I bastoncelli retinici come cellule altamente specializzate nella fotoricezione: individuazione e caratterizzazione del metabolismo del cadpr

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1 Università degli Studi di Genova Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Biologiche I bastoncelli retinici come cellule altamente specializzate nella fotoricezione: individuazione e caratterizzazione del metabolismo del cadpr di Andrea Fabiano Relatore Alessandro Morelli A.A

2 Parte 1 : L occhio e la visione L occhio è quella struttura, evolutasi indipendentemente in molti phylum animali, predisposta alla fotorecezione dei fotoni di luce per trasdurli in segnali elettrici che possono essere interpretati dal sistema nervoso centrale. I meccanismi che operano la trasduzione visiva si basano su un insieme di molecole proteiche altamente conservate le quali permettono di assorbire la luce sulla superficie dei fotorecettori e di catturare così l energia dei fotoni contenuta al loro interno. 1.1 Evoluzione dell occhio La natura fisica della luce ha condizionato fortemente l evoluzione dell organizzazione strutturale dell occhio, la cui funzione è quella di produrre immagini. Nel corso dell evoluzione sono stati messi a punto molti possibili disegni strutturali che hanno portato ad organizzazioni dell occhio simili in specie animali non affini, ad esempio per quanto riguarda l occhio dei calamari e dei pesci, che pur essendo due animali filogeneticamente distanti condividono lo stesso habitat. Questo dato però non è assoluto perché anche l occhio dell uomo è molto simile a quello del pesce per convergenza, pur non vivendo nello stesso ambiente. L evoluzione dell occhio può essere distinta in due tappe fondamentali. Inizialmente in tutti i principali gruppi animali si sono sviluppate delle strutture semplici definite macchie oculari, costituite da una fossetta aperta rivestita da pochi recettori e contenente cellule pigmentate schermanti. Queste macchie oculari forniscono informazioni sulla direzione delle sorgenti di luce e sulle variazioni della sua intensità, ma non immagini ben dettagliate. Però per riconoscere le figure e controllare l attività motoria, gli animali hanno bisogno di occhi con un sistema ottico capace di limitare la parte del campo visivo rilevata da un singolo fotorecettore e di formare immagini. Questa tappa dell evoluzione è avvenuta solo in 6 phyla dei 33 presenti nei metazoi; ma gli animali che fanno parte di questi 6 phyla rappresentano il 96% di tutte le specie viventi, quindi si può arrivare a dire che il possedere occhi conferisca un notevole vantaggio in termini di evoluzione. 6

3 In particolare l occhio di vertebrato possiede un apertura relativamente piccola e una lente; queste due caratteristiche permettono la formazione di in immagine di ottima qualità, che viene messa a fuoco nella parte posteriore dell occhio sullo strato dei fotorecettori della retina [Randal, Fisiologia animale] 1.2 L occhio dei vertebrati superiori Nell occhio dei vertebrati, la luce incidente è messa a fuoco in due fasi: nella fase iniziale i raggi di luce incidente sono prima rifratti dalla superficie chiara ed esterna dell occhio chiamata cornea, successivamente attraversano una seconda struttura, chiamata cristallino, una sorta di lente biconvessa di tessuto connettivale immerso in una matrice fortemente proteica trasparente, la cui funzione è quella di ricreare un immagine invertita sulla superficie interna posteriore dell occhio, la retina. Figura 1.1 : Morfologia dell occhio e orientamento delle cellule della retina inversa di vertebrato. Nei vertebrati superiori né il cristallino né la retina possono essere spostati, come invece avviene nei pesci ossei, ma l immagine viene messa a fuoco variando la curvatura e lo spessore del cristallino; in questo modo, infatti, cambia la distanza a cui l immagine, che passa attraverso di esso, viene messa a fuoco, chiamata distanza focale della lente. 7

4 Figura 1.2 : Modificazione del cristallino in base all angolo di incidenza della luce La forma del cristallino si modifica in seguito alle variazioni della tensione esercitata sul suo perimetro. Il cristallino è mantenuto sospeso nell occhio dalle fibre della zonula, orientate radialmente. Queste fibre esercitano sul loro perimetro una tensione diretta verso l esterno e le fibre dei muscoli ciliari, orientate radicalmente, regolano la quantità di tale tensione. Quando i muscoli ciliari sono rilasciati, il cristallino è relativamente appiattito per la tensione elastica esercitata dalle fibre della zonula che ne tira il perimetro verso l esterno, e gli oggetti lontani dall occhio sono messi a fuoco sulla retina; quelli vicini, viceversa, sono sfocati. Gli oggetti vicini sono, infatti, messi a fuoco sulla retina quando i muscoli ciliari si contraggono riducendo la tensione esercitata sul cristallino che diventa più rotondo. Questo processo è chiamato accomodazione ed è utilizzato per la messa a fuoco di oggetti vicini. La quantità di luce che entra nell occhio è discriminata dalla presenza dell iride, un sottile muscolo liscio, ricco di pigmento che determina anche la colorazione dell occhio. L iride presenta una forma circolare con un orifizio al suo interno, chiamato pupilla, il cui diametro è regolato da contrazioni variabili dei muscoli dell iride, il minor o maggior diametro della pupilla determina una minore o maggiore quantità di luce che raggiunge la retina. La porzione posteriore dell occhio, quella su cui viene proiettato il raggio luminoso, è una struttura pluristratificata composta di tre tessuti specializzati : Sclera : la tunica esterna del bulbo oculare formata principalmente da fasci di fibre connettivali sovrapposti in molti strati e costituisce la porzione bianca dell occhio nell uomo ; riveste un ruolo strutturale oltre a partecipare alla formazione della cornea nella porzione anteriore dell occhio ; Coroide : la tunica mediana ricca di vasi sanguinei che irrorano la retina è ricca di pigmenti e nella porzione anteriore forma il corpo cigliare e l iride ; 8

5 Retina : la tunica più interna, formata da tessuto di origine neuroectodermico, costituito da dieci diversi strati di cellule nervose, comprendenti le cellule a cono e bastoncello, deputate dal riconoscimento dello stimolo luminoso, intimamente connesse con cellule epiteliali, dette lamina pigmentosa. 1.3 Anatomia della retina La retina dei Vertebrati, di tipo invertito, costituisce la porzione fotosensibile dell occhio. Nelle sue sezioni traverse si riconoscono, al microscopio ottico, i seguenti 10 strati : epitelio pigmentato ; strato bacillare (fotorecettori) ; membrana limitante esterna ; strato granulare esterno (ONL) ; strato plessiforme esterno (OPL) strato granulare interno (INL) ; strato plessiforme interno (IPL) ; strato delle cellule gangliari (GCL) ; strato delle fibre nervose ottiche (OFL) ; membrana limitante interna. 9

6 Figura 1.3 : Schema rappresentativo della posizione delle cellule dei diversi strati. Colorazione in Ematossilina-eosina di sezione di retina L epitelio pigmentato deriva dal foglietto esterno del calice ottico, tutti gli altri strati dal foglietto interno. I corpi cellulari dei neuroni identificabili nella retina (fotorecettori, cellule bipolari, orizzontali, amacrine, interplessiformi, gangliari) sono disposti in tre strati, fra i quali si interpongono due fasce di sinapsi (interna ed esterna). Lo strato esterno contiene i fotorecettori (cellule dei coni e dei bastoncelli), quello interno le cellule gangliari, quello intermedio tutti gli altri tipi cellulari (cellule bipolari, orizzontali, amacrine, interplessiformi). La retina presenta quindi 5 tipi fondamentali di neuroni organizzati nei tre strati nucleari e fra loro interconnessi. Le informazioni fluiscono non solo in senso verticale dai fotorecettori alle cellule bipolari e alle cellule gangliari, ma anche orizzontalmente, per l intervento delle cellule orizzontali nello strato plessiforme esterno e delle cellule amacrine nello strato plessiforme interno. Oltre ai fotorecettori e ai tipi neuronali in precedenza ricordati esistono nella retina anche cellule gliali, fra cui le più singolari sono le cellule di Muller che occupano, in altezza, tutto lo spessore della lamina interna della retina [Baldacchini, Anatomia Comparata]. 10

7 La trasmissione dell informazione luminosa, che colpisce la retina, coinvolge un complesso circuito sinaptico che vede nello strato plessiforme esterno la formazione di sinapsi tra coni e bastoncelli sulle cellule bipolari e orizzontali, con sinapsi sia di tipo chimico sia di tipo elettrico. Le cellule bipolari contattate sono di tipo differente a seconda del fotorecettore coinvolto; i coni inoltre formano sinapsi morfologicamente differenti su due tipi di cellule bipolari; le centro-on e le centro-off rispettivamente con sinapsi invaginate e sinapsi piatte. Le cellule bipolari dei bastoncelli non contattano direttamente le cellule gangliari, ma formano sinapsi sulle cellule amacrine le quali si connettono con le cellule gangliari centro-off e con le bipolari centro-on. Figura 1.4 : Schema della popolazione cellulare della retina e loro orientamento 11

8 Parte 2 : I fotorecettori 2.1 Generalità sui fotorecettori I fotorecettori sono neuroni specializzati, che si trovano sulla retina e svolgono un'importante funzione di trasduzione, cioè sono in grado di trasformare il segnale luminoso, che arriva sul fondo dell'occhio, in informazione chimica e quindi elettrica, che giungeranno al cervello attraverso il nervo ottico. Costituiscono circa il 70% della popolazione cellulare della retina di mammifero [Curcio, C. et al., 1990]. La sensibilità dei fotorecettori presenti nell occhio dei vertebrati si approssima al limite ultimo stabilito dalla natura quantica della luce. Inoltre il loro campo d azione è straordinariamente vasto, dalla luce più intensa tollerabile a quella appena più fioca percettibile. In confronto però con altri recettori, come ad esempio i trasduttori acustici, la velocità di risposta di quelli visivi è molto più bassa. 2.2 Caratteristiche citologiche e strutturali I fotorecettori sono distinti in coni e bastoncelli, così chiamati per la loro forma. Coni : si concentrano, nell uomo, maggiormente nella zona centrale della retina (fovea) e sono deputati alla visione dei colori (fotopica), si distinguono in tre tipi : I) rossi tipo L), II) blu (tipo S), III) verdi (tipo M) in base alla lunghezza d onda che assorbono, grazie alla presenza in essi di un particolare pigmento sensibile ad una delle tre lunghezze d onda. In un occhio sono presenti all incirca 6-7 milioni di queste cellule ; Bastoncelli : si concentrano invece nella zona periferica della retina e sono deputati alla visione al buio (scotopica) e sono più sensibili al movimento. Sono di un unico tipo, testimoniato dalla presenza di un solo tipo di pigmento visivo (la rodopsina) e sono molto più numerosi dei coni (circa 120 milioni). Anche se i due tipi di recettori mostrano funzioni diverse, questi presentano un uniformità strutturale molto elevata. Infatti, sia i coni che i bastoncelli sono cellule 12

9 allungate, orientate parallelamente alla direzione della luce e sono costituite da tre porzioni principali: Segmento esterno (Outer Segment) : caratterizzato da strutture membranose, dette dischi (nei bastoncelli), su cui sono posizionati i pigmenti visivi, che reagiranno allo stimolo luminoso. Questa parte è a diretto contatto con l epitelio pigmentato, che contiene melanina in grado di assorbire la luce non trattenuta dalla retina ; Segmento interno (Inner segment) : caratterizzato dalla presenza di organelli citoplasmatici, come ad esempio mitocondri, apparato di Golgi, indispensabili per il metabolismo cellulare e la produzione dei pigmenti visivi, ed il nucleo ; Terminazione sinaptica : regione che permette la trasmissione dei segnali dal fotorecettore alle cellule bipolari, tramite sinapsi di tipo chimico. Il segmento interno ed esterno sono connessi da un cilium non mobile, costituito da microtubuli con struttura ad assonema tipo 9+0 [Yoshida M. Molecular Phisiol. Of retinal proteins]. Il segmento interno è la parte metabolicamente più attiva, vista la presenza di numerosi organelli citoplasmatici, mentre il segmento esterno è la sede dove avviene la prima parte del processo visivo, grazie alla presenza dei dischi, posti ad una distanza reciproca di 30nm [Chabre et al., 1977 ; Van Breugel P., 1977], che si formano per progressiva invaginazione della membrana plasmatica alla base del cilium. Durante tale processo la membrana si inverte, cosicché il versante extracellulare della membrana plasmatica diviene la faccia interna del disco [Steinberg et al., 1980]. Nei coni dei mammiferi, il lume di ogni lamella si apre verso l esterno della cellula mentre, nei bastoncelli, le lamelle si invaginano completamente così da formare dei sacchi appiattiti, o dischi, disposti a strati l uno sull altro all interno del segmento esterno. Solo nei bastoncelli i dischi si rinnovano continuamente, infatti quelli più distali vengono estrusi e fagocitati dalle cellule pigmentate. Esiste quindi una chiara compartimentazione intracellulare dei bastoncelli : la pila compatta dei dischi, in un numero variabile da 600 a 2000 [Young et al., 1985], occupa la maggior parte del volume del segmento esterno, suddividendone il citoplasma in uno spazio interdiscale di 15 nm, che comunica soltanto agli estremi con lo strato continuo 13

10 extradiscale al di sotto della membrana esterna, e lo spazio intradiscale dello spessore di 2 nm. Lo spazio intradiscale ha una composizione ionica simile a quella extracellulare poiché il disco, come già detto, deriva dall invaginazione della membrana citoplasmatica. Figura 2.1 : Rappresentazione schematica di un bastoncello e di un cono, con le relative strutture caratterizzanti (Da Istologia, Gartner e Hiatt). Legenda : OS segmento esterno, C zona di connessione, BB corpo basale, Ce centriolo, IS segmento interno, M mitocondrio, RS regione sinaptica SV vescicole sinaptiche, NR regione nucleare La componente proteica più cospicua della membrana del segmento esterno (80%) è costituita dalla rodopsina (circa 3x10 9 molecole/ros) [Hamm et al., 1986], un pigmento visivo componente intrinseco della membrana dei dischi. Le altre proteine che si trovano in maggior quantità nei bastoncelli sono una fosfodiesterasi specifica per il cgmp e la trasducina, una G-protein. Una delle principali caratteristiche di queste membrane è l elevato grado di insaturazione (più del 50%) che presentano le catene degli acidi grassi dei fosfolipidi. Tale 14

11 insolita composizione può essere in parte spiegata come elemento di facilitazione dei movimenti traslazionali delle proteine intrinseche ed, in particolare, della rodopsina [Liebman et al., 1974], che deve subire rapidi riarrangiamenti conformazionali in seguito all assorbimento di energia luminosa. La cascata di eventi innescata da una singola molecola di rodopsina foto-eccitata si svolge entro un solo spazio interdiscale ; solo piccole molecole con ruolo di messaggero o di metabolita (ATP, GTP, cgmp, Ca 2+ ) si spostano rapidamente tra i compartimenti interdiscali [Chabre et al., 1989]. 2.3 Fisiologia e biodiversità Coni e bastoncelli presentano una diversa sensibilità alla luce, riconducibile alla rispettiva organizzazione del lavoro. Il lavoro dei coni è individuale, cioè ciascuno di essi genera un impulso che è avviato al cervello indipendentemente. Nel caso dei bastoncelli, invece, diverse migliaia di elementi convergono su un singolo interneurone e l'impulso che viene inviato al cervello emerge dalla sommatoria di tutti i singoli impulsi. I bastoncelli risultano così circa 4000 volte più sensibili alla luce rispetto ai coni. Questa diversità è alla base della teoria della duplicità visiva secondo cui i bastoncelli, molto sensibili e attivati da una luce a bassa intensità, sarebbero responsabili della visione notturna (scotopica) nei toni del grigio, mentre i coni, stimolati solamente da luce relativamente intensa, presiederebbero alla visione diurna (fotopica), permettendo una migliore discriminazione visiva e una visione a colori. 15

12 Figura 2.2 : Spettro di assorbimento dei tre tipi di coni e dei bastoncelli (Da In specie diverse di vertebrati queste differenze funzionali sono sfruttate in modo selettivo per acquistare particolare capacità visive; in particolare nei mammiferi il gradiente di densità dei fotorecettori ha una simmetria radiale. Un importante caratteristica della retina di questi animali è la presenza della fovea, o area centralis, ovvero una piccola zona centrale della retina che fornisce informazioni dettagliate sul campo visivo, cioè è specializzata per la massima acuità visiva. Nell uomo e negli altri mammiferi dotati di visione a colori, la fovea contiene soltanto coni, in modo particolare sono maggiormente presenti i coni L (rossi) ed M (verdi), mentre quelli S sono in netta minoranza. Mentre il resto della retina contiene sia bastoncelli che coni, anche se i primi sono più numerosi. Esistono poi zone della retina in cui i fotorecettori sono completamente assenti, come: il punto cieco o papilla (da cui inizia il nervo ottico), l ora serrata, la retina che riveste l iride, il corpo ciliare, o regioni in cui si ravvisano particolari specializzazioni come nell area maculare. 16

13 Figura 2.3 : Distribuzione dei tre tipi di coni nella fovea umana : i coni S sono in netta minoranza rispetto a cono di tipo L ed M (figura tratta da /ipertesti/visione/index.htm). I tre tipi di coni non contribuiscono ugualmente alla sensazione di intensità luminosa: a questa contribuiscono prevalentemente i coni L ed M (in modo additivo), mentre i coni S hanno una forte valenza cromatica. Può sorprendere il fatto che abbiamo due pigmenti con sensibilità spettrali così simili, mentre il terzo è molto differenziato. Tra i mammiferi (tricromati) questa proprietà è presente nelle scimmie del vecchio mondo e nell uomo, mentre nella maggioranza degli altri mammiferi la retina contiene solo due tipi di coni (dicromati) : uno di tipo S, cioè con sensibilità massima nell ambito delle corte lunghezze d onda, e uno con sensibilità spettrale intermedia tra quelle dei coni M e L dell uomo. Figura 2.4 : Schema di percezione dei colori con due soli coni. Gli animali che hanno questo tipo di percezione dei colori (dicromati) identificano i frutti in base a sfumature di verde (figura tratta dal sito Ma quindi perché l'uomo ed alcune specie di scimmie sono tricromati e non dicromati, dal momento che anche con due soli tipi di coni potrebbero fornire la 17