Capitolo 2. Tabella 2.1. Risposte cellulari allo stress

Capitolo 2 Risposte cellulari allo stress Adattamenti Stress Degenerazioni Morte - Rigonfiamento o danno reversibile - Accumuli di sostanze intra- ed extra-cellulari - Necrosi - Apoptosi Tabella 2.1. Risposte cellulari allo stress In generale un qualsiasi fattore di stress causa una reazione ben precisa a livello cellulare, come schematizzato nello schema 2.1. Le cellule dei vari organi si comportano tutte in modo simile. Ai fini dell insorgenza di un danno cellulare è importante la quantità e la durata di uno stress. In primo luogo, infatti, le cellule provano ad adattarsi alle nuove condizioni che si trovano a dover affrontare. Per fare ciò esse vanno incontro a fenomeni di ipertrofia ed iperplasia o di atrofia ed ipoplasia, a seconda che gli stimoli ricevuti eccedano o siano carenti rispetto alle condizioni standard in cui le cellule si trovavano prima della situazione di stress; in questo modo un sistema di cellule è in grado di aumentare o diminuire la propria attività. Se le condizioni che si vengono a creare sono anomale rispetto alla funzione che un dato tessuto svolge normalmente, un altro adattamento cui possono andare incontro le cellule è quello della metaplasia, ovvero la trasformazione di un dato tipo cellulare in un altro con caratteristiche differenti, che si adatta meglio ai nuovi stimoli. Se le cellule in risposta ad uno stress non riescono ad adattarsi, vanno incontro ad un danno acuto o cronico. Il primo può risultare reversibile o irreversibile e, in quest ultimo caso, la cellula muore. Esistono due tipologie di morte, la necrosi e l apoptosi. ADATTAMENTI CELLULARI Gli adattamenti cellulari possono essere fisiologici o patologici. Adattamenti fisiologici Le cellule si adattano a cambiamenti di ambiente accettabili, modificando il comportamento biochimico o di accrescimento. Esempi di adattamenti cellulari con modificazioni a livello biochimico, che non si riflettono in evidenti cambiamenti di struttura sono: 1. Durante il periodo di digiuno, gli acidi grassi vengono metabolizzati dal tessuto adiposo per fornire energia. 2. Durante i periodi di carenza relativa di calcio, il calcio è mobilizzato dalla matrice ossea per azione degli osteoclasti e sotto l influenza del paratormone. 3. Dopo somministrazione di alcuni farmaci (ad esempio, la rifampicina, un agente antimicrobico, oppure i barbiturici), sono indotti enzimi microsomiali epatici che facilitano il metabolismo del farmaco. Dopo la somministrazione dei farmaci ipolipidemici si ha un aumento dei perossisomi, con epatomegalia. 1

Adattamenti cellulari con cambiamenti delle modalità di accrescimento e accompagnati da visibili alterazioni strutturali sono divisi in tre tipi principali: 1. Aumento dell attività cellulare (aumento della grandezza o del numero delle cellule). Di regola è causato da richieste di aumento delle prestazioni funzionali di un tessuto, o da un aumento della stimolazione ormonale. 2. Riduzione dell attività cellulare (riduzione della grandezza o del numero delle cellule), di regola per effetto di una riduzione della stimolazione ormonale di un tessuto o di una riduzione della richiesta funzionale. 3. Alterazione della morfologia delle cellule (modificazione del differenziamento), si verifica quando il cambiamento del micro-ambiente di vita della cellule causa alterazioni della struttura. Adattamenti patologici Le cellule si adattano a stimoli lesivi, modificandosi in modo da acquisire un nuovo livello metabolico e strutturale che consente di sopravvivere meglio nell ambiente anormale. È necessario sottolineare che i confini tra adattamenti fisiologici e patologici non sono rigidi. Le cellule possono adattarsi agli stimoli patologici estendendo le tre normali risposte adattative fisiologiche: 3 3 3 Aumento dell attività cellulare. Riduzione dell attività cellulare Alterazione della morfologia cellulare. I termini utilizzati per descrivere questi cambiamenti sono riportati nello schema 2.2 Cambiamenti di grandezza delle cellule Cambiamenti di numero delle cellule Atrofia Ipertofia Involuzione Iperplasia Riduzione di grandezza delle cellule Aumento di grandezza delle cellule Riduzione del numero delle cellule Aumento del numero delle cellule Cambiamenti del differenziamento delle cellule metaplasia Cambiamento stabile a tipo cellulare diverso Tabella 2.2. Cambiamenti delle caratteristiche di crescita delle cellule Il tipo di adattamento utilizzato dalle cellule dipende dal tipo cellulare. L iperplasia ad esempio può avvenire solo nei tessuti composti da cellule che hanno la possibilità di dividersi e moltiplicarsi. Una classificazione introdotta da Bizzozero postula l esistenza di tre tipologie di cellule: labili, stabili e perenni. Le cellule labili sono quelle che muoiono e si rigenerano in continuazione e con un ritmo elevato; ne sono esempi le cellule ematopoietiche, le cellule dell epidermide e quelle delle mucose. Le cellule stabili, come gli epatociti e le cellule del rene, sono le cellule che in condizioni normali non si moltiplicano ma che, in seguito ad un trauma, possono rigenerare o sostituire la parte dell organo o del tessuto che ha subito un danno. Le cellule perenni sono quelle che, dopo il differenziamento, perdono la capacità di dividersi, per cui una volta morte non sono più sostituibili con una cellula dello stesso tipo: come esempi possiamo riportare le cellule muscolari, i neuroni, le cellule del cristallino, ecc Da quanto detto si comprende come soltanto le cellule labili o stabili possano andare incontro a fenomeni di iperplasia. 2

Ipertrofia ed Iperplasia Un aumento della richiesta funzionale di un tessuto o l adattamento di alcuni organi a processi morbosi può essere soddisfatto da un aumento della massa cellulare funzionante, mediante l aumento del numero (iperplasia) o l aumento del volume (ipertrofia) delle cellule. Ipertrofia è un aumento delle dimensioni delle cellule esistenti, accompagnato da un aumento della loro capacità di funzione. L ingrandimento delle cellule è attribuibile ad un aumento della sintesi di componenti strutturali e si associa con un accelerazione del metabolismo cellulare e con un aumento dei livelli di RNA e degli organelli responsabili delle sintesi proteiche. Il DNA raddoppia, ma la cellula non si divide. L ipetrofia si osserva principalmente come risposta ad aumenti di richiesta funzionale di organi costituiti da cellule incapaci di dividersi (muscolo scheletrico e cardiaco). Avviene, comunque, in seguito ad aumentata richiesta di funzionalità cellulare anche nei tessuti a cellule stabili, come il tessuto epatico. Iperplasia. E un aumento del numero delle cellule di un tessuto, determinato da un aumento delle divisioni cellulari. Dato che questo fenomeno può avvenire solo nei tessuti che contengono cellule capaci di proliferare, l iperplasia non è una risposta osservabile nel tessuto muscolare scheletrico o cardiaco o nelle cellule nervose, che hanno perso definitivamente la capacità di dividersi. Le influenze ormonali sono importanti in questo tipo di crescita. L ipertrofia e l iperplasia possono manifestarsi in maniera fra loro indipendente o associarsi per conseguire l aumento della funzione; di solito si accompagnano ad un aumento del volume e del peso dell organo interessato. Cause fisiologiche di ipertrofia e/o iperplasia: Aumentata richiesta funzionale: - Negli atleti le fibre muscolari aumentano di grandezza (ipertrofia) in risposta all esercizio e all aumento dei bisogni metabolici. - Se l organismo viene a contatto con antigeni, i linfociti sono stimolati a proliferare per attuare una risposta immunitaria di tipo umorale (produzione di anticorpi) o di tipo cellulare. Aumento degli stimoli trofici: - La ghiandola tiroide si accresce in gravidanza (iperplasia), a seguito della stimolazione delle cellule tiroidee da parte del TSH, i cui livelli aumentano in gravidanza. - Durante la pubertà gli ormoni sessuali determinano un aumento del volume degli organi sessuali. - Per effetto della stimolazione endocrina (prolattina, estrogeni), in gravidanza le cellule epiteliali della mammella e le cellule muscolari lisce dell utero aumentano sia di numero che di dimensioni (ipertrofia e iperplasia) - Per influenza della stimolazione endocrina ovarica, nel ciclo mestruale le ghiandole dell endometrio aumentano di grandezza per effetto della proliferazione delle cellule (iperplasia). Cause patologiche di ipertrofia e/o iperplasia: Aumentata richiesta funzionale: - Se la concentrazione del calcio nel siero si abbassa ad esempio per danno renale, le paratiroidi aumentano il numero delle cellule che secernono paratormone (iperplasia) per reclutare calcio dalle ossa. - Cuore. Se la valvola aortica è ristretta (stenosi), la muscolatura del ventricolo sinistro del cuore risponde con un aumento di volume dei cardiomiociti (ipertrofia) per superare la resistenza al 3

flusso sanguigno, e assicurare il mantenimento della pressione arteriosa. Ciò si osserva anche nel miocardio di soggetti con ipertensione arteriosa sistemica, malattia che aumenta la richiesta di funzione cardiaca. Se la valvola mitrale è ristretta (stenosi), la muscolatura dell atrio sinistro risponde con un aumento del volume dei cardiomiociti (ipertrofia). (Figura 2.1). - L ostruzione del colon da parte di un tumore causa un aumento del volume (ipertrofia) della cellule muscolari lisce della parete intestinale a monte dell ostruzione. - Se diminuisce la concentrazione di ossigeno nell aria (alta quota), si verifica un aumento della produzione di globuli rossi (iperplasia). - Se si hanno emorragie croniche, si verifica un aumento della produzione di globuli rossi (iperplasia). - Se c è stata rimozione o perdita di funzione di un rene, il rene controlaterale normale aumenta di peso e di volume per compensare le perdite. Il processo di iperplasia determina l ingrandimento di strutture quali i glomeruli, ed è spesso denominato iperplasia compensatoria. Figura 2.1. Cause di ipertrofia cardiaca. Eccesso di stimolazione endocrina: - La somministrazione esogena di ormoni causa l iperplasia o l ipertrofia dell organo bersaglio. Estrogeni in menopausa causano iperplasia dell endometrio. Estrogeni per la cura del tumore della prostata causano ginecomastia nell uomo. Steroidi anabolizzanti causano ipertrofia della muscolatura scheletrica. Eritropoietina causa iperplasia dei globuli rossi. - La produzione di ormoni da parte di adenomi secernenti causa l iperplasia o l ipertrofia dell organo bersaglio. - Se la secrezione di ormoni da parte dell ipofisi non è più inibita, si verifica l iperplasia o l ipertrofia dell organo bersaglio. Ad esempio se la secrezione di TSH non è più inibita per la 4

carenza di iodio, le cellule della tiroide vanno incontro ad un aumento di volume (ipertrofia), con formazione del gozzo. Danno cellulare persistente: - Infiammazione cronica. - Stimolo meccanico prolungato o ripetuto. Esempio le scarpe strette portano alla formazione di duroni e calli (iperplasia delle cellule dell epidermide). Dopo la rimozione dello stimolo che causa iperplasia o ipertrofia il tessuto ritorna alla norma. Una caratteristica fondamentale dell iperplasia è che l alterazione della crescita cessa dopo la rimozione dello stimolo ambientale che l ha causata, con ritorno del tessuto alle condizioni normali. Ad esempio, nell iperplasia dell endometrio la rimozione delle cause di aumento dei livelli di estrogeni nel plasma fa sì che l endometrio ritorni normale. Questa caratteristica distingue l iperplasia dalla neoplasia, in cui c è un eccessiva crescita di cellule che non regredisce con la rimozione dello stimolo ambientale causale. Atrofia ed Involuzione Una riduzione delle necessità funzionali determina una riduzione del numero o del volume delle cellule Quando la massa delle cellule funzionanti di un tessuto si riduce, si dice che il tessuto va in atrofia. La riduzione può avvenire con due meccanismi. 1. Riduzione delle dimensioni e del volume delle singole cellule, che si accompagna ad una riduzione del metabolismo cellulare e della sintesi di proteine strutturali. La riduzione fisica delle dimensioni delle cellule è raggiunta aumentando il catabolismo delle proteine citosoliche strutturali e per rimozione degli organuli per autofagia, coinvolgendo gli elementi strutturali ridondanti nel sistema lisosomiale. 2. Morte di cellule stabilite in un organo o tessuto con conseguente riduzione del numero delle cellule funzionanti. Ciò è ottenuto con l attivazione di specifici sistemi cellulari cha agiscono per determinare la dissoluzione e l eliminazione delle cellule dai tessuti, un processo talora chiamato col nome di morte cellulare programmata. L esempio più studiato di questo tipo di morte cellulare è detto apoptosi. L involuzione è una forma di atrofia fisiologica di un organo determinata da apoptosi delle cellule. In molti tessuti andati in atrofia si accumula nelle cellule rimpicciolite un pigmento bruno, detto lipofuscina. Questo pigmento è costituito da materiale lipidico alterato incluso in lisosomi secondari, è prodotto nel corso della degradazione di membrane cellulari e organuli tramite autofagia. Le lipofuscine si accumulano particolarmente nelle fibre miocardiche atrofiche dei soggetti anziani, provocando l assunzione da parte del miocardio di un colore brunastro evidente microscopicamente (atrofia bruna del cuore). Di regola l atrofia si accompagna a una riduzione del volume e del peso dell organo o del tessuto. In qualche caso la massa cellulare persa per atrofia o involuzione è sostituita da tessuto adiposo o fibroso, così che il volume complessivo si mantiene. La riduzione della massa cellulare può essere fisiologica Molti processi fisiologici comportano una diminuzione della risposta tessutale a seguito di una riduzione di domanda di funzione. Ciò si verifica soprattutto quando la massa di un organo bersaglio è mantenuta da una stimolazione endocrina che può ridursi, ad esempio una ghiandola tiroidea che torna alla grandezza naturale dopo l iperplasia fisiologica indotta dalla pubertà o dalla gravidanza. In età avanzata, la combinazione di fattori quali la riduzione dell attività fisica e 5

l alterazione del comportamento di secrezioni endocrine può portare alla riduzione della grandezza (atrofia) di molti organi e tessuti. Esempi di atrofia fisiologica e di involuzione sono: - L involuzione del timo durante l adolescenza - L involuzione post-partum del miometrio o durante la menopausa - La riduzione delle dimensioni delle fibre muscolari per la riduzione senile dell attività (atrofia da invecchiamento) - La diminuzione del numero delle cellule secernenti ormone, durante l invecchiamento, nelle ghiandole paratiroidi: Tali cellule vengono normalmente sostituite da cellule adipose - La riduzione del volume del testicolo nella vecchiaia, per effetto di una riduzione della stimolazione gonadotropa. Una riduzione della massa cellulare può manifestarsi in condizioni patologiche - Ridotta richiesta funzionale. Le fibre muscolari scheletriche degli arti inferiori vanno in atrofia quando gli arti sono immobilizzati, ad esempio a seguito di fratture. - Insufficiente apporto di ossigeno. Nell ischemia parziale, per incompleta occlusione del vaso, le cellule si adattano diminuendo il loro volume per ridurre la necessità di ossigeno. - Insufficienza di nutrienti. Il digiuno o la scarsa alimentazione determinano una diminuzione del volume cellulare, dapprima quello dei muscoli e in seguito quello del cuore e del sistema nervoso centrale. - Interruzione dei segnali trofici: a) Sistema endocrino. Se mancano gli ormoni secreti dall ipofisi anteriore (TSH, ACTH, FSH, LH), per tumore o per ipofisectomia, gli organi bersaglio (tiroide, surrene, ovaio) vanno incontro ad atrofia. B) Trasmissione neuromuscolare. Un danneggiamento degli assoni che innervano un muscolo causa atrofia delle fibre interessate (poliomielite). - Danno cellulare persistente. A) L infiammazione cronica porta le cellule dell organo interessato ad atrofia. B) Tossici persistenti. Il fumo causa atrofia delle cellule della mucosa bronchiale. C) Stimoli fisici. Uno scompenso cardiaco destro diminuisce il flusso di sangue verso i polmoni e aumenta il sangue che ristagna negli organi, come il fegato. A livello epatico si verifica un aumento di pressione nei sinusoidi, che causa a sua volta atrofia delle cellule attorno ai sinusoidi. Metaplasia I tessuti possono adattarsi a stimoli ambientali con cambiamenti di differenziamento Alcuni stimoli ambientali di lunga durata possono rendere l ambiente inadatto ad alcuni tipi di cellule specializzate. In risposta, le cellule proliferanti si adattano cambiando il loro tipo di differenziamento, che si orienta verso un nuovo tipo di cellule, stabile e maturo, più adatto a sopportare lo stress ambientale. Questo processo è denominato metaplasia. Alcuni esempi di metaplasia sono: - Nei bronchi, per effetto dell irritazione cronica causata dal fumo di sigarette, il normale epitelio cilindrico ciliato mucosecernente è sostituito da epitelio squamoso (metaplasia squamosa) - Nella cervice, il normale epitelio cilindrico della cervice inferiore cambia a epitelio squamoso se viene esposto all ambiente vaginale acido (metaplasia squamosa) - Nella vescica urinaria, il normale tessuto epiteliale di transizione può essere sostituito da epitelio squamoso a seguito di un irritazione acuta da calcoli vescicali o infezioni (metaplasia squamosa) - L epitelio squamoso dell esofago può essere sostituito da epitelio cilindrico in risposta all esposizione ad acido gastrico, in caso di reflusso esofageo. Di solito la metaplasia interessa i tessuti epiteliali, ma può essere osservata anche altrove. Per esempio, aree di tessuto fibroso, esposte cronicamente a trauma, possono formare osso (metaplasia 6

ossea). In molti casi la metaplasia coesiste con l iperplasia; per esempio, l epitelio squamoso metaplastico che si produce nella vescica per effetto di calcoli può essere anche iperplastico. Schemi riassuntivi adattamenti 1-4 7

DANNO CELLULARE ACUTO REVERSIBILE O IRREVERSIBILE Se lo stimolo supera i limiti di adattabilità, diventa uno stimolo lesivo e può essere causa di un danno acuto reversibile o irreversibile. Il danno reversibile permette alla cellula di tornare alla normalità una volta tolto lo stimolo lesivo, mentre quello irreversibile porta la cellula a morte. Ciò può accadere perché la cellula coinvolta è particolarmente sensibile allo stimolo patologico o perché lo stimolo è così intenso da soverchiare la risposta da stress e ogni altra reazione di adattamento. Diversi tipi di cellule mostrano diversi gradi di suscettibilità ai cambiamenti ambientali. Alcune cellule, quali i neuroni cerebrali, sono molto sensibili ai mutamenti ambientali e muoiono rapidamente in condizioni oltre i limiti fisiologici. Altre cellule, quali i fibroblasti sono estremamente resistenti al danno e possono sopravvivere a seri cambiamenti metabolici, quali la completa mancanza di ossigeno, per periodi di tempo relativamente lunghi e senza danno apparente. Danno reversibile La cellula risponde a un danno acuto rigonfiandosi, cioè introduce acqua. La lesione iniziale è una lesione biochimica, che si trova in un qualsiasi punto della cellula (mitocondri, microsomi, membrana plasmatica). In seguito per l interdipendenza tra le diverse componenti strutturali e biochimiche, la lesione iniziale dà origine ad un effetto a cascata che porta al danno con accumulo di acqua. A causare l accumulo di acqua è l ingresso di ioni sodio nella cellula. In condizioni normali nella cellula troviamo il potassio, mentre il sodio risiede nel sangue o nell ambiente extracellulare. A regolare questa situazione sono le pompe Na + /K +, le quali mantengono il gradiente di questi due ioni consumando energia tramite la loro azione ATPasica. Indipendentemente dal tipo di stress, per far sì che il sodio si accumuli all interno della cellula, è necessario che si verifichi un danno a livello della membrana plasmatica, della pompa stessa o che insorga un deficit di ATP. La condizione di stress può danneggiare altre strutture o processi cellulari, ma alla fine la sua azione verrà inevitabilmente a generare uno di questi fenomeni. Esempi: - Ipossia. Quando manca l ossigeno i mitocondri non sono più in grado di produrre ATP; di conseguenza la pompa Na + /K +, che ha bisogno dell ATP per funzionare, non è più in grado di mantenere il sodio al di fuori dalla cellula. - Sostanze tossiche. L assunzione di mercurio o di arsenico porta alla formazione di legami tra queste sostanze e i gruppi tiolici (SH) delle proteine che fanno parte della catena respiratoria mitocondriale, con conseguente denaturazione di queste. Le ripercussioni sono come nell esempio precedente sulla sintesi dell ATP e quindi sulla pompa Na + /K +. Il mercurio e l arsenico possono anche legarsi alle proteine della membrana plasmatica e quindi direttamente alla pompa Na + /K + danneggiandola. - Radicali liberi. I radicali liberi possono causare la formazione di ponti disolfuro tra due residui di cisteina a livello delle proteine, con perdita della loro attività. La conseguenza è, come negli esempi descritti sopra, l alterazione diretta o indiretta dell attività della pompa Na + /K +. I radicali liberi possono causare un danno diretto alla membrana plasmatici, determinando un aumento della permeabilità. Questo è possibile tramite il processo della perossidazione lipidica, che rompe le catene degli acidi grassi costituenti dei fosfolipidi. Aspetto morfologico delle cellule: le cellule sono rigonfie, gli organuli (mitocondri, reticolo endoplasmatico) sono rigonfi, il citoplasma appare pallido per la presenza di acqua, il nucleo è di aspetto normale. (Figura 2,2) 8

Modificazioni Punto di Modificazioni Normale reversibili non ritorno irreversibili Figura 2.2 Modificazioni reversibili: dilatazione degli organuli, disgregazione dei ribosomi, formazione di vescicole. Punto di non ritorno: rigonfiamento mitocondriale di grande entità, comparsa di corpi densi nella matrice dei mitocondri, formazione di grandi vescicole. Modificazioni irreversibili: rottura delle membrane, dispersione degli organuli, liberazione del contenuto dei lisosomi, attivazione della risposta infiammatoria. Danno irreversibile L aumento del calcio intracitoplasmatico determina il punto di non ritorno e quindi l instaurarsi del danno irreversibile. L aumento del calcio intracitoplasmatico è accompagnato da un ulteriore alterazione della membrana plasmatica, per cui entra sodio e calcio nella cellula insieme all acqua. Il rigonfiamento si accentua fino alla rottura della cellula. Il calcio (Figura 2,3) è normalmente presente nel citosol in piccola quantità, mentre è presente in quantità maggiore nello spazio extracellulare e negli organuli. Il gradiente del calcio è mantenuto nel citosol dalla pompa del calcio ATP dipendente presente sulla plasmamembrana. Nei mitocondri è trattenuto dal gradiente protonico, nel reticolo endoplasmatico dalla pompa del calcio ATP dipendente e nel nucleo pure dalla pompa del calcio. Quando aumenta nel citosol, per alterazione di uno o più dei meccanismi che lo sequestrano negli organuli o all esterno, porta a morte la cellula in quanto attiva diversi enzimi calcio dipendenti: Le fosfolipasi, che staccano gli acidi grassi dai fosfolipidi di membrana Le ATPasi, che causano una diminuzione dell ATP Le proteasi, che alterano la struttura e la funzionalità del citoscheletro Le endonucleasi, che frammentano il DNA. La manifestazione morfologica di questa morte cellulare prende il nome di necrosi e si rende evidente alcune ore (10-12 ore nel miocardio) dopo che le cellule sono andate incontro al danno irreversibile. 9

Figura 2.3. Distribuzione del calcio nella cellula. Sfruttando alcune metodologie, la morte è rilevabile anche prima che si verifichino i cambiamenti strutturali. Una di queste consiste nel valutare la presenza nel sangue di determinati enzimi: quando si altera la permeabilità della membrana plasmatica, non solo entrano acqua e ioni, ma escono anche alcuni componenti cellulari, tra i quali enzimi specifici dell organo interessato: Transaminasi. Questi enzimi segnalano che è in atto una lisi delle cellule epatiche. Le due transaminasi ricercate per diagnosticare questa condizione sono la glutammico-piruvico transaminasi o alanina transaminasi (GPT o ALT) e la glutammico-ossalacetico transaminasi o aspartato transaminasi (GOT o AST). Il livello ematico della GPT, che si trova nel citosol, si innalza prima di quello della GOT, che si trova invece nei mitocondri; Lattico deidrogenasi. Questo enzima si trova nel fegato, nel muscolo, nel cuore e nel polmone. Si può distinguerne l origine, sfruttando il fatto che questo enzima si presenta in diverse isoforme, ognuna specifica per uno di questi organi; Creatina fosfochinasi. Questo enzima possiede tre isoforme specifiche per il cuore, il cervello e il muscolo; Gamma glutamil transpeptidasi (γ-gt). E un enzima caratteristico del fegato; α-amilasi. La presenza di questo enzima nel sangue indica che è in corso una pancreatite acuta. La valutazione degli enzimi si attua in vivo. Se si hanno delle cellule in coltura e si vuole valutare la morte, oltre a determinare il contenuto di enzimi nel terreno di coltura, è possibile determinare se le cellule assumono coloranti vitali, come il blu tripano. Infatti tali coloranti vengono assunti solo dalle cellule morte. Aspetto morfologico: le cellule sono rigonfie con protrusioni della plasmamembrana (blebs), il citoplasma è eosinofilo, perché si perde la normale basofilia dovuta alla presenza di RNA nel citoplasma e perché aumenta l affinità per l eosina delle proteine denaturate. Gli organuli sono marcatamente dilatati e nei mitocondri compaiono dei corpi densi di aspetto amorfo. I nuclei vano incontro a tre tipi diversi di alterazioni, dovute tutte alla frammentazione non specifica del DNA: Picnosi. Aumento della basofilia e diminuzione delle dimensioni del nucleo. Il DNA si presenta sotto forma di masse solide basofile. Cariolisi. Perdita della basofilia probabilmente per attività della DNAasi e lisi del nucleo Carioressi. Il nucleo picnotico va incontro a frammentazione. 10

Alla fine il nucleo della cellula necrotica scompare completamente. Ribosomi disaggregati Elementi del citoscheletro aggrgati Vescicola della membrana plasmatica Nucleo: cromatina condensata, membrana corrugata Aumento del volume intracellulare Reticolo endoplasmatico dilatato Mitocondri rigonfi e calcificati Figura 2,4. Morfologia della cellula in necrosi. L aspetto morfologico della necrosi è il risultato di due processi che essenzialmente agiscono insieme:1) la digestione enzimatica delle cellule e 2) la denaturazione delle proteine. Gli enzimi catalitici derivano sia dai lisosomi delle cellule morte (autolisi) sia dai leucociti sopraggiunti (eterolisi). La necrosi può essere suddivisa in diversi tipi: Necrosi coagulativa. Si verifica quando prevale la denaturazione delle proteine. Il danno o l aumento dell acidosi intracellulare causano denaturazione non solo delle proteine strutturali, ma anche di quelle enzimatiche, bloccando in questo modo la proteolisi della cellula. I tessuti appaiono consistenti e pallidi, i profili cellulari e l architettura del tessuto sono ancora riconoscibili. Il processo della necrosi coagulativa è caratteristico della morte cellulare per ipossia in tutti i tessuti, ad eccezione del cervello. L infarto del miocardio è un eccellente esempio. Necrosi colliquativa. Si verifica quando prevale la digestione enzimatica. Il processo colliquativo porta a completa digestione le cellule morte, con perdita dell architettura cellulare e trasformazione del tessuto in una massa liquida e viscosa. Tale necrosi è caratteristica delle infezioni focali batteriche e della morte da ipossia delle cellule del sistema nervoso centrale. Nel cervello c è un alto contenuto di lisosomi nei neuroni e una relativa mancanza di proteine strutturali. Necrosi caseosa. Il tessuto necrotico è morbido e bianco come il formaggio. Le cellule morte formano una massa proteica amorfa, che non lascia intravedere alcuna architettura. E tipica della tubercolosi. Steatonecrosi. Questo termine indica un focolaio di necrosi in cui si sia verificata distruzione dei lipidi. Questa evenienza è tipica del tessuto adiposo, che va incontro a necrosi per liberazione degli enzimi pancreatici, in corso di una pancreatine acuta. L area necrotica assume un colore bianco e diventa dura come gesso, perché gli acidi grassi liberati reagiscono con il calcio. Necrosi fibrinoide. Si verifica a livello della parete dei vasi, dove sulla zona necrotica si deposita la fibrina. 11

Le cellule necrotiche e i loro resti scompaiono per l intervento del processo infiammatorio, che segue sempre la morte per necrosi. APOPTOSI Oltre alla necrosi, le cellule possono andare incontro a morte per apoptosi o morte cellulare programmata. L apoptosi è un processo cellulare fondamentale che serve in parecchie funzioni essenziali. È ormai evidente che questo processo di eliminazione cellulare è uno dei processi più importanti della biologia cellulare, ed è il meccanismo di morte cellulare in parecchi processi importanti e in malattie: L eliminazione di cellule in eccesso nell embriogenesi, per esempio per la separazione delle dita e nella formazione del lume intestinale. L eliminazione di cellule al ridursi di uno stimolo ormonale di crescita, per esempio nei tessuti estrogeno-sensibili del sistema riproduttivo femminile. La selezione clonale dei linfociti per l induzione di tolleranza al self durante lo sviluppo. L eliminazione di cellule in tessuti che richiedono una elevata velocità di ricambio cellulare, per esempio le cellule epiteliali di rivestimento dell intestino. L uccisione delle cellule infettate da virus da parte dei linfociti T citotossci. L eliminazione delle cellule portatrici di danni del DNA causati da infezione, irradiazione o agenti citotossici. L eliminazione di cellule nervose in malattie neurodegenerative come la malattia di Alzheimer.. Nell apoptosi possono distinguere quattro fasi: 1. Fase di induzione/segnalazione: I segnali che inducono la morte e i segnali di sopravvivenza riversati sulla cellula sono integrati. Se i segnali di morte sono dominanti, sono attivati i meccanismi molecolari che fanno scattare il meccanismo di apoptosi. La sopravvivenza cellulare è possibile se i segnali di sopravvivenza hanno indotto proteine ad effetto antiapoptotico. La più studiata di queste classi di proteine antiapoptotiche è detta Bcl-2. Se presente in alta quantità questa proteina impedisce che la cellula si orienti verso la morte apoptotica. In questa fase possono essere indotte alcune caspasi dette inizianti. Le caspasi sono delle proteasi. 2. Fase effettrice: La cellula è destinata a morire a causa dell induzione di un programma genetico. Questa fase sia attua secondo due schemi, non mutualmente esclusivi. Il primo coinvolge la trasmissione diretta del segnale al meccanismo di esecuzione, costituito dalle proteasi effettrici. Il secondo coinvolge la funzione mitocondriale. Indizi sempre più numerosi fanno pensare che la permeabilità della membrana mitocondriale sia uno dei fattori decisionali che mandano la cellula a morte. Quando la membrana mitocondriale diventa permeabile, fattori, come il citocromo c, che causano apoptosi entrano nel citosol dai mitocondri. 3. Fase di degradazione: Le caspasi effettrici attivano sistemi enzimatici che provocano le caratteristiche biochimiche e strutturali dell apoptosi. Tali sistemi enzimatici attivati spezzano le proteine o le alterano con legami crociati, degradano il DNA ed espongono fosfatidilserina sulla membrana esterna della cellula, realizzando le alterazioni strutturali classiche della morte cellulare per apoptosi. 4. Fase di fagocitosi: I frammenti cellulari prodotti dal processo apoptotico sono riconosciuti dai macrofagi e dalle altre cellule normali del tessuto e sono inglobati. L espressione della fosfatidilserina sulla membrana cellulare esterna facilita il riconoscimento fagocitario specifico. Questi aspetti dell apoptosi consentono la rimozione delle cellule morte senza il coinvolgimento del processo infiammatorio: le cellule morte possono essere così rimosse in modo pulito e senza danneggiare le cellule vicine. 12

Mentre la necrosi coinvolge sempre un certo numero di cellule, l apoptosi può interessare anche solo una cellula. Fase di induzione/segnalazione Ci sono quattro sistemi principali che sono rilevanti nell attivare la morte cellulare per apoptosi nella patologia umana (Figura 2,5): Trasduzione del segnale: il legame di specifici ligandi a recettori della superficie cellulare stimola una cascata di trasduzione di segnali che attiva le caspasi. I recettori hanno, nella porzione intracitoplasmatica, domini di riconoscimento della morte che, interagendo con omologhi domini di morte sulle proteine cosiddette adattatrici, danno avvio all attivazione dell apoptosi. Alcuni esempi sono: - L apoptosi mediata da segnali Fas-Fasligando, responsabili dell eliminazione di alcune classi di linfociti del sistema immunitario, e dell uccisione di cellule bersaglio dei linfociti citotossici. - L apoptosi indotta da citochine, quale ad esempio quella indotta dal recettore per il fattore di necrosi tumorale (TNFR). Danno cellulare: il danno cellulare avvia l apoptosi causando alterazione della permeabilità della membrana mitocondriale. Tra gli esempi ricordiamo: - danno mediato da radicali - l anossia cellulare - l aumento dei livelli di calcio libero nel citoplasma - la morte cellulare mediata da perforine/grandzima B, causata da linfociti T citotossici. Danno al DNA: un danno al DNA provoca un accumulo di proteina p53 nelle cellule; fatto che facilita la riparazione del DNA. Se il processo non ha successo, il sistema p53 induce la trascrizione di fattori che favoriscono l apoptosi. Alcuni esempi sono: - la morte cellulare in conseguenza del danno da radiazioni - la morte cellulare in conseguenza del danno da agenti chemioterapici antitumorali. Danno della membrana cellulare: un danno della membrana cellulare causa l attivazione dell enzima sfingomielinasi con produzione di ceramide. Alcuni esempi sono: - danno mediato da radicali - danno mediato da radiazioni 13

Caspasi Le caspasi (Figura 2,6) possono essere divise in due gruppi: inizianti ed effettrici; sono presenti nella cellula come pro-caspasi e vengono attivate per proteolisi controllata. Le caspasi attivano altre caspasi in una sorta di attivazione a cascata. L attivazione delle inizianti (caspasi 2, 8, 9, 10) è il segnale che destina le cellule a una morte per apoptosi. Le caspasi effettrici (3, 6, 7) determinano la degradazione delle cellule realizzando le classiche modificazioni morfologiche e strutturali dell apoptosi. In alcuni sistemi, alcuni segnali che regolano la morte cellulare sembrano agire senza l intervento delle caspasi inizianti. Figura 2,6. Schema generale dell apoptosi con le caspasi. Mitocondri L integrità della membrana mitocondriale è un fattore che decide il destino di una cellula: sopravvivenza o morte. Prima dell attivazione delle caspasi effettrici si affievolisce la capacità dei mitocondri di mantenere un gradiente di potenziale tra le superfici della loro membrana. La caduta del potenziale mitocondriale è causata dall apertura di canali ionici, che attraversano sia la membrana esterna che quella interna. L apertura dei canali determina la liberazione di molecole dai mitocondri nel citosol, come il citocromo c e il fattore di iniziazione dell apoptosi (AIF) (Figura 2,7). 14

mitocondrio Figura 2,7. Liberazione di citocromo c dai mitocondri Alcune proteine associate con i mitocondri possono regolare il processo di apoptosi. Bcl-2 (Figura 2,8) e Bcl-XL sono proteine che prevengono l apertura dei canali e quindi hanno un effetto di protezione contro l apoptosi. Bax e Bad promuovono invece l apoptosi aprendo i canali. Alcune caspasi agiscono determinando danno mitocondriale, amplificando quindi una cascata di morte che coinvolge sia l attivazione caspasica da segnale che l attivazione mitocondrio-dipendente. L apertura dei canali mitocondriali può essere anche determinata direttamente da tossine, radicali liberi, anossia e modificazione della composizione lipidica delle membrane. In questo processo non intervengono le caspasi inizianti, ma solo le effettrici. Figura 2.8. Localizzazione della proteina Bcl-2 nella cellula. Fase di degradazione L attivazione della cascata delle caspasi determina: - taglio della matrice nucleare e delle proteine del citoscheletro - formazione di legami crociati tra le proteine citoplasmatiche per attivazione di transglutaminasi, formando un involucro raggrinzito che si può poi rompere in corpi apoptotici 15

- taglio del DNA a livello internucleosomiale in frammenti multipli di 180-200 paia di basi ad opera di endonucleasi - frammentazione del nucleo - frammentazione della cellula in corpi apoptotici, circondati da membrana e composti da citoplasma e organuli addensati, con o senza frammenti nucleari. Geni anti-apoptotici presenti nell uomo: bcl-2 bcl-x lungo Geni pro-apoptotici presenti nell uomo: bax, bad bcl-x corto myc (in assenza di siero) fos (in assenza di siero) p53 Le alterazioni strutturali dell apoptosi sono riassunte nella Figura 2,9. Figura 2.9. Caratteristiche morfologiche delle cellule in apoptosi Le cellule che vanno incontro ad apoptosi presentano le seguenti caratteristiche: - Diminuzione delle dimensioni cellulari. La cellula diventa più piccola, il citoplasma si addensa e gli orfanelli, apparentemente normali, sono più strettamente addensati. - Condensazione della cromatina. La cromatina si aggrega alla periferia del nucleo in masse dense e ben delimitate. Il nucleo può rompersi in più frammenti. - Formazione di estroflessioni e corpi apoptotici. La cellula mostra estroflessioni superficiali (blebs), poi si frammenta in corpi apoptotici. - Fagocitosi delle cellule o dei corpi apoptotici - Le membrane rimangono intatte fino all ultimo stadio, pertanto non sono permeabili ai soluti normalmente trattenuti all interno e ai coloranti vitali. Esistono alcune malattie associate all INIBIZIONE DELL APOPTOSI come: 1. TUMORI: Linfoma follicolare Carcinoma con mutazione del p53 16

Tumori ormone-dipendente Tumore della mammella Tumore prostatico Tumore ovarico 2. DISORDINI AUTOIMMUNI: Lupus eritematoso sistemico Glomerulonefriti immuno-mediate 3. INFEZIONI VIRALI: Herpesvirus Poxvirus Adenovirus Esistono alcune malattie associate all AUMENTO DELL APOPTOSI come: 1. AIDS 2. DISORDINI NEURODEGENERATIVI: Malattia di Alzheimer Malattia di Parkinson Sclerosi amiotrofica laterale Retiniti pigmentose Degenerazione cerebellare 3. SINDROMI MIELODISPLASTICHE: Anemia aplastica 4. DANNO ISCHEMICO: Infarto miocardico Ictus Danno da riperfusione 5. MALATTIE DEL FEGATO INDOTTE DA FATTORI TOSSICI: Alcool La tabella 2,3 riassume le caratteristiche e le differenze tra morte cellulare per necrosi e per apoptosi. TABELLA 2,3 DIFFERENZE TRA APOPTOSI E NECROSI ISTOLOGIA CITOLOGIA TEST DI ESCLUSIONE DEL COLORANTE ULTRASTRUTTURA Citoplasma APOPTOSI Colpisce cellule isolate in tessuti vitali Nuclei picnotici, citoplasma condensato, frammenti cellulari rotondeggianti Inizialmente i coloranti sono esclusi Compatto, con organuli intatti Reticolo endoplasmatico dilatato Membrana plasmatica intatta NECROSI Muoiono gruppi di cellule con distruzione della struttura del tessuto Edema cellulare Nuclei intatti ma colorati debolmente I coloranti entrano nelle cellule I mitocondri presentano un notevole rigonfiamento e corpi densi nella matrice Tutti gli organuli sono dilatati Rotture della membrana plasmatica e delle membrane interne 17

Nucleo CIRCOSTANZE EFFETTI SUI TESSUTI Cromatina condensata in semilune Frammentazione nucleare In casi fisiologici di morte programmata Atrofia Uccisione immunitaria cellulomediata Tossine a basse dosi Nessuna infiammazione Fagocitosi ad opera di cellule adiacenti Rapida involuzione senza il collasso della struttura dell intero tessuto Cromatina con struttura grossolana, ma che mantiene una distribuzione normale Mai in condizioni fisiologiche Complemento Ipossia Tossine a dosi elevate Infiammazione acuta Cicatrizzazione tardiva 18

ACCUMULO INTRACELLULARE DI SOSTANZE All interno delle cellule possono accumularsi vari tipi di sostanze, che possono essere sostanze endogene, presenti normalmente nelle cellule in quantità tale da non essere visibile al microscopio ottico, oppure sostanze esogene. Si possono distinguere 3 meccanismi generali di accumulo (Figura 2,10): 1. alterazioni nel metabolismo. In questo caso sono accumulate sostanze endogene, come i lipidi. 2. mancanza degli enzimi necessari per degradare i substrati complessi in prodotti solubili. Sono malattie genetiche; le sostanze si acculano nei lisosomi, come nel caso delle glicogenosi. 3. incapacità della cellula di degradare il materiale esogeno fagocitato, come silice e carbone. Si prenderanno in considerazione alcuni esempi riguardanti il punto 1 e 3. Steatosi Steatosi è l accumulo di trigliceridi in organi diversi dal tessuto adiposo (fegato, rene, cuore), avente come principali cause: - sostanze tossiche (etanolo) - malnutrizione proteica - obesità - ipossia - diabete mellito Per poter capire come può avvenire l accumulo di trigliceridi nelle cellule, è necessario rivedere a grandi linee il metabolismo dei lipidi (Figura 2,11). I lipidi alimentari vengono trasformati dagli enzimi digestivi (lipasi) in acidi grassi, i quali vengono assunti dalle cellule intestinali e ritrasformati in trigliceridi. I trigliceridi con il colesterolo e le vitamine liposolubili entrano in circolo, dopo essere stati complessati con le proteine, sotto forma di chilomicroni. I chilomicroni possono venire assorbiti dal tessuto adiposo o da altri organi parenchimali e in particolare dal fegato, in relazione alle necessità dell organo. I trigliceridi non entrano come tali nella cellula adiposa, ma vengono trasformati in acidi grassi e glicerolo per opera di una lipoprotein lipasi. Nel tessuto adiposo gli acidi grassi vengono nuovamente risintetizzati in trigliceridi, che si accumulano nelle cellule adipose come riserva energetica. 19

Quando c è necessità viene attivata la lipasi intracellulare, che scinde i trigliceridi in acidi grassi. Gli acidi grassi vengono trasportati nel circolo ematico dall albumina e captati dai tessuti periferici e in particolare dal fegato. La lipasi viene attivata dall AMP ciclico che è sintetizzato dall ATP per opera dell adenilciclasi che è a sua volta attivata dall adrenalina, dal cortisone, dall ACTH. L AMP ciclico viene degradato a 5-AMP dalla fosfodiesterasi, che è inibita dalla caffeina e dalla teofillina (Figura 2,12). Nel fegato gli acidi grassi vengono utilizzati per: - produzione di energia. L ossidazione avviene nei perossisomi oppure nei mitocondri. - Sintesi dei fosfolipidi - Sintesi degli esteri del colesterolo - Sintesi dei trigliceridi e delle lipoproteine. Lipoproteine: VLDL (very low density lipoprotein). Sono sintetizzate per lo più nel fegato. I trigliceridi per essere trasportati nel sangue ai vari organi devono essere complessati con le proteine, che prendono il nome di apoproteine. Il processo di assemblamento avviene nel Golgi. All interno di queste lipoproteine ci sono anche vitamine liposolubili e colesterolo. Le VLDL cedono gli acidi grassi ai tessuti (muscoli, adipociti ecc.) e si trasformano dapprima in IDL (intermediate density lipoprotein) e poi in LDL. LDL (low density lipoprotein). Le LDL, avendo perso gran parte dei trigliceridi, contengono quasi solo colesterolo. Possono essere captate da tutte le cellule che hanno dei recettori per le LDL, come la muscolatura liscia dei vasi, i fibroblasti, i linfociti, ecc Possono essere captate dai macrofagi attraverso la loro attività fagocitaria, senza la presenza di recettori. Servono quindi per rilasciare colesterolo ai tessuti. HDL (high density lipoprotein). Sono sintetizzate dal fegato e hanno una funzione opposta a quella delle LDL. Esse, infatti, hanno il compito di prendere il colesterolo in periferia (dai vasi o da altri tessuti) e di riportarlo al fegato, impedendone un accumulo, che può avere effetti dannosi: nei vasi può predisporre all aterosclerosi. 20

Le cause di steatosi sopra elencate portano a steatosi attraverso: 1. Aumentato apporto di lipidi con la dieta 2. Eccessiva mobilizzazione degli acidi grassi dal tessuto adiposo, per eccesso di ormoni (adrenalina, cortisone, ACTH), eccesso di sostanze (caffeina), digiuno, diabete (la mancanza di insulina o la diminuzione dei recettori per l insulina determinano una prevalenza dell azione del glucagone)e alcoolismo. 3. Diminuita presenza di ossigeno. Senza ossigeno non possono essere catabolizzati gli acidi grassi e non può essere sintetizzato l ATP, la cui mancanza porta ad una diminuzione della sintesi proteica e quindi delle apoproteine, indispensabili per la formazione delle lipoproteine. 4. Mancanza di proteine. La mancanza di proteine può essere dovuta a una dieta carente oppure alla presenza di sostanze tossiche che ne inibiscono la sintesi. Una dieta carente di proteine causa una carenza di aminoacidi, che servono per sintetizzare a loro volta le proteine necessarie all organismo. Una dieta povera di proteine e ricca di glucidi è frequente nel Terzo Mondo, dove è la causa nei bambini della sindrome di Kwashiorkor (vedi capitolo sugli squilibri alimentari). I bambini affetti da tale sindrome hanno il fegato ingrossato per la steatosi. Tra le sostanze tossiche inibenti la sintesi proteica, l amanitina blocca l RNA polimerasi, il piombo e l arsenico la sintesi dell ATP, la cicloesimide la traslazione, il tetracloruro di carbonio (CCl 4 ) la reazione di inizio. L amanitina è contenuta nel fungo velenoso Amanita Falloides. La steatosi si verifica quando la dose di amanitina ingerita non è mortale. La dose mortale è di 100 µg per Kg di peso corporeo, per cui sono sufficienti 7 mg per provocare la morte di un uomo di 70 Kg. In 100gr di fungo ci sono 8 mg di amanitina. L assunzione di una tale dose causa danno epatico e renale con dolori addominali, diarrea, vomito, ipotermia, ipotensione e collasso. La morte interviene per shock tossico da insufficienza epatica. Nell Amanita Falloides è contenuta anche un altra sostanza velenosa, la falloidina, la cui dose mortale è molto più alta (20-25 mg per Kg di peso corporeo, 100 mg in 100gr di fungo). A dose più basse causa rigonfiamento delle cellule, caratterizzato dalla presenza di molti vacuoli. 5. Alterazioni nell apparato del Golgi, dove avviene l assemblamento delle lipoproteine. Il CCl 4, solvente dei lipidi ed utilizzato nelle lavanderie a secco, è uno dei responsabili. 6. Blocco della tubulina e delle apoproteine. La tubulina fa parte dei microtubuli, i quali trasportano le lipoproteine dal Golgi alla plasmamembrana. L acetaldeide, derivante dal metabolismo dell etanolo, e le aldeidi derivanti dalla perossidazione lipidica sono tra le maggiori cause. 21

7. Aumento della sintesi degli acidi grassi. Il fegato, oltre a ricevere acidi grassi dal circolo, è in grado di sintetizzarli a partire dall acetato, tranne gli acidi grassi essenziali, come l acido linoleico e linolenico. L etanolo può indurre un aumento di questa sintesi, perché è convertito in acetato. Aspetto morfologico dell organo (esempio fegato): l organo si presenta ingrossato, più pesante del normale. Il fegato può arrivare anche a 4-6Kg. Alla palpazione si sente che è fuori dai limiti normali. Aspetto istologico: alla sezione le cellule appaiono rigonfie e ripiene di vacuoli vuoti, perché con le normali procedure di preparazione i solventi sciolgono i lipidi. Infatti i lipidi si accumulano nelle cellule sotto forma di vacuoli, dapprima piccoli, che poi si riuniscono in vacuoli sempre più grossi fino a formare un unico grosso vacuolo che occupa tutta la cellula e sposta alla periferia il nucleo (Figura 2,13). È possibile mantenere i lipidi e metterli in evidenza con colorazioni specifiche per i lipidi, congelando immediatamente il tessuto, facendo le fettine con un microtomo congelatore e colorandole con il rosso Congo. Nella steatosi, almeno nelle fasi iniziali, l organo mantiene la sua funzionalità; infatti la quantità di enzimi epatici, presenti a livello ematico ed indice di morte cellulare, supera in genere di poco la quantità normale. Figra 2,13. Steatosi epatica da etanolo. La sezione di fegato mostra il citoplasma di quasi tutti gli epatociti infarcito di grasso, con il nucleo spostato alla periferia. Carbone L accumulo di carbone avviene nelle vie respiratorie per inalazione. L epitelio ciliato e il muco delle vie respiratorie hanno la funzione di impedire alle sostanze esogene di arrivare ai polmoni: se il carbone arriva in questa sede, è fagocitato dai macrofagi, i quali, non possedendo enzimi atti alla sua demolizione, lo accumulano all interno. Quando muoiono, liberano le particelle di carbone, che vengono a loro volta fagocitate da altri macrofagi. I macrofagi nello stesso tempo liberano fattori di crescita, come il fattore di crescita per i fibroblasti (FGF), che inducono la proliferazione dei fibroblasti e quindi la produzione di fibre collagene, radicali liberi dell ossigeno ed enzimi come la collagenasi e l elastasi. Conseguenze sono la fibrosi dei setti e l enfisema per rottura dei setti a causa degli enzimi sopradetti. Entrambe le conseguenze riducono la capacità respiratoria per aumento della distanza tra l alveolo e i capillari e per riduzione della superficie respiratoria, rispettivamente. L accumulo di carbone può portare all antracosi, che è asintomatica e alla pneumoconiosi che può essere semplice o complicata in relazione alla quantità di fibrosi presente. 22

Silice La silice si accumula a livello polmonare, dando origine a una malattia di tipo professionale, detta silicosi. La silice si lega alle proteine e ai fosfolipidi dei macrofagi e dei pneumociti. I macrofagi fagocitano le particelle di silice, ma non sono in grado di metabolizzarla, perché non possiedono enzimi specifici. Pertanto, quando muoiono, liberano la silice insieme a citochine e a radicali liberi dell ossigeno. Tra le citochine ci sono i fattori di crescita per i fibroblasti, che sono stimolati a produrre fibre collagene che si depositano sulle pareti degli alveoli. La pneumoconiosi può essere semplice o complicata in relazione alla quantità di fibrosi presente. Oltre alla fibrosi si può avere enfisema, per la maggior produzione di collagenasi. Entrambe le condizioni riducono la capacità respiratoria per aumento della distanza tra l alveolo e i capillari e per riduzione della superficie respiratoria, rispettivamente. Lipofuscine Le lipofuscine sono pigmenti costituiti da polimeri di lipidi perossidati e proteine inattivate. Si trovano nelle cellule che vanno incontro ad atrofia e si formano quando gli organelli subcellulari, come i mitocondri vengono degradati. I lipidi perossidati inattivano gli enzimi dei lisosomi, che non sono più in grado di attuare la loro azione demolitiva. Si formano così dei complessi lipdi perossidati proteine inattive, detti lipofuscine. Melanina La melanina è contenuta nei melanociti, cellule che si trovano nello strato basale dell epidermide. Cellule precursori dei melanociti sono i melanoblasti, che derivano dalla cresta neurale. La melanina viene sintetizzata dalla tirosina per opera dell enzima tirosinasi e serve per difendere la cute dai raggi ultravioletti. Ogni melanocita mediante i prolungamenti dendritici è in connessione con 36 cheratinociti, ai quali può cedere la melanina. Alterazioni della pigmentazione e dei melanociti: - Efelidi - Lentiggini - Nevi - Melanoma Efelidi Sono delle macchie di piccole dimensioni (1-10 mm) di colore marrone chiaro, che compaiono con l esposizione al sole e tendono a scomparire in inverno. Sono dovute o ad una esagerata produzione di melanina o una maggiore cessione di melanina ai cheratinociti. Lentiggini Sono macchie piccole (5-10 mm), di colore variabile dall ocra al bruno e sono sempre presenti. Sono dovute ad una iperplasia dei melanociti, i quali si dispongono in modo lineare. Nevi Sono aree solide di cute piana (macule) o rilevata (papule), piccole (< 6 mm), di colore variabile dal marrone chiaro al bruno, con contorni netti e ben definiti. Sono costituiti dai melanociti che da cellule dendritiche sparse tra i cheratinociti basali si aggregano in formazioni rotondeggianti. Si possono distinguere cinque forme principali di nevi: - Nevo giunzionale (Figura 2,14). Gli ammassi anormali di melanociti sono confinati nell epidermide, a livello dello strato basale. Le lesioni sono piatte e pigmentate in maniera uniforme e intensa. Si sviluppano nell infanzia o nell adolescenza. - Nevo composto (Figura 2,14). E una lesione lievemente nodulare, rilevata, di colore brunopallido, con pigmentazione uniforme. Sono più frequenti negli adolescenti e nei giovani adulti. 23

Gli ammassi di melanociti si trovano sia nell epidermide che nel derma superficiale. Le cellule intradermiche del nevo sono simili istologicamente a quelle del nevo giunzionale, mentre quelle dei piani più profondi sono più piccole e compatte, il che sta ad indicare la maturazione delle cellule del nevo. - Nevo intradermico. (Figura 2,14) E rilevato, con cupola liscia, di colore carneo o lievemente bruno. Si trova negli adulti. E costituito da cellule neviche intradermiche e non c è alcuna componente annidata nella giunzione. - Nevo blu. E una lesione interamente intradermica, in cui i melanociti, di solito intensamente pigmentati, sono sparsi in noduli mal definiti separati da grosse bande di collagene. Si presentano per la prima volta nei bambini e crescono lentamente. La trasformazione maligna è molto rara. - Nevo di Spitz o nevo giovanile. Si presenta nei giovani in forma di nodulo a superficie liscia, bruno-rossastro, rilevato. A livello istologico i melanociti presentano gradi di pleomorfismo e di atipia, pur non essendo un melanoma. La componente giunzionale dei nevi è la parte più a rischio di trasformazione maligna. Nei nevi benigni i melanociti giunzionali sono organizzati in nidi o secondo una modalità lineare (lentigginosa). I singoli melanociti non mostrano alcun segno di pleomorfismo, di atipia o di attività mitotica. Talvolta si sviluppa atipica citologica e architetturale, le singole cellule mostrano un marcato pleomorfismo nucleare ed un aumento delle mitosi. L atipia architetturale si manifesta con perdita di rotondità dei nidi o della modalità lineare, i margini divengono irregolari, così come la superficie e la pigmentazione (nevo displastico o lentigo maligna). Queste alterazioni di un nevo pre-esistente dovrebbero essere considerate come indizi di una possibile trasformazione maligna. Melanoma maligno Accenniamo a questo punto al melanoma, avendo parlato dei nevi, anche se non è il suo proprio capitolo. Il melanoma maligno colpisce preferenzialmente gli adulti. Insorge in un nevo displastico o nella lentigo maligna o in modo autonomo su una cute normale. Il fattore predisponente più importante è l esposizione ai raggi ultravioletti (UV). L aumento attuale di incidenza è da attribuirsi al ridotto potere filtrante dello strato di ozono, che si è assottigliato, e all abitudine dei bagni di sole. Il tumore è raro nella popolazione a pelle scura, forse per l effetto protettivo esercitato dall elevato contenuto di melanina, mentre è più frequente nella popolazione a pelle chiara. Un indagine epidemiologica è derivata dall osservazione delle popolazioni a pelle chiara che sono migrate in Australia: in queste si è verificato un aumento del tumore rispetto alla popolazione autoctona. Le donne sono più esposte degli uomini allo sviluppo del tumore. Nelle donne le sedi più colpite sono le gambe, mentre negli uomini è il tronco. Il melanoma può anche interessare le superfici mucose ( bocca e naso) e la retina. Esiste una predisposizione al tumore, che è localizzata sul cromosoma 1. Le Figure 2,15 e 2,16 mostrano alcuni tipi di melanoma: - Melanoma in situ. Le masse di melanociti atipici sono confinate negli strati basali dell epidermide e non invadono il derma. 24

- Melanoma maligno a diffusione superficiale. Si presenta come una lesione piatta, con contorni irregolari e pigmentazione variabile. Si estende lungo l asse orizzontale sia negli strati basali che negli strati superiori del derma. E il tipo più frequente. - Melanoma maligno nodulare ad estensione verticale. Si presenta come un nodulo rilevato, bruno-nero, e invade il tessuto verticalmente. Il melanoma metastatizza facilmente sia per via linfatica che ematica. Sedi frequenti di metastasi sono il fegato, il polmone, il cervello, il miocardio, le ovaie. Ittero L ittero biochimico può essere definito come un aumento della concentrazione della bilirubina nel plasma oltre i livelli normali di 18-24 micromoli/litro (1,2 mg/dl). L ittero clinico è evidente quando i livelli superano 50 micromoli /litro (2,5 mg/dl) e si manifesta con una colorazione gialla delle sclere e della cute. La bilirubina deriva dal metabolismo dell emoglobina come sintetizzato nella Tabella 2,4 e nelle Figure 2,17 e 2,18a. TABELLA 2,4. METABOLISMO DELLA BILIRUBINA La bilirubina deriva dalla degradazione dell emoglobina ed è trasportata al fegato direttamente dal sangue, che dalla milza va al fegato tramite la vena porta. La bilirubina non è coniugata e quindi viene trasportata nel sangue dall albumina. Non può essere escreta con le urine. Nel fegato viene internalizzata per mezzo di proteine di trasporto e viene coniugata con acido glucuronico. La bilirubina coniugata è idrosolubile e viene immessa nella bile, la quale raggiunge l intestino. Nell intestino la bilirubina viene trasformata in urobilinogeno dai batteri. L urobilinogeno viene escreto per la maggior parte con le feci. Un 20% viene riassorbito dal sangue e ritorna al fegato. Una piccola quota dell urobilinogeno riassorbito sfugge al fegato e viene escreta con le urine. La bilirubina non-coniugata è liposolubile. Pertanto è dannosa se è presente nel sangue a livelli elevati e può raggiungere, nei neonati l encefalo, causando danni (ittero nucleare). 25

Figura 2,17. Metabolismo dell emoglobina. L ittero può essere classificato in ittero da bilirubina non-coniugata ed ittero da bilirubina coniugata oppure in ittero pre-epatico, ittero epatico ed ittero post-epatico. Seguiremo questa ultima classificazione. Ittero pre-epatico (Figura 2,18b) Si ha un aumento della produzione di bilirubina per aumentata distruzione dei globuli rossi in conseguenza dei vari tipi di anemia e nella degradazione di grossi ematomi. La quantità di bilirubina prodotta supera la capacità del fegato di coniugazione e di escrezione della bilirubina, per cui aumenta nel sangue la bilirubina non-coniugata, ma non compare nelle urine. Aumenta pure la quantità di bilirubina coniugata escreta con la bile nell intestino, essendo aumentato il carico. Le feci sono ipercromiche e così le urine, in quanto aumenta l eliminazione dell urobilinogeno con le urine. Ittero epatico (Figura 2,19) 26

Si può avere un aumento della bilirubina non-coniugata o coniugata a seconda della causa scatenante, come di seguito riportato: Bilirubina non-coniugata - Sindrome di Gilbert. E una sindrome genetica ereditaria, autosomica dominante, in cui si ha una ridotta captazione della bilirubina, in quanto manca la proteina necessaria per veicolare la bilirubina all interno della cellula epatica. - Presenza di farmaci. Alcuni farmaci, come la rifampicina, interferiscono con la captazione della bilirubina. - Sindrome di Crigler-Najjar. E una sindrome genetica ereditaria, in cui manca la glucoroniltransferasi. Pertanto la bilirubina non viene coniugata e quindi non viene resa solubile. - Danno epatocellulare generalizzato. Le cellule epatiche danneggiate non sono più in grado di captare o coniugare la bilirubina. In questi casi si ha aumento della bilirubina non-coniugata, diminuzione della coniugata, così come dell urobilinogeno. Le feci e le urine sono ipocromiche (Figura 2,19a) Bilirubina coniugata - Sindrome di Dubin-Johnson. E una sindrome genetica ereditaria, in cui mancano gli enzimi necessari per la secrezione della bilirubina coniugata nella bile. - Sindrome di Rotor. E una sindrome genetica ereditaria, in cui è alterata la secrezione di bilirubina nella bile. - Danno epatocellulare. Le cellule epatiche danneggiate non sono in grado di immettere la bilirubina coniugata nei canalicoli biliari. - Farmaci che causano colestasi intraepatica. - Colestasi associata a gravidanza. In questi casi si ha aumento della bilirubina coniugata nel sangue, non potendo essere secreta nei canalicoli biliari. La bilirubina non-coniugata è invariata come quantità, mentre diminuisce il contenuto di urobilinogeno nelle feci e nelle urine e si ha la presenza di bilirubina coniugata nelle urine, dove può passare essendo solubile (Figura 2,19b). Ittero post-epatico (Figura 2,20) Si ha ostruzione dei dotti biliari per: - Calcoli biliari. I calcoli si formano dai costituenti della bile, colesterolo, sali di calcio (fosfati e carbonati), bilirubina. L 80% dei calcoli sono di colesterolo, mentre il restante 20% sono di pigmento. I calcoli di colesterolo si formano quando la bile diviene soprasatura di colesterolo per obesità o aumento dell età o per mancanza dei sali biliari, che sono necessari per tenere il 27

colesterolo in soluzione. La concentrazione dei sali biliari diminuisce per diminuzione degli estrogeni o per perdite eccessive dall intestino a causa di stati di malassorbimento, nella malattia di Crohn o nella fibrosi cistica. I calcoli di pigmento si formano nei pazienti con elevata distruzione eritrocitaria, con cirrosi o con infezioni biliari croniche. In queste ultime, la presenza di batteri ritrasforma la bilirubina coniugata in non- coniugata per opera di glicuronidasi. - Stenosi causate da infiammazione e fibrosi - Carcinoma della testa del pancreas. E il più frequente tra i carcinomi del pancreas. Il carcinoma del pancreas è una delle cause di morte più frequente per tumore, con incidenza crescente nei paesi occidentali. L unico fattore strettamente associato con il carcinoma del pancreas è il fumo. Sembra che siano importanti anche i fattori dietetici e l esposizione a cancerogeni chimici. La maggior parte sono adenocarcinomi. - Compressione dei dotti biliari da masse estrinseche, come le linfoghiandole ingrandite. Gli aspetti clinici di questa condizione nota anche come ittero colostatico o ostruttivo sono: ittero, assenza di bile nelle feci, che sono pallide (acoliche), alterazione dell assorbimento dei grassi (steatorrea) e della vitamina K, prurito per accumulo dei sali biliari, presenza di bilirubina coniugata nelle urine. CIRROSI Cirrosi alcoolica Nella steatosi indotta da alcool alcune cellule possono andare in necrosi a causa della presenza dei trigliceridi, con conseguente processo infiammatorio cronico. A livello degli spazi di Disse, le cellule di ITO, che normalmente accumulano lipidi e vitamina A, da cedere in caso di necessità, sono stimolate a produrre fibre collagene, quindi diventano fibroblasti. Tale trasformazione pare essere indotta da citochine e fattori di crescita (IL-1, TNFα, TNFβ, TGFβ) prodotti dai linfociti, che fanno parte del processo infiammatorio, dalle cellule endoteliali e dalle cellule di Kupffer, dalle alterazioni della matrice extracellulare e dalle tossine liberate dagli epatociti in necrosi. Le fibre collagene, prodotte dai fibroblasti in continua proliferazione, partendo dagli spazi portali suddividono il parenchima epatico in tanti piccoli noduli. Anche nella cirrosi che consegue all epatite il danno alla matrice extracellulare a livello degli spazi portali porta alla trasformazione delle cellule di ITO in fibroblasti. 28

All inizio l aspetto morfologico di un fegato in cirrosi è caratterizzato dalla presenza di tralci fibrosi che circondano tanti piccoli noduli. Questi noduli sono costituiti da cellule in proliferazione, la quale è stimolata con ogni probabilità dalla necrosi che si verifica per la mancanza di circolazione. Con il tempo alcuni noduli aumentano di volume, si uniscono tra di loro oppure scompaiono. Ugualmente anche i tralci fibrosi aumentano, determinando una diminuzione del parenchima e quindi del volume del fegato, una irregolarità dei margini, un aumento di consistenza dell organo. La normale circolazione epatica (vena porta ed arteria epatica sinusoidi vene centrolobulari vene epatiche) è alterata dalla presenza dei tralci fibrosi, per cui i noduli sono privi della normale circolazione e il sangue può ritornare nella vena porta aumentando la pressione. Conseguenze della cirrosi: - Ipertensione portale - Splenomegalia - Diminuzione della funzionalità epatica - Edemi ed ascite - Ittero - Varici - Encefalopatia epatica L ipertensione portale si verifica nella vena porta perché i tralci fibrosi sconvolgono la circolazione in modo tale che la circolazione ritorna su se stessa e il sangue ha difficoltà ad arrivare nelle vene epatiche, perché le fibre collagene si depositano anche nei sinusoidi, occupando gli spazi tra le cellule endoteliali ed ostacolando il flusso del sangue. L aumento di pressione porta a splenomegalia, alla formazione delle varici e all ascite. La splenomegalia è caratterizzata dalla stasi ematica e da un aumento della funzionalità della milza, che può portare ad anemia per aumentata emolisi dei globuli rossi. Le varici si formano in quanto il sangue, non potendo defluire normalmente attraverso le vene epatiche, viene deviato in altri sistemi vascolari, formando degli shunts venosi portasistemici (sono dei by-pass che si formano dovunque la circolazione portale e quella sistemica abbiano in comune un letto capillare), e soprattutto nelle vene esofagee ed emorroidarie. Questi sistemi venosi non sono in grado di accettare il surplus di sangue, così che le pareti venose si sfiancano determinando la formazione di varici, che facilmente si rompono,causando emorragie. Le emorragie pericolose che possono portare a morte sono quelle esofagee, se non si interviene tempestivamente. L ascite si forma perché l aumento di pressione nel sistema portale determina un aumento della pressione idrostatica nel circolo capillare con formazione di trasudato nella cavità peritoneale. L ascite si automantiene in quanto non è possibile togliere la causa. Come si automantiene? La perdita di liquido dal circolo viene percepita a livello renale, dove viene sintetizzata la renina, che a sua volta dà origine alle angiotensine, il cui effetto finale è la stimolazione del surrene a produrre aldosterone. L aldosterone induce l assorbimento di sodio e quindi di acqua a livello renale, il che ristabilisce la quantità di liquido persa a livello del sistema portale. La persistenza dell aumento della pressione in tale sistema riporta alla fuoriuscita di liquido e quindi all ascite. Il fegato perde con l aggravarsi dello stato di cirrosi la sua funzionalità, cioè diminuisce la sintesi delle proteine (albumina, fattori della coagulazione) e la capacità di metabolizzare gli ormoni, i farmaci ed altre sostanze esogene. La diminuzione dell albumina abbassa la pressione oncotica, aggravando l ascite e causando edemi in altre parti del corpo, esempio arti inferiori. La diminuita capacità di metabolismo comporta una maggiore attività degli ormoni, esempio dell aldosterone e degli estrogeni, una maggiore attività dei farmaci e una diminuita capacità di metabolizzare la bilirubina. L ittero è caratterizzato da un aumento di bilirubina nel sangue ed un accumulo nei tessuti, che assumono un colorito giallastro, come si può vedere bene nelle sclere e nella cute. La bilirubina può essere indiretta o non coniugata con acido glucuronico, per incapacità delle cellule epatiche ad attuare la coniugazione, oppure diretta, quando il fegato mantiene in parte la sua capacità di 29

coniugazione, ma è incapace a immetterla nel circolo biliare per alterazione anche della struttura di questo circolo, come per quello ematico (vedi sopra: ittero). L encefalopatia epatica, dovuta ad un aumento dell ammonio ematico, si manifesta con disturbi della coscienza (anomalie del comportamento, confusione, coma). Cirrosi non alcolica La cirrosi può essere anche la conseguenza di malattie croniche, dovute a virus (virus dell epatite B e C), a sostanze tossiche, ad accumulo di ferro (emocromatosi) o di rame e ad occlusione dei dotti biliari. In quest ultimo caso, oltre alla bilirubina passano in circolo anche i sali biliari, che normalmente sono contenuti nella bile. L occlusione dei dotti biliari può essere dovuta alla presenza di calcoli, che ostruiscono i dotti, a processi infiammatori a carico dei dotti (colangite cronica) ed a tumori che comprimono i dotti dall esterno (ad esempio il tumore della testa del pancreas). 30