VITAMINA C PLASMATICA IN UV Codice Z20010 INTRODUZIONE L Acido Ascorbico (A.A.) rientra nel gruppo delle vitamine idrosolubili ed è largamente diffuso in natura specialmente nelle arance e nei limoni. L Acido Ascorbico è un potente agente riducente che gioca un ruolo chiave in molti processi biologici; è necessario per l attivazione ottimale degli enzimi coinvolti in varie reazioni di idrossilazione, nella produzione e nel mantenimento del collagene, nella biosintesi della carnitina dalla lisina e nella sintesi degli acidi biliari dal colesterolo. Si ritiene poi che la sua attività antiossidante, che deriva dalla facilità con cui può essere ossidato reversibilmente a Deidroascorbato, abbia un ruolo importante nel proteggere gli organismi viventi dagli effetti distruttivi dei radicali liberi, frammenti molecolari altamente reattivi con uno o più elettroni spaiati. La specie umana non è capace di sintetizzarlo per cui deve assumerlo con la dieta; il fabbisogno giornaliero è di circa 50 100 mg/die. Il mancato apporto di A.A. con la dieta determina nell uomo l insorgenza di un particolare quadro morboso, lo scorbuto, ben noto in passato a coloro che non potevano ingerire per lunghi periodi verdure o frutta fresca. La carenza di A.A. determina inoltre astenia, anoressia, alterazioni ossee (osteoporosi), depressione, anemia e diminuita resistenza alle infezioni. Lo stato di ipovitaminosi può essere dimostrato determinando la concentrazione di A.A. nel plasma. Anche se esistono molti metodi per eseguire il monitoraggio dell A.A. nei liquidi biologici, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) in fase inversa è semplice da usare e selettiva; queste ultime caratteristiche la rendono la metodologia più adatta per l analisi di routine. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Release N 014 Vitamina C plasmatica in UV Febbraio 2010 1
CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del metodo : Il presente metodo consente di determinare le concentrazioni plasmatiche della VITAMINA C. Ad una aliquota di plasma ( 150 µl ) trattata con un opportuno riducente, viene aggiunto il deproteinizzante e dopo centrifugazione, vengono iniettati 100 µl in HPLC. Recupero del Metodo : > 98% Sensibilità del Metodo : circa 0,10 mg/l Range di normalità : 5-15 mg/l Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso,eccetto il Reagente B e il Reagente D, e stabili 3 anni a 2-8 C. Reagente A Soluzione Deproteinizzante, 1 x 50 ml Reagente B Soluzione Riducente, 3 x 10 mg (Ogni flacone va ricostituito con 5 ml di di Reagente F) Reagente C Soluzione Standard interno, 1 x 5 ml Reagente D Soluzione Test, 3 x 10 mg Reagente E Calibratore liofilo, 2 x 0,5 ml Vedi Avvertenze Reagente F Soluzione di Ricostituzione, 1 x 15 ml Reagente M Fase Mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 100 µl Detector UV λ = 275 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità di prelievo ematico : Provetta con anticoagulante EDTA o EPARINA Fase pre-analitica : Al plasma separato va aggiunta subito un aliquota di Reagente B, secondo le seguenti proporzioni: 900 µl di Plasma 100 µl di Reagente B ricostituito Così trattato il campione è stabile per 1 mese a -20 C e 2-3 giorni a 2-8 C. 2
PROCEDURA PREANALITICA FASE 1 : Ricostituzione del Reagente B Soluzione Riducente Aggiungere ad un flacone di Reagente B Soluzione Riducente 5 ml di Reagente F Soluzione di Ricostituzione. Il Reagente B Soluzione Riducente così ricostituito è stabile 1 anno a 2-8 C FASE 2 : Preparazione della Soluzione Test a circa 100 mg/l Aggiungere ad un flacone di Reagente D Soluzione Test 9 ml di Acqua di grado HPLC e 1 ml di Reagente B Soluzione Riducente ricostituito. Questa Soluzione è stabile circa 2 mesi a 20 C In una provetta pipettare : 900 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente D Soluzione Test precedentemente preparata Si otterrà una soluzione test contenente circa 100 mg/l. Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : Iniettare 100 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante: Questo Test così ottenuto non deve essere usato come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei Campioni N.B.: Il Calibratore ed i Controlli devono essere trattati preventivamente con il Reagente B Soluzione Riducente come indicato nelle Avvertenze Ricostituzione Dispensare in provette coniche da 1,5 ml: Calibratore Controllo Campione Reagente E Calibratore 150 µl Controllo 150 µl Campione 150 µl Reagente C - Sol.Std interno 50 µl 50 µl 50 µl Reagente A - Sol. Deproteinizzante 300 µl 300 µl 300 µl Attenzione: si consiglia di deproteinizzare direttamente sul Vortex per 10 secondi FASE 2 : Centrifugare a 10.000 rpm per 5 minuti FASE 3 : Prelevare 300 µl di surnatante e aggiungere 200 µl di H 2 O Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : N.B.: il campione così preparato è stabile 2 giorni a 2-8 C Iniettare 100 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N 014 Vitamina C plasmatica in UV Febbraio 2010 3
VITAMINA C - Avvertenze REAGENTE E : CALIBRATORE PLASMATICO LIOFILO / ZPL838 VITAMINA C Modalità d uso : il Calibratore deve essere usato per calibrare il sistema HPLC. Deve essere preparato come un plasma campione. Ricostituzione : aggiungere esattamente 500 µl di H 2 O di grado HPLC, rimettere il tappo e mescolare per inversione. Lasciare riposare per 5-10 minuti. Prelevare 450 µl ed aggiungere 50 µl di Reagente B Soluzione Riducente (dopo ricostituzione). Mescolare bene ed attendere 5 minuti. Conservazione e stabilità : sottoforma di liofilo il calibratore è stabile 24 mesi dalla data di preparazione se conservato a 20 C. Dopo la ricostituzione la stabilità è di 4 gg a 2 8 C o 1 mese a 20 C. Si consiglia di aliquotare il Calibratore ed i Controlli una volta ricostituiti e trattati con il Reagente B Sol. Riducente. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 2 x 0,5 ml Precauzioni : il plasma umano usato per la costruzione di questo calibratore va considerato come potenzialmente infetto e trattato con cura. 17 mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 275 nm 0,001 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column (1 x 3 pz), cod. ZA600MG e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da 0,22 µ o 0,45 µ. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. NON lavorare a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 100 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 160 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 7-8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE 4
ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z28013 Calibratore per Vitamina C plasmatica 5 x 0,5 ml Z28080 Controllo per Vitamina C plasmatica - Livello 1 10 x 0,5 ml Z28081 Controllo per Vitamina C plasmatica - Livello 2 10 x 0,5 ml Z28082 Controllo per Vitamina C plasmatica - Livelli 1 e 2 2 x 5 x 0,5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C18 (150 x 4,6mm -4 u) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S394983500 Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 5
VITAMINA C PLASMATICA IN UV ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 1 : Soluzione Test Fig. 2 : Calibratore liofilo plasmatico R.T. 7.09 Vitamina C R.T. 7.01 Vitamina C 21,6 mg/l R.T. 8.28 Std interno R.T. 8.16 Std interno 6
VITAMINA C PLASMATICA IN UV ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 3 : Campione plasmatico Fig. 4 : Campione plasmatico R.T. 6.91 Vitamina C R.T. 6.95 Vitamina C R.T. 7.97 Std interno R.T. 8.03 Std interno 7