Trasduzione del segnale

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1 Trasduzione del segnale

2 La comunicazione intercellulare: trasmettitori e recettori La comunicazione tra cellule permette agli organismi di adattarsi in modo coordinato e continuo alle variazioni ambientali. Le cellule comunicano mediante mediatori chimici di natura molto varia Il mediatore viene prodotto e secreto da un tipo cellulare La cellula cui è destinata la comunicazione, cellula bersaglio, ha recettori in grado di riconoscere il mediatore

3 Trasduzione del segnale Il legame del ligando al recettore attiva una serie di eventi denominati nel complesso trasduzione del segnale. Il trasferimento del segnale all interno della cellula ha come risultato l induzione di risposte cellulari specifiche e/o cambiamenti nell espressione genica.

4 Interazioni farmaco-recettore Il binding di un ligando a un recettore causa una risposta positiva o negativa. Una risposta positiva può essere o un immediato effetto fisiologico (apertura di un canale ionico) oppure una serie di eventi biochimici che generano una appropriata risposta biologica.

5 Ligando e recettore N(CH 3 ) 2 N(CH 3 ) 2 Legame dipolo-dipolo O Leg. idrofobico O O Interaz. ione-dipolo HO HO O 2 N Complesso con trasferimento di carica Cl N H N + Legame idrogeno NH 2 COO- Legame ionico

6 Cascata di segnali Ligando Recettore Il segnale viene trasferito all appropriato comparto cellulare Trasdotto in forma riconoscibile Modulazione Amplificato Distribuito a più di un bersaglio intra-cellulare Amplificazione Divergenza Modulato Regolazione del metabolismo Regolazione dell espressio ne genica Riorganizzazio ne del citoscheletro

7 In base alla localizzazione subcellulare si distinguono: Recettori di membrana Recettori intracellulari Trasduzione di segnali indotti da mediatori idrofilici: Neurotrasmettitori Fattori di crescita Citochine Trasduzione di segnali indotti da mediatori lipofilici: Ormoni steroidei e tiroidei Acido retinoico Vitamina K

8 I RECETTORI canali Acetilcolina (nicotinici) ATP/UTP (P2X) Glutammico/Aspartico (NMDAR, Kainato,AMPAR) Glicina Serotonina (5HT3) Recettore di membrana 1TM CITOCHINE FATTORI di CRESCITA Insulina, GH, PRL, EPO Attivina, AMH, TNF, Toll-like N 7TM CHEMOCHINE PROSTAGLANDINE LEUCOTRIENI, TROMBOSSANI ORMONI PEPTIDICI (ACTH, ADH, Angiotensina, Bradichinina, adrenalina, calcitonina, glucagone, ossitocina, paratormone, TSH.)

9 Recettori Canale complessi macroproteici transmembranari che formano un canale ionico (aperto dal legame con il neurotrasmettitore o con farmaci agonisti) e consentono il passaggio di ioni lungo gradiente

10 Recettori Canale Oligomeri formati da 3, 4 o 5 subunità che si organizzano a formare un poro canale per cationi o per anioni. La loro apertura può determinare depolarizzazione o iperpolarizzazione, rapidi cambiamenti delle concentrazioni ioniche intracellulari e del potenziale elettrico transmembranario A. Lo stimolo efficace modula una corrente ionica (corrente di recettore, cdr). B. La cdr genera un potenziale di recettore (pdr) graduale simile ai potenziali postsinaptici. C. Il pdr modula la scarica di potenziali d azione nelle fibre nervose afferenti dirette al SNC.

11 Recettori accoppiati a proteine G (GPCR) I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana.

12 Unica catena polipeptidica che attraversa sette volte la membrana tre loops extracellulari e tre intra. Aminoacidi e ioni Lipidi Diversi sistemi effettori: Enzimi Canali ionici Proteine di trasporto Amine biogene Peptidi e proteine N E1 E2 E3 α GDP β γ C

13 I trasduttori dei recettori di membrana: Le Proteine G MONOMERICHE Ras, Rho, Rab, Arf, Ran ETEROTRIMERICHE GDP α β γ

14 PROTEINE G eterotrimeriche: CICLO di FUNZIONAMENTO trasduttore Recettore 7TM α GDP β γ α GDP β γ α GDP β γ GTP α GTP β γ α GTP β γ effettore Pi α GDP β γ

15 trasduzione dei recettori 7TM: PROTEINE G eterotrimeriche gli effettori di α e βγ aq GTP GTP ai GTP a b g GDP a as GTP b g a12 GTP canali PI3K PLCb AC RISPOSTE FISIOLOGICHE: Proliferazione, Differenziazione Sviluppo Sopravvivenza Angiogenesi Ipertrofia cancro +PLCb -AC +AC Rho regolazione della espressione genica DAG Ca 2+ PKCs camp camp Fattori di trascrizione nucleo

16 La trasduzione del segnale del camp L adenilato ciclasi può essere condivisa da recettori diversi A s A i Adenilato R 1 Ciclasi R 2 G s + - G i GDP GTP ATP GTP GDP camp Proteina Reg C C Reg Protein Kinasi A inattiva (PKA) + C C PKA attiva Pi Proteina

17 Un esempio di trasduzione tramite camp L ADH trasduce il segnale tramite camp nelle cellule principali della porzione distale del tubulo e del dotto collettore renale

18 L attivazione delle PLCb e g porta alla sintesi di IP3 (che provoca rilascio di Ca 2+ ) e di DAG; insieme attivano le PKC R PLCb G PIP q 2 DAG PKC IP3 Reticolo endoplasmatico Ca 2+ CaM PKC

19 La trasduzione del segnale affidata al Ca 2+ : le CaM 4 Ca 2+ si legano alle Ca 2+ -binding proteins chiamate CALMODULINE, CaM La Ca 2+ /CaM si lega ad altre proteine variandone l attività funzionale Ca 2+ Forma estesa Forma più compatta Ca 2+ /CaM legata alla proteina bersaglio

20 La trasduzione del Ca 2+ : le CaMKs La via delle chinasi Ca 2+ -calmodulina-dipendente Ca 2+ CaM CaMKK CaMKI CaMKIV substrati MAPK nucleo Fattori di trascrizione

21 Regolazione del Ca 2+ nelle cellule La concentrazione di Ca 2+ nel citosol è tenuta bassa dall azione delle calcio-atpasi del RE, mambrana plasmatica, scambiatori Na + / Ca 2+ e dei mitocondri. L aumento delle concentrazioni nel citosol è dovuto all apertura dei canali nella membrana e al rilascio attraverso i recettori canali IP3 o i recettori sensibili alla rianodina presenti nel RE.

22 le PKC: importanti protein chinasi della trasduzione sono classificate in base alla loro struttura e regolazione DAG/PMA Ca 2+ ATP substrato cpkc= convenzionali (a bi bii g) DAG/PMA ATP substrato npkc= nuove (d e q h) ATP substrato apkc= atipiche (l z i) Dominio regolatorio Dominio catalitico

23 PROTEINE MONOMERICHE Ras attivato lega la chinasi RAF (una MAPKKK) GTP Ras ATP PKC (MAPKKKK) Raf localizzato sulla membrana Raf Pi ADP MEK (MAPKK) Raf inattivo e citosolico Raf ERK (MAPK) Attivazione di substrati citosolici e di fattori di trascrizione nucleari

24 Spegnimento della subunità a della proteina G La subunita α è dotata di una attività GTPasica intrinseca: idrolizza GTP a GDP e Pi e si riassocia alle subunità βγ per riformare la proteina G inattiva

25 Le proteine RGS (regolatrici della segnalazione della proteina G) Sono proteine che attivano la GTPasi Ruolo cruciale nello spegnimento di risposte mediate da proteine G Circa 25 proteine codificate nel genoma umano: ognuna interagisce con una serie di proteine G

26 1. disaccoppiamento recettore-proteine G in risposta alla fosforilazione del recettore tramite le GRK (G proteincoupled receptor Kinase) La fosforilazione tramite GRK spesso non è sufficiente per inattivare completamente i recettori; la completa inattivazione richiede un componente addizionale, l arrestina α β γ P P P α β γ -arrestina β GRK

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28 RECETTORI 1TM: OLIGOMERIZZAZIONE FUNZIONALE U U U U U U R1 R2 U U U U Proteine Effettrici della Trasduzione effettore effettore DOCKING

29 Funzionamento di recettori 1TM della tipologia tirosin-chinasici: la trasduzione del segnale tramite la via MAPK insulina GTP SOS P P GRB2 P P Ras attivo Recettore inattivo attivo

30 Chinasi a cascata La cascata raf Mek-1 Erk-1 è un esempio di MAP chinasi a cascata. È stato descritto un certo numero di queste cascate, e sebbene utilizzino chinasi specifiche, le catene di trasduzione sono molto simili Fattore di Crescita Stress Citochine N.B. La modalità di attivazione della prima chinasi della cascata varia e dipende dal segnale MAP chinasi chinasi chinasi raf Mekk1 MLK3 Chinasi Serina/treonina ATP ATP ATP ADP ADP ADP MAP chinasi chinasi Mek1 MKK4 MKK7 Chinasi a specificità duale ATP ATP ATP ADP ADP ADP MAP chinasi Erk1 Jnk1 Jnk2 Chinasi Serina/treonina

31 Recettore classico per il fattore di crescita EGF. Unico segmento transmembrana, Con la porzione intracellulare ad attività tirosin-kinasica. In seguito ad attivazione, si ha dimerizzazione e fosforilazione incrociatadi residui tirosinici. Formazione di siti di legame con domini SH2 per proteine citosoliche

32 Recettori per l adesione cellulare Trasmissione del segnale all interno della cellula per la regolazione di funzioni quali Movimento, proliferazione, sopravvivenza cellulare e trascrizione genica Immunoglobuline (ICAM-1, ICAM-2, VCAM, CD31) Mediano le interazione tra linfociti e cellule endoteliali Caderine partecipano alla formazione delle giunzioni aderenti Selectine espresse sui leucociti e cellule endoteliali. Migrano dal sangue all interstizio sottoendoteliale in presenza di infezione o danno tissutale. Integrine mediano l adesione delle cellule alle proteine della matrice extracellulare

33 Integrine inducono la formazione di complessi multimolecolari

34 RECETTORI AD ATTIVITA ENZIMATICA Recettore per le citochine I recettori delle citochine non presentano attività chinasica intrinseca ma, dopo attivazione, si associano a chinasi note come JAK (janus chinasi), che sono il primo passo nella cascata chinasica. Legame con la citochina- recettore che attrae una tirosinchinasi citosolica (Jak) che si associa e fosforila il dimero recettoriale. Fosforilazione STAT, traslocazione nel nucleo. Attivazione espressione genica.

35 Recettori decoy recettori che funzionano da trappole molecolari Recettori per le citochine che possiedono la sequenza che deve riconoscere il ligando, ma non possiedono il dominio intracellulare che è importante per la trasduzione del segnale. Derivano dai recettori per le citochine o per meccanismo di proteolisi o di splicing alternativo e possono restare ancorati alla membrana o possono essere secreti all'esterno della cellula.

36 Recettori decoy ABP (Acetilcolin Binding Protein) proteina di legame all'acetilcolina, omologa ai recettori tronchi che si comportano come trappole per i neurotrasmettitori. Regola la trasmissione colinergica andando a creare un equilibrio tra recettore vero, quello di membrana, e il recettore falso, quello trappola che può essere secreto nel vallo sinaptico. Tale recettore-trappola è ugualmente formato da 5 subunità ma la caratteristica è di non avere un canale, quindi non può trasdurre nessun segnale.

37 Recettori attivatori di apoptosi Recettori per TNF TNF-R1: espresso costitutivamente nella maggior parte dei tessuti e può essere attivato completamente sia dalla frazione di TNF legata alla membrana sia dalla forma trimerica solubile. TNF-R2: solo nelle cellule del sistema immunitario e risponde solo alla forma omotrimerica integrale del TNF.

38 CRDs In seguito al legame con il ligando si formano trimeri, con conseguente cambiamento conformazionale. DEATH DOMAIN 1) dissociazione della proteina inibitoria SODD dal dominio intracellulare detto di morte (Death Domain DD). 2) la proteina adattatrice TRADD è in grado di legarsi al DD: Attivazione di NF-kB Attivazione della via della MAP chinasi Induzione apoptosi

39 Recettori Toll-like recettori a singolo segmento transmembrana quando attivati, scatenano una risposta di tipo infiammatorio Le cascate di segnale dipendono dalla tipologia del recettore e possono coinvolgere numerosi mediatori tra cui le MAP-Kinasi e il fattore infiammatorio NF-kB.

40 Recettori con attività Guanilato ciclasica Recettori ad attività enzimatica con struttura semplice. Unica catena che attraversa la membrana una sola volta, con un dominio extracellulare che si lega ai ligandi e un dominio intracellulare che attiva la guanilato-ciclasi con la formazione del secondo messaggero GMP-ciclico (cgmp). ANFR GTP GC cgmp fosforilazion e di Ser43 e inibizione GTP Raf MEK Pi ATP PKCs ADP PKG PKG inattiva attiva il cgmp attiva la PKG GDP ERK PROLIFERAZIONE

41 Ossido di azoto e cgmp Ca 2+ Ca ++ CaM NO Stores Intracellulari del Ca ++ NO Sintetasi Ca ++ NO + Citrullina sgc GTP cgmp Guanilato Ciclasi Solubile PDE GMP Arginina Canali ionici Protein chinasi cgmp-dipendente (PKG)

42 Il legame dell acetilcolina alle cellule endoteliali stimola la produzione Di NO, che diffonde nelle cellule della muscolatura liscia adiacente e Stimola la guanilato ciclasi con conseguente rilassamento muscolare

43 i Recettori Nucleari 1. Recettori per gli ormoni STEROIDEI aldosterone, cortisolo, estradiolo, progesterone, testosterone 2. Recettore per la vitamina D3 attivata: VDR (1,25-diOH-colecalciferolo) N Recettore nucleare 3. J2R (15-deoxyD 12,14 -prostaglandina J 2 ) 4. Recettori per i retinoidi RXR (9-cis-acido retinoico) RAR (all-trans-acido retinoico) 5. Recettori epatici LXR ((7a-) (20-) (22-) (24-) (27-)-OHcolesterolo 6. Recettori per gli ormoni tiroidei TR (T3, T4)

44 i recettori nucleari per gli ormoni steroidei in assenza di ormone interagiscono con le proteine hsp (heat shock proteins) che ne mascherano il sito di legame per il DNA DNA Recettore Nucleare per gli steroidi hsp90

45 Attivazione della trascrizione genica operata da recettori nucleari per gli ormoni steroidei (ER) hsp50 hsp70 hsp90 ER E 2 ER hsp50 hsp70 hsp90 hsp50 hsp70 hsp90 ER ER HAT hsp90 hsp50 hsp70 ER ER TATA

46 Recettori Nucleari: Rimodellamento del nucleosoma tramite HISTONE ACETYLTRANSFERASES (HAT) & HISTONE DEACETYLASES (HDAC) Le acetilasi istoniche trasferiscono gruppi acetilici agli istoni e allentano le interazioni tra essi e il DNA, e tra nucleosomi e nucleosomi. Questo provoca scompattamento del nucleosoma e facilita l accesso di attivatori della trascrizione al promotore Le deacetilasi istoniche rimuovono gruppi acetilici e ristabiliscono la compattezza del nucleosoma, limitando l accesso dei fattori di trascrizione HAT HDAC

47 Recettori Nucleari funzionanti con RXR I recettori nucleari per gli ormoni non-steroidei non interagiscono con le proteine hsp, ma si trovano legati al DNA in assenza di ormone ed eterodimerizzano con RXR RXR TR RXR VDR TRE DRE RXR RAR RXR RXR RaRE RxRE

48 Recettori Nucleari funzionanti con RXR HDAC Trascrizione Attivata RXR RAR + ormone AC AC HAT RXR RAR AC AC Trascrizione Repressa

49 Un singolo segnale può attivare diverse vie Il legame del fattore di crescita epidermica al suo recettore attiva la fosfolipasi C g (PLCg) portando alla produzione di diacilglicerolo (DAG) e all attivazione della protein chinasi C (PKC) Il legame del fattore di crescita epidermica al suo recettore attiva la via delle MAP chinasi attraverso ras DAG PKC PLCg ras GTP ras raf Cascata delle MAP chinasi Effetti multipli p.es. Differenziamento Proliferazione

50 Segnali multipli Crosstalk di recettori Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il segnale A inibisce la proliferazione, mentre il segnale B stimola la proliferazione A B Il segnale A attiva una chinasi chinasi che fosforila e inattiva il recettore per il segnale B - risultato nessuna proliferazione Se il crosstalk lavora solo in una direzione (da A a B) allora il segnale A sarà dominante Se il crosstalk lavora in entrambe le direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi fattori p.es. Timing della percezione del segnale Densità relativa dei recettori Ampiezza relativa del segnale

51 Reti di signaling e comunicazione incrociata (cross-talk) molecole della matrice fattori di crescita kinasi 1 kinasi 2 kinasi 3 Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste in sei recettori e tre protein kinasi citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o la 2 o entrambe con un meccanismo non specificato. Poichè i segnali convergono sulla kinasi 3 (la kinasi di output), questa rete si attiverà massimalmente solo quando saranno presenti combinazioni specifiche di stimoli extracellulari.

52 Regolazione multipla della glicogenolisi mediata da diversi secondi messaggeri Cellule del fegato stimolazione b-adrenergica Diminuzione della glicogeno-sintesi Aumento della glicogeno-lisi camp-dependent protein kinase (capk). glycogen phosphorylase kinase (GPK) GP=glycogen phosphorylase; GS=glycogen synthase.