Università degli Studi di Napoli Federico II

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1 Università degli Studi di Napoli Federico II FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA DELLE PRODUZIONI MARINE TESI SPERIMENTALE IN CITOLOGIA E ISTOLOGIA Stress ossidativo nei giorni di vita commerciale di Sparus aurata Relatore Prof. GAETANO CIARCIA Candidato ANGELA SANTUCCI Matr. 574/40 ANNO ACCADEMICO

2 CAPITOLO 1 Introduzione 1.1. Specie reattive dell ossigeno (ROS) e stress ossidativo L ossigeno (O 2 ) è una molecola fondamentale nei principali processi biochimici degli organismi aerobi, ma allo stesso tempo il suo consumo porta alla formazione di specie reattive dell ossigeno (ROS) potenzialmente tossiche, responsabili di danni ad ogni tipo di macromolecola biologica, quali cellula, tessuto o organo. Nelle cellule sane i mitocondri (Fig.1) consumano più del 90% dell ossigeno cellulare e Fig.1. Il mitocondrio sede dei ROS. sono considerati la maggior sede di produzione cellulare aerobica dei ROS (Boveris e Chance, 1973; Staniek e Nohl, 1999; Lenaz, 1998; Han et al., 2001). Nel mitocondrio, infatti, circa l 1-4% dell ossigeno non viene convertito correttamente in due molecole d acqua a causa della dispersione di elettroni che risulta da imperfezioni nella catena respiratoria (Fig.2). 1 O 2 hv H+ +e OO O2 +e +e +e +e OH H+ O2 H+ H2O2 H+ H+ H2O Reazione completa: O2 + 4e - 4H + 2H2O Fig.2. Reazioni di riduzione univalenti di ossigeno ad acqua con formazione di ROS. 1

3 Inoltre, i ROS sono generati anche da sistemi microsomali del reticolo endoplasmatico (Chu e LA Peyre, 1993; Winston et al., 1996) e da varie reazioni enzimatiche ossidasi mediante la riduzione univalente dell ossigeno molecolare ad anione superossido (O 2 ), a causa della fuga di elettroni dalla NADPH citocromo P450 reduttasi, dalla ipoxantina/xantina ossidasi, dalla NADPH ossidasi, dalla lipo-ossigenasi e dalla ciclo-ossigenasi. L anione superossido può portare alla produzione di altri proossidanti, come perossido di idrogeno (H2O2), radicale idrossile (OH ), ossigeno singoletto ( 1 O 2) (Fig.3) (Babior M., 1984). Fig.3. Attività delle specie reattive dell ossigeno (ROS). Il radicale idrossile e l anione superossido sono definiti radicali liberi dell ossigeno in quanto sono specie chimiche capaci di un esistenza indipendente (da questo il termine libero) che contengono uno o più elettroni spaiati sull orbitale più esterno. Tale disposizione rende queste specie chimiche molto instabili e molto più reattive dell atomo o della molecola da cui derivano. Pertanto, i radicali liberi tendono a legarsi e a reagire con altre molecole, creando nuovi radicali instabili e dando inizio a reazioni a catena che finiscono per modificare e quindi danneggiare le strutture biologiche cellulari (lipidi di membrana, proteine, acidi nucleici, carboidrati). 2

4 Il perossido di idrogeno e l ossigeno singoletto, invece, sono definiti ROS non radicalici (non hanno cioè elettroni spaiati sull orbitale più esterno) capaci di ossidare biomolecole, quindi hanno un comportamento biologico similare ed altrettanto dannoso. Quando i radicali liberi reagiscono con i non radicali, il risultato è un nuovo radicale libero capace di estendere e propagare il danno, in una reazione a catena in grado di automantenersi ed amplificarsi. Il termine ROS include anche ozono (O 3 ), idrogeno (H ), ossigeno (O + ), perossidi lipidici (LOOH), radicale alcossile (LO ), radicale perossile (LOO ), ossido nitrico (NO ), diossido di azoto (NO 2 ), nitrito perossile (ONOO ), acido ipocloroso (HOCl), radicale tiilico (GS ) (Fridovich, 1978). I radicali liberi possono essere elencati mediante i potenziali di reazione di un unico elettrone in millivolts (mv) a ph 7.0 (Tab.1). Radicali mv. OH (idrossile) LO (alcossile) LOO. (perossile) GS (glutatione) HU - (urato) Toc (tocoferolo) Asc - (ascorbato) +282 Fe 3+ -EDTA +120 Tab.1. Potenziale di reazione dei radicali La forma ridotta di ogni radicale è capace di neutralizzare (ridurre) i radicali liberi che hanno un potenziale più alto. Come si può osservare dalla tabella il radicale idrossile ( OH) ha il potenziale più alto ed è il più distruttivo (reattivo) dei radicali liberi biologici. 3

5 Contro l instabilità dei ROS ed i loro effetti dannosi sulle cellule e sui tessuti, i pesci, come altri vertebrati, possiedono un sistema di difesa antiossidante il quale utilizza meccanismi enzimatici e non-enzimatici. Quando l attività di questi sistemi di difesa antiossidanti non riesce a neutralizzare o a limitare il danno dei ROS determina uno stato di stress detto stress ossidativo (Selye, 1950). Lo stress ossidativo implica l aumento della produzione intra- ed extracellulare di ROS e di conseguenza ossidazione lipidica, frammentazione e ossidazione delle proteine e danno al DNA Ossidazione lipidica L ossidazione lipidica è definita come deterioramento ossidativo dei lipidi polinsaturi dovuto all azione dei radicali liberi (Vossen et al., 1993). Nei pesci i lipidi sono caratterizzati da alti livelli di acidi grassi polinsaturi a catena lunga (ω-3 PUFA) che sono molto suscettibili al deterioramento sia da ossidazione che da idrolisi. I doppi legami in PUFA contengono idrogeni con legame di energia che in presenza delle specie reattive dell ossigeno o di altri radicali liberi, li rendono altamente suscettibili alle reazioni di estrazione dell'idrogeno che iniziano e propagano una reazione a catena conosciuta generalmente come autossidazione (Gardner, 1989; Porter et al.,1995). L autossidazione rappresenta il principale meccanismo di ossidazione lipidica negli alimenti che porta alla produzione di idroperossidi (LOOH) (Frankel, 1985). La temperatura, l area della superficie del lipide esposto all aria e i metalli di transizione, quale rame e ferro, sono inoltre i fattori che possono influenzare la velocità di ossidazione. L autossidazione dei lipidi procede mediante un meccanismo a catena che implica tre successivi step: 1) la fase di iniziazione cioè di innesco e di formazione dei primi radicali liberi e dei corrispondenti idroperossidi; 2) la fase di 4

6 propagazione delle reazioni a catena dei radicali liberi con formazione degli idroperossidi; 3) la fase di terminazione ovvero di incontro tra i radicali liberi con formazione di prodotti non-radicali (Fig. 4). Fig.4. Illustrazione schematica del processo dell ossidazione lipidica. LH = lipide insaturo, X = iniziatore, L = radicale alchilico, LO = radicale alcossile, LOO = radicale perossile, LOOH = idroperosside, AH = antiossidante. L ossidazione lipidica è influenzata da diversi sistemi catalitici per l attivazione dell ossigeno. Per superare la restrizione del movimento rotatorio tra lo stato di base dell ossigeno e dei lipidi, la reazione richiede l iniziazione (o l iniziatore: X ) che può essere l attivazione dello stato di base dell ossigeno (³O 2 ) nell ossigeno singoletto (¹O 2 ), superossido (O 2 ), radicale ossidrile (HOO ), o perossidi (LOOH), o trasformazione di lipidi insaturi nei radicali lipidici (L ). Iniziazione: Propagazione: LH + O 2 ---> L + OH L + O 2 ---> + LOO LOO + LH ---> L + LOOH LOOH ---> LO + HO Terminazione: L + L ---> L--L L + LOO ---> LOOL LOO + LOO ---> LOOL + O 2 5

7 Nella maggior parte dei casi, l autossidazione inizia in presenza di iniziatori con l estrazione di un atomo di idrogeno da un gruppo metilene allelico di un acido grasso insaturo per produrre il radicale libero. Successivamente, la reazione procede attraverso le reazioni di propagazione, durante le quali i radicali liberi vengono convertiti in altri radicali per via di una reazione a catena che consuma ossigeno e produce nuove specie di radicali liberi (radicali perossili). Le reazioni a catena di propagazione sono un processo continuo finchè i lipidi insaturi o le molecole di acido grasso sono disponibili (Gordon, 1990; Jadhav et al., 1996). Infine, nella reazione di terminazione due radicali liberi si combinano per produrre i non-radicali. Nella fase di propagazione quando i radicali lipidici reagiscono con l ossigeno, si formano gli idroperossidi lipidici (Fig.5). Fig.5. Attacco di un acido grasso da radicale libero. Un radicale dell ossigeno può iniziare una reazione a catena che si conclude con la conversione di centinaia di catene laterali degli acidi grassi in idroperossidi lipidici (Halliwell, 1991). Essi sono relativamente stabili a causa della presenza di alcuni metalli allo stato ionico e si demoliscono già nel periodo di induzione della reazione, dando origine a radicali alcossilici (LO ). 6

8 La transizione degli ioni metallo (Me), come ferro e rame, come pure componenti ematici catalizzano la loro decomposizione sia durante l ossidazione che durante la riduzione: LOOH + Me n+ LO + OH + Me n+1 LOOH + Me n+1 LOO + H + + Me n+ L accumulazione di idroperossidi lipidici in una membrana cellulare altera la sua fluidità, fa crollare la sua funzione, ed eventualmente la fa collassare (Halliwell, 1991; Martinez-Cayuela, 1995). Le transizioni degli ioni metallo, quindi, sono importanti proossidanti per l inizio dell ossidazione lipidica. Nei tessuti biologici come il muscolo dei pesci, altri componenti come proteine, aminoacidi e ascorbato possono interagire con questi radicali liberi per terminare la reazione. I componenti diversi dai lipidi che terminano la reazione sono spesso definiti come antiossidanti. L energia di attivazione dell ossidazione lipidica è molto più alta in presenza di antiossidanti perché essi abbassano il livello di ossidazione aumentando l energia di attivazione (Frankel, 1998a). 7