerazione: il fattore apoptotico Apaf1. U.O. 5 - La de-regolazione di meccanismi di morte cellulare è stata associata a numerose patologie neurodegenerative. Si intende perciò analizzare i meccanismi di trasduzione del segnale di morte a livello mitocondriale e la loro precoce localizzazione a livello di connessione sinaptica all insorgenza della patologia. U.O. 6 - Analizzare il danno apoptotico caspasico nella sua cinetica temporale allo scopo di identificare il punto di non ritorno verso la morte cellulare in tale processo. Metteremo a punto strategie atte a bloccare il danno e a stimolare una espressione genica in grado di compensare la degradazione cellulare in corso. METODOLOGIA Per studiare a livello funzionale il ruolo del sistema degli endocannabinoidi nello sviluppo del danno neuronale e nei meccanismi di recupero da neuroriabilitazione verranno impiegate tecniche di elettrofisiologia in vitro su fettine cerebrali preparate da modelli animali di malattia di Huntington e di sclerosi multipla esposti o meno ad arricchimento ambientale. Da tali fette verranno effettuate registrazioni da singoli neuroni con la tecnica del whole-cell patchclamp. La funzionalità del sistema endocannabinoide sarà esplorata mediante applicazione o trattamento in vivo con specifici agenti farmacologici. Allo scopo di stabilire se l NGF è in grado di regolare l espressione di NCX in cellule PC-12, si impiegherà il Western Blotting in condizioni basali e dopo aggiunta di NGF o del suo veicolo. Si svilupperà una linea cellulare di dominanti positivi e negativi di Akt attraverso la tecnica del Tet-Off che ci permetterà di attivare od inibire l attività trascrizionale del gene codificante per tale chinasi. Il ruolo di CREB nella morte degenerativa verrà studiato nel ratto dopo ischemia da occlusione dell arteria cerebrale media e dopo lesione striatale eccitotossica da acido quinolinico. Verranno altresì utilizzati topi transgenici con malattia di Huntington sperimentale. Allo scopo di analizzare lo splicing alternativo in tessuto sarà isolato e amplificato l RNA da midollo spinale di topi transgenici per SOD1 G93A (modello di sclerosi laterale amiotrofica) e la sostanza nigra di ratti trattati con 6-OHDA (modello di malattia di Parkinson). I fattori di splicing verranno isolati da cellule in coltura. Le proteine o le isoforme la cui espressione dovesse essere modificata saranno individuate su gel a due dimensioni e saranno identificate tramite spettrometria di massa. I meccanismi di apoptosi e autofagia durante neurodegenerazione si studieranno con tecniche di Northern blot, Western blot ed immunoistochimica in topi Tg2576 che sovraesprimono il precursore della b-amiloide umana. Si studieranno, altresì, neurocolture primarie ottenute da embrioni transgenici ed in linee cellulari di precursori neuronali (ETNA). Si verificherà inoltre se la caspasi 3 attiva è coinvolta nel pruning sinaptico che ha

5 luogo all insorgenza del danno neurodegenerativo, mediante tecniche di enzimologia e immunocitochimica ultrastrutturale. In cellule di neuroblastoma/glioma e nella finestra temporale caratterizzata da attivazione delle caspasi in assenza di frammentazione del DNA si analizzeranno i segnali di sopravvivenza e di crescita neuronale. Biopsie provenienti da pazienti selezionati si studieranno al microscopio elettronico, al microscopio ottico, mediante western blotting e mediante laser capture microdissection. Le frazioni di tessuto omogeneo così ottenute verranno analizzate mediante realtime PCR e mediante immunoistochimica. TRASFERIBILITÀ DEI RISULTATI E DEI PRODOTTI La qualità dei risultati finali raggiunti sarà valutata in base alla coerenza dei risultati stessi e alla correttezza sperimentale utilizzata. Per risultati attinenti alla ricerca di base, quali quelli del presente progetto, lo strumento principale e comunemente accettato per la verifica della qualità dei risultati è dato dal giudizio di referees internazionali, a seguito di pubblicazioni scientifiche, oltre che da resoconti avuti a seguito di partecipazioni a congressi. I sistemi modello allestiti nel presente progetto saranno disponibili per la comunità scientifica per test pre-clinici. I marcatori recettoriali, postrecettoriali, sinaptici, molecolari, comportamentali e genetici messi in luce alla fine del progetto saranno disponibili per testare ipotesi e per la messa a punto di trattamenti terapeutici razionali per la cura e la riabilitazione delle malattie neurodegenerative. OUTPUT Danno cellulare e recupero funzionale nel sistema nervoso centrale: implicazioni 0-6 mesi. Nei primi mesi della ricerca verranno messi a punto i modelli animali per lo studio dei diversi aspetti del danno neuronale e degli effetti potenzialmente legati al recupero dello stesso. Inizierà altresì la valutazione clinica e comportamentale degli effetti dell arricchimento ambientale come modello di neuroriabilitazione. Inizierà inoltre la raccolta dei dati preliminari dello studio da parte di ogni singola Unità Operativa mesi. Analisi statistica dei dati ottenuti e preparazione di manoscritti per eventuale pubblicazione mesi. Verranno organizzati incontri periodici tra le diverse Unità Operative. Tali incontri saranno facilitati dalla favorevole disposizione logistica dei vari laboratori di ricerca, così come dalla esistenza di consolidati rapporti di collaborazione tra alcuni dei gruppi coinvolti. Verranno inoltre organizzati degli incontri e seminari con altri scienziati nazionali ed internazionali per la discussione dei dati mesi. Partecipazione alla formazione di dottorandi di ricerca e medici specializzandi in neurologia mesi. I risultati ottenuti verranno pubblicati su riviste scientifiche e messi a disposizione della comunità scientifica internazionale. Inoltre, i dati ottenuti da questo progetto verranno presentati a congressi nazionali ed inter

6 Sezione III: Attività per progetti nazionali e quindi discussi con scienziati attivamente impegnati nella ricerca clinica e di base riguardante le patologie neurodegenerative. In questo modo solleciteremo lo sviluppo di idee e lo scambio di informazioni utili per il progresso della ricerca in tale settore delle neuroscienze. OBIETTIVI INTERMEDI In considerazione dello specifico ambito di ricerca di ciascuna Unità Operativa, i seguenti risultati intermedi potranno considerarsi attesi e indicatori di un buon andamento della ricerca: U.O. 1 Alterata risposta funzionale alla stimolazione del sistema endocannabinoide nei modelli animali di malattia di Huntington e di sclerosi multipla. In tali modelli verificheremo gli effetti terapeutici dell arricchimento ambientale come modello di neuroriabilitazione. U.O. 2 Sviluppo di una linea cellulare Tet-Off iperesprimente Akt. Valutazione degli effetti di NGF sull espressione di NCX. Valutazione degli effetti dell attivazione di Akt sull espressione di NCX. Valutazione degli effetti dell attivazione di Akt sull attività di NCX. Valutazione delle conseguenze del silenziamento mediante sirna di NCX sull attività neuroprotettiva indotta dall iperespressione di Akt. Valutazione dell effetto del silenziamento di NCX sul differenziamento neuronale e sull estensione neuritica indotti dall iperespressione di Akt. U.O. 3 Stabilire, tra i vari modelli di eccitotossicità, quali sono i più suscettibili alle variazioni della CREB, al fine di predire una maggiore efficacia dei fattori in grado di aumentare l attività di tale fattore di trascrizione. Un ulteriore obiettivo intermedio sarà quello di identificare in quali modelli la CREB potrà essere maggiormente modulata con interventi farmacologici. U.O. 4 Individuare fenomeni di splicing alternativo in geni neuronali murini e confermare l espressione delle isoforme in neuroblastoma murino. Verranno poi individuati fenomeni simili in modelli di sclerosi laterale amiotrofica a varie età, e infine in modelli di malattia di Parkinson. U.O. 5 Studio dell espressione di HSPs e SOD1 in modelli transgenici Tg2576 ed in terminazioni sinaptiche in vivo ed in coltura. Verifica dell attivazione delle caspasi mediante tecniche enzimologiche e osservazione ultrastrutturale nel pruning sinaptico in vivo ed in vitro. Analisi del fenotipo nel sistema nervoso centrale di animali Ambra-1-/- e in modelli cellulari ed animali Apaf1-/-:Ambra-1-/- U.O. 6 - Identificazione del punto di non ritorno verso la morte cellulare nei processi neurodegenerativi. Messa a punto di strategie atte a bloccare il danno e a stimolare una espressione genica compensatoria. Si allega il programma dettagliato delle Unità operative 1, 3, 4 e 5 che fanno capo alla Fondazione Santa Lucia IRCCS

7 Danno cellulare e recupero funzionale nel sistema nervoso centrale: implicazioni U.O.1 Laboratorio di Neurofisiologia Diego Centonze Contributo specifico fornito al progetto Il nucleo striato è un area del cervello particolarmente suscettibile al danno neuronale in corso di malattie degenerative e infiammatorie del sistema nervoso centrale. Grande importanza è stata attribuita recentemente alla alterazione della trasmissione sinaptica eccitatoria e inibitoria nello sviluppo del danno cellulare che si osserva a carico del nucleo striato nella malattia di Huntington e nella sclerosi multipla. In entrambe tali condizioni patologiche sono state osservate precoci alterazioni del sistema endocannabinoide, ed è stato proposto che la ipoattività di tale sistema eserciti un ruolo cruciale nello sviluppo del danno cellulare. A tale proposito, il danno cellulare, i deficit neurologici e la sottoregolazione del sistema endocannabinoide possono essere significativamente ridotti in modelli di patologia striatale grazie a procedure sperimentali come l arricchimento ambientale dei topi da esperimento, che mimano interventi di tipo neuroriabilitativo. Il contributo al programma fornito da questa Unità Operativa consiste nello studio, a livello di singolo neurone, del ruolo delle alterazioni sinaptiche e del sistema endocannabinoide nello sviluppo del danno cellulare striatale che si osserva in modelli animali di danno striatale degenerativo (intossicazione con tossine mitocondriali), di malattia di Huntington (topi transgenici R6/2) e di sclerosi multipla (topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Concentreremo la nostra attenzione sullo studio della trasmissione sinaptica striatale tanto eccitatoria che inibitoria in tali modelli patologici, studiati in diverse fasi dello sviluppo del danno cellulare. Ci focalizzeremo in particolare sulla valutazione della possibile disregolazione a carico del sistema endocannabinoide nelle alterazioni sinaptiche a breve e a lungo termine in tali patologie. Esporremo inoltre i nostri modelli animali ad arricchimento ambientale e ne seguiremo gli effetti comportamentali e, successivamente, neurofisiologici. In particolare, valuteremo se gli effetti terapeutici di tale intervento si associano ad una correzione dei deficit sinaptici e della sensibilità sinaptica alla stimolazione dei recettori per gli endocannabinoidi da parte di agonisti farmacologici diretti o mediante manipolazioni in grado di modulare il tono endogeno di tali composti (inibizione della degradazione di anandamide o 2-AG, attivazione dei recettori metabotropici del glutammato di gruppo I). Metodologia Il topo transgenico R6/2, caratterizzato da una espansione di triplette CAG nel gene dell huntingtina sarà usato come modello sperimentale di malattia di Huntington. Gli animali verranno seguiti quotidianamente, e verranno effettuati test di valutazione motoria e cognitiva

8 Sezione III: Attività per progetti Nel tentativo di indagare se anche l aggressione primitivamente infiammatoria autoimmune della sostanza bianca induce danno neuronale secondario nello striato, studieremo le proprietà intrinseche (potenziale di membrana, relazione corrente-voltaggio, attività di firing) e sinaptiche (frequenza ed ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatorie ed inibitorie e loro modulazione farmacologica da parte di agenti farmacologici in grado di modulare il sistema endocannabinoide) dei diversi tipi neuronali dello striato di topi con EAE indotta mediante immunizzazione con proteina oligodendrocitaria MOG. Parte degli animali da esperimento sarà impiegata per gli esperimenti elettrofisiologici dopo stabulazione convenzionale, e parte dopo esposizione per un tempo sufficientemente lungo (2-4 settimane) in gabbie di maggiori dimensioni e contenenti oggetti in grado di sollecitare visivamente, acusticamente e dal punto di visto motorio tali animali (arricchimento ambientale). In diverse fasi dello sviluppo del danno neuronale striatale, i topi con EAE e con malattia di Huntington sperimentale verranno sacrificati, insieme ai rispettivi controlli sani per gli esperimenti elettrofisiologici in vitro. Dal cervello di tali topi verranno preparate, mediante l uso di un vibratomo, delle fettine comprendenti la corteccia, il nucleo striato e la sostanza bianca. Prima e durante le registrazioni elettrofisiologiche, tali fettine verranno mantenute vitali in una soluzione fisiologica ossigenata a temperatura costante. La tecnica di registrazione elettrofisiologica da singolo neurone impiegata sarà quella di whole-cell patch clamp recording. I singoli neuroni striatali verranno visualizzati sulla fettina mediante l uso di un microscopio ad immersione a 40 ingrandimenti collegato ad una telecamera sensibile ai raggi infrarossi. Allo scopo di studiare la trasmissione sinaptica eccitatoria sia spontanea che evocata, utilizzeremo come elettrodi di registrazioni delle pipette di vetro di 1.8 mm di diametro e 3-5 MOhm di resistenza contenenti una soluzione a base di potassio gluconato (125 mm) che verrà posta in continuità con il liquido intracellulare dei singoli neuroni registrati. Un amplificatore Axopatch 1D verrà impiegato per il rilevamento dei segnali biologici provenienti dai neuroni registrati. Da tali neuroni, in particolare, registreremo sia l attività sinaptica glutammatergica spontanea, sia quella evocata dalla stimolazione della via eccitatoria corticostriatale. Per studiare l attività sinaptica inibitoria GABAergica gli elettrodi di registrazioni verranno riempiti con soluzione contenente principalmente cesio cloruro (110 mm), mentre l elettrodo di stimolazione verrà posto all interno dello striato allo scopo di attivare selettivamente le fibre GABAergiche, che come è noto provengono principalmente dagli interneuroni striatali inibitori. Tanto per lo studio degli eventi sinaptici GABAergici spontanei che evocati, le fettine verranno tenute in una soluzione contenente CNQX (10 mm) e MK-801 (30 mm), allo scopo di bloccare sia i recettori AMPA che NMDA del glutammato. I diversi composti impiegati per lo studio della modulazione presinaptica e postsinaptica della trasmissione eccitatoria ed inibitoria verranno applicati a concentrazioni note nel liquido di perfusione, ed i risultati ottenuti verranno acquisiti, registrati ed analizzati on line e off line mediante Axon pclamp

9 Danno cellulare e recupero funzionale nel sistema nervoso centrale: implicazioni U.O.3 Laboratorio di Neuroanatomia Francesca Romana Fusco Contributo specifico fornito al progetto È stato dimostrato che l attività della c-amp responsive element binding protein (CREB) e della CREB-binding protein è diminuita in alcune malattie neurodegenerative quali la corea di Huntington. La CREB esercita funzioni neuroprotettive e media a livello nucleare la trascrizione genica regolata dal calcio che segue alla depolarizzazione di membrana ed è necessaria per la sopravvivenza dei neuroni del sistema nervoso centrale. Il nostro studio è mirato a verificare quali modelli di lesione eccitotossica risentono maggiormente della diminuzione di CREB ed a studiare un approccio alternativo atto ad esercitare, in quei modelli, una neuroprotezione dalla morte cellulare eccitotossica attraverso l aumento dei livelli di CREB. Verranno utilizzati vari modelli di lesione eccitotossica sia nel ratto (ischemia cerebrale da occlusione transitoria dell arteria cerebrale media, lesione striatale da iniezione di acido quinolinico) che nel topo transgenico (corea di Huntington), accomunati da una sostanziale analogia neuropatologica nella degenerazione dello striato. In tali modelli verrà effettuato uno studio preliminare di valutazione dei vari parametri di espressione della CREB e dei suoi geni target quali il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF). In seguito, animali trattati con le varie lesioni eccitotossiche verranno trattati con un farmaco (Rolipram) noto per aumentare i livelli di CREB attivata. Gli effetti di tale farmaco verranno quindi studiati con metodiche immunoistochimiche per la valutazione del danno tissutale macroscopico e microscopico e dell espressione della CREB e dei suoi geni target. Metodologia Per questo studio verranno utilizzati ratti wistar adulti maschi (Harlan) del peso di g, e topi transgenici portatori della mutazione del gene dell huntingtina (R6/2). I ratti verranno utilizzati per sviluppare il modello di ischemia cerebrale da occlusione transitoria dell arteria cerebrale media e la lesione striatale eccitotossica da iniezione stereotassica con acido quinolinico. I topi transgenici verranno utilizzati come modello di riferimento di lesione eccitotossica striatale da difetto genetico (corea di Huntington). Per ottenere un numero congruo di topi transgenici verrà prodotta una piccola colonia a partire da alcune coppie ottenute dalla JAXMice. Tutti gli animali verranno trattati con un farmaco noto per aumentare i livelli di CREB attiva (rolipram). Gli indicatori per la valutazione dello studio saranno nel nostro caso i parametri immunoistochimici di espressione a livello proteico della CREB attivata (pcreb), e di alcuni dei suoi geni target, quali il BDNF e l huntingtina. Inoltre

10 Sezione III: Attività per progetti verranno valutati, sempre per mezzo di markers immunoistochimici, il numero ed il sottotipo dei neuroni striatali residui dopo le varie lesioni. Il primo periodo sarà dedicato alla chirurgia degli animali e alla stabilizzazione della colonia di topi per le osservazioni della CREB e dei suoi geni target. Durante il secondo semestre si procederà alla stabilizzazione della colonia di topi transgenici, e si effettuerà l osservazione immunoistochimica dei parametri di espressione della CREB e dei CREB-target genes nei ratti operati. Nel terzo semestre verrà iniziato il trattamento farmacologico dei topi transgenici e dei ratti lesionati chirurgicamente. Nel quarto semestre verranno valutati, per mezzo dell immunoistochimica, i parametri di neurodegenerazione in termini di entità della lesione e numero di cellule, da una parte, e di espressione di CREB e CREB-target genes, dall altra

11 Danno cellulare e recupero funzionale nel sistema nervoso centrale: implicazioni U.O.4 Laboratorio di Neurochimica Tilmann Achsel Contributo specifico fornito al progetto Lo splicing alternativo è un importante passaggio nella regolazione post trascrizionale che produce, a partire dallo stesso gene, isoforme di proteine con funzioni potenzialmente differenti [Matlin AJ, Clark F, Smith CW (2005) Nat Rev Mol Cell Biol 6: ]. Nei mammiferi, almeno il 30% di tutti i geni subisce splicing alternativo. Abbiamo recentemente dimostrato che l abbondanza di molte, se non di tutte, le isoforme dei geni che subiscono splicing alternativo cambia in un modello in coltura di Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA). Specificatamente, abbiamo potuto osservare che tale cambiamento è causato da un deficit energetico derivante da un danno mitocondriale [Maracchioni A., Totaro A., Angelini D.F., Di Penta A., Bernardi G., Carrì M.T., Achsel T. (in press) J Neurochem]. Ci si aspetta quindi che difetti simili possano essere osservati in altre malattie neurodegenerative in cui il difetto mitocondriale è in primo piano, come la malattia di Parkinson (MP) o la malattia di Alzheimer. Nel presente progetto, intendiamo verificare difetti di splicing in modelli murini di SLA e MP. In particolare, siamo interessati a conoscere se i cambiamenti di splicing precedono le manifestazioni cliniche delle malattie, o se sono una conseguenza di queste. Inoltre, vogliamo caratterizzare le cascate di trasduzione del segnale che inducono alterazioni nei meccanismi di splicing, mediante una analisi subproteomica dei cambiamenti nella popolazione di fattori di splicing purificati. In più, studieremo le cascate dei segnali noti per essere coinvolti nello splicing alternativo. Infine, studieremo l impatto dei cambiamenti di splicing sulla sopravvivenza dei neuroni. A questo fine, inizialmente mapperemo possibili cambiamenti nello splicing alternativo utilizzando un approccio genomico (splice-sensitive micro-arrays). La suddetta disregolazione di un vasto numero di eventi di splicing alternativo potrebbe avere un profondo impatto sulla sopravvivenza neuronale, potenzialmente rilevante in molte malattie neurodegenerative. Questo progetto contribuirà a delucidare il preciso contributo dello splicing alternativo al danno degenerativo di molteplici sistemi neuronali. Inoltre, in base alla identificazione delle cascate dei segnali coinvolti, i risultati consentiranno un avanzamento verso l individuazione di una strategia terapeutica basata sulla modulazione di questa attività molecolare. Metodologia Per verificare i difetti di splicing alternativo in modelli murini di neurodegenerazione, si studierà inizialmente il topo transgenico sovraesprimente il gene umano SOD1 nella sua forma mutata G93A. Questo ceppo è un ottimo modello di SLA. Da tali animali, a varie età pre- e post-sintomatiche, e da con

12 Sezione III: Attività per progetti trolli wild-type della stessa età, sarà preparato l RNA totale dal midollo spinale. Le rispettive regioni dei mrna che subiscono splicing alternativo saranno evidenziate tramite RT-PCR sicché tutte le isoforme si amplifichino nella stessa reazione PCR. In tale modo, si può usare l isoforma maggiore come controllo interno e calcolare l abbondanza delle isoforme minori come percentuale della maggiore. Una volta stabilito che lo splicing alternativo cambia nel modello murino, utilizzeremo gli stessi campioni di RNA per saggiare un micro-array in grado di rilevare lo splicing. Tali micro-array sono stati sviluppati dalla ditta Exon- Hit, che fa parte della Agilent. Un lettore per i micro-array Agilent è disponibile presso la nostra struttura. Una tale analisi consentirà, in un singolo esperimento, di mappare cambiamenti in un grande numero di geni, e permetterà di capire la funzione di questi cambiamenti e dunque la sua importanza per la neurodegenerazione. Per capire come avviene il cambio di splicing, cercheremo inizialmente di studiare la popolazione delle proteine hnrnp e SR, le due famiglie di fattori dello splicing che incidono sulla scelta dei siti di splicing, con metodi di subproteomica. Entrambi i gruppi di proteine si purificano usando protocolli semplici; abbiamo già adattato tali protocolli all impiego di piccole quantità che si ottengono da cellule di neuroblastoma. Le proteine purificate saranno poi frazionate su gel a due dimensioni e la traccia risultante sarà confrontata fra proteine isolate da cellule trattate e cellule di controllo. Le proteine che si trovano in bande modulate saranno individuate tramite spettrometria di massa. In un approccio complementare cercheremo la/le chinasi coinvolte nella segnalazione cellulare che porta al cambio dello splicing. Utilizzeremo inibitori specifici (un gran numero ne è disponibile sul mercato) per vedere se l inibizione di una chinasi diminuisce o neutralizza l effetto del danno mitocondriale sullo splicing. Una volta individuata una tale chinasi, ci si aspetta che sarà possibile seguire la rispettiva cascata di segnalazione fino ai bersagli identificati fra i fattori di splicing, ad esempio verificando se la chinasi ricombinante che si trova alla fine della cascata di attivazione può fosforilare proteine hnrnp e/o SR purificate (vedi sopra). Infine proponiamo di studiare l impatto del cambio di splicing alternativo sulla sopravvivenza neuronale. Per tale scopo sarà molto interessante valutare l elenco dei geni modulati ottenuto mediante microarray. Tale approccio consentirà di valutare tramite sistemi bioinformatici quali vie cellulari sono particolarmente colpite. Abbiamo già dimostrato che Apaf1, un fattore centrale dell apoptosi, è un gene coinvolto nella neurodegenerazione, e il cui rapporto delle isoforme cambia in modo eclatante. In collaborazione con l U.O. 5 (Francesco Cecconi) vogliamo costruire cdna codificanti per tutte le isoforme del gene Apaf1, e trasfettarle in cellule derivate da topi Apaf1 -/-: in tale modo Apaf1 esogeno è l unica sorgente della proteina ed in tale sistema si può studiare l aumento o la riduzione dell apoptosi in cellule trasfettate con le isoforme minori rispetto alla isoforma maggiore

13 Danno cellulare e recupero funzionale nel sistema nervoso centrale: implicazioni U.O.5 Laboratorio di Neuroembriologia Molecolare Francesco Cecconi Contributo specifico fornito al progetto La progressiva perdita di connettività neuronale e la conseguente morte del neurone sono le caratteristiche anatomo-patologiche di numerose neurodegenerazioni. Oltre alla morte apoptotica di neuroni degenerati, mediata da una famiglia di proteasi denominate caspasi, attivate dal complesso multimolecolare dell apoptosoma, si è ipotizzato un ruolo specifico per alcune caspasi (ad esempio la caspasi 3) nel trasdurre la tossicità degli agenti causali delle neurodegenerazione (ad esempio il peptide b-amiloide nel morbo di Alzheimer). Inoltre, più recentemente, si è osservato come l alterazione di meccanismi di degradazione vacuolare tipici dell autofagia, contribuiscano ai processi neurodegenerativi. Questa U.O. si è distinta in passato per: (a) l identificazione della molecola Apaf1 (Fattore di attivazione delle proteasi apoptotiche) come componente fondamentale dell apoptosoma durante lo sviluppo embrionale del sistema nervoso centrale e nell omeostasi dei tessuti nervosi adulti; (b) la verifica della capacità dei precursori neuronali privi di apoptosoma di sopravvivere alla neurodegenerazione. Inoltre, la stessa U.O. ha recentemente isolato il gene Ambra-1 (Molecola di attivazione nell autofagia regolata da Beclin-1), come fattore cruciale nell autofagia basale delle cellule nel sistema nervoso centrale. Tale processo è essenziale per indurre una morte cellulare alternativa in vivo in condizioni di apoptosi insufficiente. Benché sia quindi certo che sia l apoptosi sia l autofagia siano deregolate in processi neurodegenerativi, il loro reale significato in condizioni patologiche è ancora largamente incerto. Intendiamo studiare il coinvolgimento dell apoptosoma e del pathway autofagico mediato da Ambra-1 in condizioni neurodegenerative. A questo scopo verranno utilizzati modelli cellulari e animali già precedentemente realizzati (topi Apaf1-/-, topi Ambra-1-/- e precursori neuronali deprivati dell apoptosoma, le cellule ETNA) e verranno generati nuovi sistemi modello (cellule primarie neuronali Apaf1-/- e Ambra-1-/- e precursori neuronali deprivati del meccanismo autofagico). Questi sistemi saranno esposti a condizioni patologiche in vivo, mediante incroci con modelli animali di neurodegenerazione, ed in coltura. Infine verranno isolati i loro interattori molecolari mediante tecniche di biologia molecolare e cellulare. Metodologia Nell ambito dello studio dei meccanismi di apoptosi in neurodegenerazione, si indagheranno le basi molecolari responsabili dell attivazione precoce delle caspasi in sistemi modello. Inizialmente si analizzeranno, con tecniche di Northern blot, Western blot ed immunoistochimica, i livelli della Cu,Zn

14 Sezione III: Attività per progetti superossido dismutasi (SOD1), e di due heat-shock protein (HSPs, Hsp70 e Hsp25) nell ippocampo del modello di malattia neurodegenerativa Tg2576. In questo modello viene sovra-espresso il precursore della b-amiloide umana portatore della mutazione Swedish (presente in forme familiari di Alzheimer, AD) e che porta all accumulo di alti livelli di b-amiloide in diverse porzioni della neocorteccia e nell ippocampo. Si studieranno, altresì, i livelli delle stesse proteine in neurocolture primarie ottenute da embrioni transgenici ed in linee cellulari di precursori neuronali (ETNA). Tale studio ha lo scopo di definire se i livelli di espressione di mrna e di proteine in oggetto sono più bassi nel topo transgenico e nelle neurocolture derivate da embrioni transgenici e se, nell animale in vivo, tale riduzione è riscontrabile a tre mesi di età, ben prima che le placche amiloidi si siano accumulate. Sulla base delle proprietà citoprotettive delle HSPs e della SOD1 e della relazione temporale tra la diminuita risposta da stress e l esordio dei deficit comportamentali e sinaptici riportati in letteratura, si ipotizza che la riduzione di queste proteine contribuisca alla disfunzione neuronale in AD. Si verificherà inoltre se la caspasi 3 attiva è coinvolta nel pruning sinaptico che ha luogo all insorgenza dei tratti neurodegenerativi, mediante tecniche di enzimologia e immunocitochimica a livello ultrastrutturale, sfruttando come controllo cellule primarie che sovraesprimono il precursore della b-amiloide ma mancano di Apaf1. Per quanto riguarda l analisi dell autofagia, verranno condotti: a) uno screening mediante la strategia yeast two-hybrid per identificare gli interattori molecolari della proteina Ambra-1; b) un analisi dettagliata del fenotipo embrionale di animali in cui il gene Ambra-1 sia stato inattivato mediante genetrapping (già generati in laboratorio) mediante analisi istologica, ibridazione in situ dell mrna ed analisi immunoistochimica; c) un analisi di suscettibilità di cellule mutanti in Ambra-1 e nel fattore proapoptotico Apaf1 all induzione neurodegenerativa (ad es. il peptide b- amiloide come modello sperimentale di AD); d) un analisi in vivo del fenotipo doppio mutante Apaf1-/-;Ambra-1-/- per verificare le complesse interazioni fra apoptosi ed autofagia nel modello murino; e) un analisi dell espressione di Ambra-1 in campioni istologici di animali Tg2576 (modello murino di AD); f) un analisi dell espressione di Ambra-1 in campioni istologici di liquor e tessuti di pazienti AD. Oltre alla dissezione molecolare alla base dell ontogenesi dei processi neurodegenerativi mediati dall apoptosoma, una chiara conseguenza di questi studi è la possibile identificazione di Ambra-1 come bersaglio diagnostico e farmacologico in condizioni neurodegenerative, nonché la delucidazione del pathway autofagico eventualmente attivo nell AD ed in altre patologie neurodegenerative