Calprotectina ELISA Kit

Li StarFish S.r.l. Via Cavour, 35 20063 Cernusco sul Naviglio (MI), Italy Tel. +39-02-92150794 Fax. +39-02-92157285 Arbeitsanleitung/Manual info@listarfish.it - www.listarfish.it Calprotectina ELISA Kit Per la determinazione in vitro di Calprotectina (MRP 8/14) in Siero, Plasma e Urine Gültig ab / valid from 12.07.2007 IMM-K 6935 +8 C 96 +2 C

1. APPLICAZIONE Il kit ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) presentato è indicato per la determinazione in vitro di Calprotectina (MRP 8/14) in siero, palsma ed urine. E da utilizzarsi solamente per la diagnosi in vitro. 2. INTRODUZIONE Nomi alternativi della calprotectina: MRP8/14, L1, (p8,14), p34 Nomi alternativi delle due proteine che formano l eterocomplesso calprotctina: S100A8, Calgranulina A, MRP8 (Migration inhibition factor-related protein-8), CP-10 (nel topo) S100A9, Calgranulina B, MRP14 (Migration inhibition factor-related protein-14). La Calprotectina è una proteina legante il calcio secreta prevalentemente dai neutrofili e dai monociti. La Calprotectina. L eteromero è costituito da 2 proteine, S100A8 (calgranulina A) ed S100A9, chiamate anche MRP8 e MRP14, rispettivamente. L espressione di S100A8 e S100A9 nei tessuti epiteliali è stata descritta per la prima volta nelle cellule squamose e nei meccanismi di riparazione nei ratti e nei tessuti umani. Recentemente è emersa una correlazione fra S100 e certi adenocarcinomi nell uomo. I geni S100A8 e S100A9 sono localizzati sul cromosoma 21 nel tratto 1q, una regione in cui sono stati riscontrati numerosi riarrangiamenti durante l insorgenza di tumore. Livelli elevati di MRP8/14 sono stati riscontrati in numerosi siti di infiammazione e nei liquidi extracellulari di pazienti interessati da differenti processi infiammatori. La concentrazione di MRP8/14 nel sangue aumenta nei pazienti con artrite reumatoide, fibrosi cistica, sclerosi multipla e HIV, mentre elevati livelli di MRP8/14 sono stati riscontrati in feci di pazienti affetti da morbo di Crhon e cancro del colonretto [1,5]. L MRP8/14 extracellulare possiede effetti antimicrobici, inibenti la crescita ed apoptotici. Interrompe la crescita di alcuni miceti e batteri [1,2]. Impedisce inoltre la proliferazione di differenti tipi cellulari: macrofagi, linfociti, progenitori emopoietici, e linee cellulari. MRP8/14 può indurre apoptosi in alcune linee cellulari [1,2]. Hermani et al (2005) [6] ha riportato recentemente che l espressione precoce di S100A8 e S100A9 è un evento iniziale nella genesi del tumore alla prostata e potrebbe contribuire allo sviluppo, alla progressione ed estensione dei carcinomi prostatici. Inoltre hanno misurato la concentrazione di S100A9 in pazienti affetti da cancro alla prostata e paragonato le concentrazioni con S100A9 riscontrato in soggetti sani o pazienti affetti da iperplasie prostatiche benigne (BPH). Significativi aumenti dei livelli di S100A9 sono stati riscontrati nel siero dei pazienti affetti da cancro alla prostata contro i valori trovati per le iperplasie benigne, paragonabili altresì a quelli dei soggetti sani. Significato patologico e applicazione clinica Il valore diagnostico ed il vantaggio di MRP8/14 rispetto ad altri marker consiste nell essere già presente all interno delle cellule e rilasciato immediatamente dopo l attivazione delle rispettive popolazioni cellulari. Gli altri marcatori vengono prodotti a valle di una cascata di eventi o devono essere sintetizzati ex novo nel fegato. Differenti condizioni patologiche hanno dimostrato di avere correlazioni significative con i livelli di MRP8/14: Le concentrazioni di MRP8/14 nel siero, ed in particolare nel liquido sinoviale, sono fortemente correlate con il quadro delle artriti reumatoidi I livelli plasmatici di MRP8/14 sono davvero un precoce,specifico e sensibile marker predittivo delle reazioni acute di rigetto nel trapianto di reni La concentrazione di MRP8/14 nel siero è un marker prognostico nei processi infiammatori ricorrenti e negli stadi avanzati di cirrosi alcolica. MRP8/14 è utilizzato per valutare l estensione di infezioni parodontali L espressione di MRP8/14 nella malaria cerebrale è correlata con il livello di attivazione gliale nel cervello MRP8/14 è presente nei calcoli urinari e alle ghiandole salivari S100A9 nel siero può essere utilizzato come marker per discriminare fra cancro alla prostata e iperplasie prostatiche benigne (BPH)

3. MATERIALE FORNITO N. catalogo denominazione Componenti del kit quantità K 6935MTP PIASTRA Supporto con strisce 12 8 pozzetti pretrattate K 6935WP WASHBUF Tampone di lavaggio ELISA 2 100 ml 10 K 6935A2 AB Anticorpo concentrato 50 µl (anticorpo monoclonale anti-calprotectina (MRP8/14), legato a biotina) K 6935ST STD Standard di Calprotectina, 2 x 5 vials liofili (0; 3.9; 15.6; 62.5; 250 ng/ml) K 6935KO CTRL Controllo, liofilo (vedere 2 x 1 vials quanto specificato per il range) K 6935K CONJ Coniugato concentrato 50 µl (legato alla perossidasi exravidina) K 6935TMB SUB Substrato TMB 15 ml (tetrametilbenzidina), pronto all uso K 6935AC STOP Soluzione d arresto, pronta all uso 7 ml 4. MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO Acqua bidistillata Bilancia analitica Pipette da 10-1000 µl Parafilm Agitatore orizzontale di micropiastre con incubatore a 37 C Dispensatore per micropiastre o dispensatore automatico Centrifuga da 3000 g Vortex-mixer Vetreria da laboratorio Lettore di micropiastre a 450 nm ( lunghezza d onda di riferimento 620 o 690 nm) 5.PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI Al fine di poter utilizzare più volte i reattivi assicurarsi che siano conservati alle condizioni descritte sulle etichette. Preparare solo le quantità necessarie per ciascuna determinazione. Il kit può essere utilizzato per 4 volte entro la data di scadenza espressa sulla confezione. I reagenti con volumi inferiori a 100 µl possono essere centrifugati prima dell utilizzo per evitare perdite di volume. Il tampone ELISA concentrato (WASHBUF) deve essere diluito con acqua bidistillata 1:10 prima dell uso (100 ml di concentrato + 900 ml di acqua bidistillata), miscelare bene. Potrebbero verificarsi delle cristallizzazioni dovute all elevata concentrazione di sali nella soluzione madre. I cristalli devono essere sciolti a temperatura ambiente o in acqua a 37 C prima della diluizione. Il tampone concentrato è stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza presente sull etichetta. La soluzione diluita può essere conservata in un flacone chiuso a 2-8 C per 1 mese. Gli standard (STD) e i controlli (CTRL) sono stabili a 2-8 C prima della data di scadenza riportata sull etichetta. Gli standard e i controlli devono essere ricostituiti con 500 µl di acqua bidistillata. Lasciare che il contenuto della bottiglietta si amalgami per 10 minuti e quindi agitare lentamente per completare la miscelazione. Gli standard ed I controlli ricostituiti possono essere conservati a 2-8 C per 4 settimane.

L anticorpo monoclonale (AB) deve essere diluito 1:1000 con il tampone (WASHBUF) (10 µl AB e 10 ml di tampone). L anticorpo è stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza riportata. L anticorpo diluito non è stabile e non può essere conservato. Il coniugato (CONJ) deve essere diluito 1:1000 con il tampone (WASHBUF) (10 µl CONJ + 10 ml WASHBUF). L anticorpo è stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza riportata. Il coniugato diluito non è stabile e non può essere conservato. Tutti gli altri reagenti sono pronti all uso. Sono stabili fino alla data di scadenza se conservati a 2-8 C. 6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Campioni di siero e plasma Fase preanalitica Differenze significative fra livelli di calprotectina possono essere riscontarti seguendo due differenti tipi di procedure di preparazione del campione, come dimostrato paragonando 10 livelli alti di concentrazione di calprotectina nel siero e nel plasma rispettivamente. Le ragioni sono le seguenti: I granulociti sono attivati nel siero durante la coagulazione e rilasciano dei marcatori di attività. Il tempo fra la raccolta del siero e l analisi così come congelamenti e scongelamenti successivi non causano una variazione della concentrazione di calprotectina. Al contrario, nel caso dei campioni di plasma, la variazione del tempo fra la raccolta del campione e l analisi o il numero di cicli di scongelamento e congelamento ripetuti possono causare variazioni nei livelli osservati di calprotectina. Inoltre le condizioni preanalitiche dei campioni di plasma dovrebbero essere mantenute costanti. Questo è un suggerimento generale indipendentemente dall uso che si fa del materiale diagnostico. Immundiagnostik raccomanda l utilizzo di campioni di siero. I campioni di siero devono essere diluiti 1:50 con il tampone ELISA (WASHBUF) prima della misurazione I campioni di plasma (EDTA) devono essere diluiti 1:10 con il tampone ELISA (WASHBUF) prima della misurazione I campioni di urina devono essere diluiti 1:10 con il tampone ELISA (WASHBUF) prima della misurazione. 7. PROCEDURA Principio del test Il sistema utilizza la tecnica a sandwich con due anticorpi monoclonali selezionati che legano la Calprotectina umana. Gli standard, i controlli e i campioni diluiti dei pazienti che devono essere processati sono aggiunti ai pozzetti della micropiastra che presentano sul fondo un anticorpo monoclonale ad alta affinità anti-calprotectina umana. Durante la prima incubazione, la Calprotectina, presente nel campione, si lega con l anticorpo fissato. Nell incubazione successiva, un anticorpo monoclonale legato a biotina anti-calprotectina umana è aggiunto al contenuto di ogni pozzetto della micropiastra. Viene poi aggiunto in ogni pozzetto un coniugato legato alla exravidina e successivamente si formano i complessi: l anticorpo legante - Calprotectina umana anticorpo biotinilato di rilevazione coniugato con perossidasi. La tetrametilbenzidina è utilizzata come substrato per la perossidasi. Infine, viene aggiunta una soluzione acidificante d arresto per terminare la reazione. Il colore cambia da blu a giallo. L intensità della colorazione gialla dipende dalla concentrazione di Calprotectina presente nel campione. Si ottiene una curva dose-risposta dell unità di assorbanza (densità ottica, OD a 450 nm) riferita alla concentrazione, usando come riferimento i valori ottenuti dagli standard. La Calprotectina presente nei campioni dei pazienti è determinata direttamente da questa curva.

Procedura del test 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (18-26 C) e miscelare bene 2. Riportare le posizioni di STANDARD/CAMPIONE/CONTROLLO in un protocollo operativo 3. Preparare tante strisce della micropiastra quante sono necessarie. Stoccare le strisce che non vengono utilizzate a 2-8 C dopo averle coperte. Sono stabili fino alla data di scadenza. 4. Lavare benne ogni pozzetto per 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascuno di essi. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura. 5. Aggiungere 100 µl di STD/CAMPIONE/CTRL in doppio nei rispettivi pozzetti 6. Coprire con cura la piastra e incubare per 1h a 37 C su un agitatore orizzontale** 6. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascun pozzetto. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura. 7. Aggiungere 100 µl di AB (anticorpo di rilevazione) in ciascun pozzetto 8. Coprire bene la piastra e incubare per 1h a 37 C su un agitatore orizzontale** 9. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascun pozzetto. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura 10. Aggiungere 100 µl di CONJ (coniugato) in ciascun pozzetto 11. Coprire con cura la piastra e incubare per 1h a 37 C su un agitatore orizzontale** 12. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascun pozzetto. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura 13. Aggiungere 100 µl di SUB (substrato) in ciascun pozzetto 14. Incubare per 10-20 minuti al buio* a temperatura ambiente (18-26 C) 15. Aggiungere 50 µl di STOP (soluzione d arresto) in ciascun pozzetto, miscelare perfettamente 16. Determinare immediatamente l assorbanza con un lettore di micropiastre a 450 nm contro 620 (o 690) nm come riferimento. Se non vi è la possibilità di una lunghezza d onda di riferimento, leggere solo a 450 nm. Se lo standard più alto cade fuori dalla capacità del fotometro, l assorbanza deve essere misurata immediatamente a 405 nm contro un riferimento di 620 nm. *l intesità del colore cambia con la temperatura. Si raccomanda di osservare il cambiamento di colore e di fermare la reazione quando si presenta una chiara differenza. **l incubazione a 37 C su un agitatore orizzontale è raccomandata dalla metodica, se non è possibile miscelare durante l incubazione, si raccomanda di incubare a 37 C senza alcuna agitazione. 8. RISULTATI I seguenti algoritmi possono essere utilizzati alternativamente per calcolare i risultati. Si raccomanda di usare l algoritmo a 4 parametri. 1. Algoritmo a 4 parametri Si suggerisce di utilizzare in ordinata lineare la densità ottica e in ascissa logaritmica la concentrazione. Quando si usa un ascissa logaritmica, lo zero del calibratore deve essere corrispondente ad un valore inferiore ad 1 (es. 0.01).

2. Calcolo point-to-point Si raccomanda un ordinata lineare per la densità ottica ed un ascissa lineare per la concentrazione. 3. Curva algoritmica Si suggerisce di utilizzare in ordinata lineare la densità ottica e in ascissa logaritmica la concentrazione. Quando si usa un ascissa logaritmica, lo zero del calibratore deve essere corrispondente ad un valore inferiore ad 1 (es. 0.01). L accettabilità dei risultati potrebbe essere verificata prima di una loro validazione. Se questo non è possibile con il programma in uso, un controllo dei risultati in doppio potrebbe essere fatto manualmente. Siero Per ottenere la concentrazione di Calprotectina nel siero, il risultato deve essere moltiplicato per 50. Plasma (EDTA) Per ottenere la concentrazione di Calprotectina nel siero, il risultato deve essere moltiplicato per 10. Urine Per ottenere la concentrazione di Calprotectina nelle urine, il risultato deve essere moltiplicato per 10. Curva di calibrazione

STD OD1 OD2 Media OD CV (%) Conc. 0 0.050 0.047 0.049 4.7 0 1 0.119 0.104 0.112 9.5 3.9 2 0.275 0.268 0.271 1.8 15.6 3 1.021 1.080 1.050 4.0 62.5 4 2.208 2.333 2.270 3.9 250 I dati sono solo dimostrativi e non possono essere utilizzati per verificare i risultati delle determinazioni. 9. RACCOMANDAZIONI I campioni con valori di Calprotectina più alti dello standard maggiore devono essere diluiti con il tampone e riletti. 10. CONTROLLO DI QUALITA Immundiagnostik AG raccomanda l uso di campioni di controllo per il controllo di qualità interno, se sono reperibili. I campioni di controllo dovrebbero essere analizzati ad ogni seduta. L accettabilità dei risultati deve essere verificata con appropriati metodi statistici. I risultati dei campioni dei pazienti potrebbero non essere validi se nella stessa seduta uno o più valori del controllo di qualità sono fuori dai limiti. Valori attesi Valori normali Calprotectina nel siero di soggetti sani: 0.5-3µg/ml (500-3000 ng/ml) Si suggerisce a ciascun laboratorio di stabilire dei propri range di concentrazione. 11. CARATTERISTICHE DEL TEST Precisione e riproducibilità Campioni di siero Intra-Assay (n=7) Calprotectina CV [%] 1 878.58 6.16 2 1750.10 4.48 3 877.13 4.90 Inter-Assay (n=13) Calprotectina CV [%] 1 768.62 7.49 2 813.97 10.32 3 1584.67 12.86 Campioni di pasma (EDTA) Intra-Assay (n=7)

Calprotectina CV [%] 1 269.92 5.28 2 276.35 4.83 3 213.69 4.43 Inter-Assay (n=12) Calprotectina CV [%] 1 201.26 13.23 2 298.37 12.76 3 184.97 13.06 Recupero Due campioni sono stati miscelati con differenti concentrazioni di standard di Calprotectina e misurati usando il seguente schema. Campioni di siero n=2 Aggiunta Calprotectina attesa 24.1 20 44.1 41.3 24.1 30 54.1 50.9 16.5 20 36.5 34.1 16.5 30 46.5 46.1 16.5 40 56.5 53.8 Calprotectina rilevata Campioni di plasma (EDTA) n=2 Aggiunta Calprotectina attesa 18.9 20 38.9 36.3 18.9 40 58.9 55.8 18.9 60 78.9 74.3 17.1 40 57.1 60.6 17.1 60 77.1 74.9 17.1 80 97.1 94.8 Calprotectina rilevata Sensibilità Campioni di siero e plasma La sensibilità è stata misurata a B o + 2SD. Lo zero di riferimento è stato misurato 20 volte. Calprotectina valore medio [OD] Deviazione standard (SD) Limite di lettura 1 0.040 0.052 3.2 Linearità Due campioni sono stati diluiti con il tampone e poi analizzati. I risultati sono mostrati di seguito:

Campioni di siero (n=2) Diluizione Atteso Rilevato A 1:50 1425.38 1425.38 1:100 712.69 744.54 1:200 356.34 355.33 B 1:50 1026.11 1026.11 1:100 513.05 502.4 1:200 256.52 256.91 Campioni di plasma (EDTA) (n=2) Diluizione Atteso Rilevato A 1:10 244.29 244.29 1:20 122.14 115.10 1:40 61.10 57.67 B 1:10 374.54 374.54 1:20 187.30 186.93 1:40 93.65 97.98 Cross rettività Non sono state osservate reazioni di cross reattività nel siero di topo. 12. PRECAUZIONI solo per diagnostica in vitro devono essere osservate le linee guida del controllo di qualità il materiale di derivazione umana presente nel kit è stato testato ed è negativo per HIV, Epatite B ed Epatite C. In ogni caso, per ragioni di sicurezza, si raccomanda di trattare ogni componente come potenzialmente infetto. I reagenti contengono sodio azide e mertiolato come battericida. Sono entrambi tossici. I substrati per le reazioni enzimatiche colorimetriche sono tossici e cancerogeni. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. La soluzione di arresto è composta da acido solforico, che è un acido forte. Anche diluito va maneggiato con cura. Può causare bruciature e deve essere maneggiato con guanti, occhiali e camice. Gli schizzi devono essere immediatamente risciacquati con abbondanti quantità d acqua. 13. ACCENNI TECNICI Non utilizzare componenti del kit di lotti differenti I reagenti non devono essere usati oltre la data di scadenza espressa sull etichetta La soluzione del substrato deve rimanere incolore fino all utilizzo Per assicurare risultati corretti è necessario chiudere in modo appropriato le piastre durante le incubazioni. Evitare la produzione di schiuma quando si miscelano i reagenti La seduta deve procedere seguendo quanto spiegato nel manuale

14. NOTE GENERALI SUL TEST Questo sistema è stato prodotto e presentato sul mercato in accordo con le linee guida IVD del 98/79/EC. Tutti i reagenti contenuti nel kit sono solo per uso diagnostico in vitro. Sono state osservate le linee guida per i laboratori bio-medici. I tempi di incubazione, le temperature di incubazione e i volumi utilizzati sono definiti nella procedura. Ogni variazione della procedura del test, non accordata con la casa produttrice, può influenzare i risultati del test. Immundiagnostik AG non è responsabile degli eventuali danni recati da un uso non appropriato. Segnalazioni e reclami devono essere fatti entro 14 giorni dal ricevimento del prodotto. Il prodotto deve essere rispedito ad Immundiagnostik accompagnato da una spiegazione scritta. 15. BIBLIOGRAFIA 1. Striz I, Trebichavsky I: Calprotectin a pleiotropic molecole in acute and chronic inflammation. Phisiol. Res. 2004, 53: 245-253 2. Yui S et al: Calprotectin (S100A8/S100A9), an inflammatoty protein complex from neutrophils with a broad apoptosis-inducing activity. Biol.Pharm. Bull. 2003, 26: 753-760 3. Odin K et al: Two calcium-binding proteins in infiltrate macrophages of rheumatoid arthritis. Nature 1987, 330: 80-82 4. Wilkinson MM et al: Epression pattern of two related cystic fibrosis-associated calcium-binding proteins in normal and abnormal tissues. J Cell Sci. 1988, 91 (Pt2): 221-230 5. Muller F et al: Elevated serum calprotein levels in HIV-infected patients. The calprotectin in response during ZDV treatment is associated with clinical events. J Acquir.Immune Defic. Syndr 1994, 7: 931-939 6. Hermani A et al: Calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 as novel diagnostic markers in human prostate cancer. Clin Cancer Res. 2005, 11: 5146-5152.