UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PAVIA Dipartimento di Informatica e Sistemistica Centro interdipartimentale di Ingegneria Tissutale BioBrick, Standard Assembly e registro delle parti biologiche standard Lorenzo Pasotti Paolo Magni Laboratory for Biomedical Informatics Gruppo Nazionale di Bioingegneria XXIX Scuola Annuale BIOLOGIA SINTETICA, Bressanone, 13 17 Settembre 2010 Perché standardizzare la biologia? Bressanone GNB 2010 1
Standard in ingegneria (1) Standard fisici Standard di misurazione Standard in ingegneria (2) Vantaggi: costruzione di sistemi complessi aventi comportamento prevedibile Bressanone GNB 2010 2
Progetto e costruzione di sistemi biologici (1) Digestione / ligazione Digestione / ligazione L assemblaggio è riservato a personale esperto e viene effettuato secondo procedure sempre diverse Progetto e costruzione di sistemi biologici (2) Scegliere i componenti del sistema (ad es. promotori) è difficile perché: spesso non sono caratterizzati esaustivamente; sono stati caratterizzati in condizioni sperimentali non confrontabili (es. diversi terreni di coltura); sono stati caratterizzati in unità di misura diverse. Bressanone GNB 2010 3
Saggio della β-galattosidasi Substrato: ONPG Substrato: S-Gal C.H. Chou et al. (1995), Biotechnology and Bioengineering 47, March, p.186-192. A. Levskaya et al. (2005), Nature 438, November, p.441-442. Progetto e costruzione di sistemi biologici (3) La scelta dei componenti è trial and error Occorrono metodologie standard di assemblaggio e di scelta razionale delle parti biologiche per costruire sistemi interconnessi Bressanone GNB 2010 4
Standardizzazione in biologia Standardizzazione fisica BioBrick & Standard Assembly Registry of Standard Biological Parts Standard di misurazione Standardizzazione fisica (1) Promotori Geni RBS Terminatori T. Knight (2003), Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks, MIT DSpace Bressanone GNB 2010 5
Standardizzazione fisica (2) BioBrick: moduli che condividono un interfaccia comune, che ne facilita l assemblaggio secondo una procedura standardizzata Prefisso EcoRI XbaI BioBrick Suffisso SpeI PstI Siti di restrizione nei BioBrick Le sticky end di X e S sono compatibili (i due siti si dicono ISOCAUDAMERI) Bressanone GNB 2010 6
Standard Assembly Interfaccia BioBrick da vicino I nucleotidi che delimitano i siti di restrizione sono stati scelti per evitare la creazione accidentale di siti di metilazione (Dam, Dcm, EcoBI, EcoKI) La metilazione di determinati nucleotidi all interno di siti di restrizione protegge il DNA dal taglio Bressanone GNB 2010 7
Limiti proteine di fusione Se si volessero assemblare domini proteici, la scar conterrebbe un codone di stop in frame Proposto un nuovo standard (J.C. Anderson et al., 2010) BioBricks Foundation Organizzazione non-profit fondata da ingegneri e scienziati di MIT, Harvard e UCSF Promuove lo sviluppo e l'uso responsabile di tecnologie basate su BioBrick Sviluppa materiali e tecniche per permettere l'uso dei BioBrick esistenti e la costruzione di nuovi componenti biologici standard Processo RFC per proporre nuovi standard nella comunità Bressanone GNB 2010 8
Registry of Standard Biological Parts Archivio open source di BioBrick Custodito presso i laboratori del MIT Gestito dal team del Prof. Randy Rettberg sia dal punto di vista informatico che fisico Modello wiki (http://partsregistry.org) Competizione igem (1) International Genetically Engineered Machine competition Oltre ad aver proposto un nuovo standard, Tom Knight, insieme al bioingegnere Drew Endy, organizza questa competizione per promuovere la standardizzazione di parti biologiche Bressanone GNB 2010 9
Competizione igem (2) 2004 corso estivo interno al MIT 2005 competizione nazionale (13 team) 2006-2010 competizione internazionale 2006 37 team 2007 54 team 2008 84 team 2009 113 team 2010 128 team Competizione igem (3) Bressanone GNB 2010 10
Registry & igem Su 5000 BioBrick ad oggi contenuti nel Registry, 4000 sono stati aggiunti dai team igem Problemi del Registry: documentazione e controllo qualità di una grande e crescente collezione Conclusioni standardizzazione fisica (1) Grazie ad igem, i BioBrick si sono diffusi e hanno stimolato numerosi laboratori a costruire nuove parti Nonostante le analogie con i Lego, non si possono separare le parti, perciò occorre conservare le parti intermedie per futuri assemblaggi Mutazioni In attesa di sintesi chimica a basso costo, i BioBrick sono un ottima soluzione che ha portato alla definizione di procedure automatizzate Bressanone GNB 2010 11
Conclusioni standardizzazione fisica (2) Prima spin off: Servizio BrickLayer DNA Assembly per l assemblaggio di BioBrick Robot dei laboratori di MIT e UC Berkeley basati su BioBrick Standard Assembly Standardizzazione in biologia Standardizzazione fisica BioBrick & Standard Assembly Registry of Standard Biological Parts Standard di misurazione Bressanone GNB 2010 12
Standard di misurazione Obiettivo: Misurare le performance di componenti biologici al fine di predire il loro funzionamento in sistemi complessi Tuttavia, prima occorre: Definire parametri significativi Definire metodologie standardizzate Complicazioni nella misurazione Rispetto ad altri campi dell ingegneria, la caratterizzazione di questi moduli è complicata da: Variabilità intrinseca dei sistemi biologici Sforzo metabolico introdotto nella cellula Bressanone GNB 2010 13
Requisiti di un datasheet standard (1) Elenco proposto da B. Canton et al. (2008), Nature Biotechnology: Caratteristica statica Caratteristica dinamica Affidabilità Compatibilità Richiesta energetica Requisiti di un datasheet standard (2) Questi parametri faciliterebbero la riusabilità dei componenti biologici caratterizzati. Tuttavia ad oggi non esistono metodologie standardizzate per la loro stima Ci si è invece concentrati sulla standardizzazione dei segnali di input e output dei moduli basati sulla trascrizione, definendo un portatore di segnale standard. Bressanone GNB 2010 14
Polymerase Per Second PoPS Rate di trascrizione del mrna Problema: questa grandezza non è direttamente misurabile in vivo Stima di PoPS Ipotesi del modello: stato stazionario GFP con rate di degradazione trascurabile Bressanone GNB 2010 15
Il primo datasheet B. Canton et al. (2008), Nature Biotechnology Problemi nella diffusione dell approccio PoPS richiede di effettuare esperimenti dispendiosi (es. Real Time PCR) e non facili da standardizzare Proposti dei kit di misurazione per promotori e terminatori Bressanone GNB 2010 16
Relative Promoter Units (RPUs) IDEA: stimare PoPS rispetto ad un riferimento Quantità stimabili con fluorimetro/ spettrofotometro Ipotesi copy number mrna stato stazionario Bressanone GNB 2010 17
Validazione approccio RPU come unità di misura standard in quanto proporzionale a PoPS e facile da ricavare (J. Kelly, Journal of Biological Engineering, 2009) Standard di misurazione Conclusioni Parametri di interesse non ancora definiti RPU: ipotesi difficilmente validabili (steady state) e restrittive RPU: utili per fare ranking e scegliere razionalmente le parti biologiche Anche quando saranno affermate metodologie standard, sorge il problema dell effettiva interconnessione dei moduli Bressanone GNB 2010 18
Problemi nei sistemi più complessi tetr B0010 B0012 PtetR lacz B0010 B0012 J23100 RFP OD600 RFP [AU] t [h] t [h] Conclusioni Standardizzazione fisica: soluzioni soddisfacenti Catalogo: problemi di stabilità e di documentazione (tipici di open source) Standardizzazione funzionale: problema aperto Risolvibile? Bressanone GNB 2010 19