IDENTIFICAZIONE DI SPECIE SALMONELLA

METODO NAZIONALE STANDARD IDENTIFICAZIONE DI SPECIE SALMONELLA BSOP ID 24 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 1 di 13 Riferimento no: BSOP ID 24i2

STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buono standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro sviluppo successivo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2007). Identification of Salmonella species. National Standard Method BSOP ID 24 Emissione 2. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp. Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 13

INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA...... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE... 5 INFORMAZIONE TECNICA... 5 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA... 6 2 MICRORGANISMI BERSAGLIO... 6 3 IDENTIFICAZIONE... 6 3.1 ASPETTO MICROSCOPICO.... 6 3.2 TERRENI DI ISOLAMENTO PRIMARIO.. 6 3.3 ASPETTO COLONIA..... 7 3.4 PROCEDURE DI PROVA............... 7 3.5 IDENTIFICAZIONE SUCCESSIVA........ 7 3.6 CONSERVAZIONE ED INVIO................. 7 4 - DIAGRAMMA DI FLUSSO... 8 5 REFERTAZIONE...,... 9 5.1 IDENTIFICAZIONE PRELIMINARE....... 9 5.2 CONFERMA IDENTIFICAZIONE...... 9 5.3 MEDICO MICROBIOLOGO 9 5.4 CCDC... 9 5.5 CENTRO PER INFEZIONI... 9 5.6 GRUPPO CONTROLLO INFEZIONI... 9 6 RIFERIMENTI... 10 6.1 LABORATORIO DI RIFERIMENTO..... 10 7 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI... 11. BIBLIOGRAFIA... 12 Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 13

PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato BSOP D 24 Identificazione delle specie Salmonella Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 2/ 09.11.07 1.1 2 1 Prima pagina Aggiunto il logo dell Irlanda del Nord 8 Diagramma di flusso Titolo cambiato e diagramma di flusso in formato Visio. Diagramma di flusso aggiornato 10 6 Riferimenti Inserito collegamento ai manuali d uso del laboratorio di riferimento 12 Bibliografia Bibliografia revisionata ed aggiornata Tutte Tutte Inseriti collegamenti PDF per i documenti dei MNS Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 13

SCOPO DEL DOCUMENTO Questo Metodo Nazionale Standard (MNS) descrive l identificazione delle specie Salmonella. La maggior parte delle Salmonellae è isolata dalle feci, ma i microrganismi possono essere isolati anche da altri campioni quali sangue, midollo ed urine. INTRODUZIONE Tassonomia I sierotipi di Salmonella ed Arizona appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae ed attualmente sono considerate componenti di due specie, Salmonella Bongori (in precedenza sottospecie V) e Salmonella Enterica 2,3 (comprendente sei sottospecie: I = enterica, II = salamae, IIIa = arizonae, IIIb = diarizonae, IV = houtenae, e VI = indica). La maggior parte delle salmonelle isolate (>99.5%) dall uomo appartiene ai sierotipi di Salmonella enterica. La classificazione adottata in questo MNS segue l indicazione della Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Prokaryotes 4. E comunque probabile che i laboratori continueranno nel prossimo futuro a refertare i sierotipi come specie 5. Caratteristiche Le specie Salmonella sono costituite da bastoncini Gram-negativi. Su agar sangue, le colonie presentano un diametro di 2-3. Di solito non fermentano il lattosio. Le specie Salmonella sono mobili (con poche eccezioni) anaerobie facoltative, producono acido da glucosio, solitamente con produzione di gas, e sono ossidasi negative 6. La maggior parte produce idrogeno solforato, tranne Salmonella Paratyphi A e Salmonella Typhi, che è una debole produttrice. Sono identificate utilizzando prove sierologiche e biochimiche. Le specie Salmonella sono classificate ed identificate in sierotipi secondo lo schema di Kauffmann-White 7, che raggruppa altre 2000 sierotipi. La suddivisione primaria è rappresentata dai sierogruppi O (quelli con antigene somatico comune), che sono poi suddivisi in funzione delle caratteristiche degli antigeni H (flagellari) 7. I ceppi di Salmonella Typhi possono produrre antigene Vi, formando uno strato di acido polisaccarico all esterno della parete cellulare. Quando completamente sviluppato, questo conferisce al battere la capacità di agglutinare con l antisiero Vi e lo rende non agglutinabile con l antisiero O. Antigeni simili al Vi sono pure presenti in alcuni ceppi di Salmonella Paratyphi C e Salmonella Dublin. Sono note infezioni acquisite in laboratorio, comprese quelle da Salmonella Typhi 8. Principi di identificazione Gli isolati delle colture sono identificati tramite aspetto delle colonie, sierologia (agglutinazione con antisieri specifici) e prove biochimiche. Se è richiesta la conferma dell identificazione gli isolati devono essere inviati al Laboratorio di Riferimento. INFORMAZIONE TECNICA N/D Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 13

1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA 9-18 La maggior parte delle specie Salmonella appartiene al Gruppo di Rischio 2 con eccezioni importanti per che comprendono S. Typhi e S. Paratyphi A, B & C. Tutte le manipolazioni con S. Typhi e S. Paratyphi A, B & C devono essere eseguite in condizioni di livello di Contenimento 3. S. Typhi e S. Paratyphi A, B & C causano malattie gravi e talvolta mortali. Sono state segnalate infezioni acquisite in Laboratorio. E disponibile la vaccinazione per S. Typhi. Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza nella manipolazione dei microrganismi del Gruppo di Rischio 2 documentati in questo MNS. Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza microbiologica. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto. 2 MICRORGANISMI BERSAGLIO 19 Sierotipi di Salmonella di più frequente isolamento nel Regno Unito Salmonella Enteritidis (1,9,12:g, m:-) Salmonella Typhimurium (1,4,5:i: 1,2) Salmonella Virchow (6,7:r: 1,2) Salmonella Hadar (6,8:z10: e, n, x) Salmonella Heidelberg (1,4,5,12:r: 1,2) Salmonella Newport (6,8:e, h: 1,2) Salmonella Infantis ((6,7:r: 1,5) Salmonella Agona (4,12:f, g, s:-) Sierotipi di Salmonella che causano febbre enterica Salmonella Paratyphi A (1,2,12:a: 1,2) Salmonella Paratyphi B (1,4,5,12:b: 1,2) Salmonella Paratyphi C (6,7,Vi: c: 1,5) Salmonella Typhi (9,12,Vi: d:-) 3 IDENTIFICAZIONE 3.1 ASPETTO MICROSCOPICO Colorazione Gram (consultare BSOPTP 39 - Staining Procedures) Bastoncini Gram-negativi 3.2 TERRENI SI ISOLAMENTO PRIMARIO Agar sangue incubato in aria a 35-37 C per 18-24 ore Agar CLED incubato in aria a 35-37 C per 18-24 ore Agar XLD incubato in aria a 35-37 C per 18-24 ore DCA incubato in aria a 35-37 C per 18-24 ore Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 13

3.3 ASPETTO COLONIA Le colonie su agar sangue sono umide con diametro di 2-3 mm. Su agar CLED le specie Salmonella non fermentano il lattosio (alcuni sierotipi quali S. Arizonaee e Salmonella Indiana possono fermentare il lattosio). Su agar XLD le specie Salmonella formano colonie rosse di solito con centro nero (alcuni sierotipi quali Salmonella Paratyphi A e Salmonella Typhi possono non presentare centro nero). Su DCA le colonie sono prive di colore di solito con centro nero (alcuni serotipi come Salmoella Paratyphi A e Salmonella Typhi possono non presentare centro nero). 3.4 PROCEDURE DI PROVA 3.4.1 AGGLUTINAZIONE Agglutinazione con antisiero polivalente O e H (consultare BSOPTP 3 - Agglutination Test ) Le specie Salmonella dovrebbero agglutinare con antisiero Polivalente O. Alcuni sierotipi, quale Salmonella Typhi, possono produrre l antigene Vi che può prevenire l agglutinazione con l antisiero polivalente O. Nell antisiero Polivalente O non sono inclusi gli anticorpi per tutti i sierotipi. Gli antigeni H possono non svilupparsi su alcuni agar solidi. Se opportuno, eseguire sottocolture su agar-semisolido. Sono sufficienti, per uso di routine, i seguenti antisieri a capacità limitata: Polivalente O Singolo componente O (2, 4, 6, 7,8,9,3, 10) Polivalente H Sieri rapidi H (RSD 1, 2, 3) Polivalente H fase 2 (1-7) Singolo componente H (a, b, c, d, E, G, i, r) 3.4.2 PROVE BIOCHIMICHE Ureasi (consultare BSOPTP 36 - Urease Test) Le specie Salmonella non producono ureasi Ossidasi (consultare BSOPTP 26 - Oxidase Test) Le specie Salmonella sono ossidasi-negative Confezioni commerciali per identificazione Confezioni di laboratorio per identificazione 3.5 IDENTIFICAZIONE SUCCESSIVA N/D 3.6 CONSERVAZIONE ED INVIO Se richiesto, purificare un isolato su un becco di clarino di agar nutriente per l invio al Laboratorio di Riferimento. Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 13

4 IDENTIFICAZIONE DI SALMONELLA - DIAGRAMMA DI FLUSSO Campioni clinici Terreni di isolamento primario Agar sangue Agar CLED Agar XLD DCA Colonie umide Diametro 2-3 mm Non lattosio fermentanti Colonie rosse di solito con centro nero Colonie incolori di solito con centro nero Prova ossidasi Positiva Negativa Scartare Agglutinazione con antisiero polivalente O e Vi Positiva Negativa Ureasi (37 C per 4 ore in aerobiosi) Verifica purezza su CLED (37 C per 4 ore in aerobiosi) Ureasi negativa Ureasi positiva Prove biochimiche Verifica purezza su CLED (37 C per 18 ore in aerobiosi) Scartare Verifica purezza coltura Interpretazione prove biochimiche *Per le prove di agglutinazione seguire le istruzioni del produttore. Nell'antisiero polivalente O non sono inclusi anticorpi per tutti gli antigeni O Possibile specie Salmonella Non specie Salmonella Prove di agglutinazione da piastra CLED* Una o tutte positive Tutte negative Fattore unico O (2, 4,6.7, 8, 9, 3.10) Sieri rapidi H (RSD 1, 2, 3) Fase polivalente 2 (1-7) Fattore unico H (a, b, c, d, E, G, i, r) Considerare le informazioni cliniche Se richiesto, ripetere le prove di agglutinazione da sotto-colture recenti da agar non-selettivo. Se opportuno, conservare l'isolato puro su becco di clarino di agar nutriente per l'invio al Laboratorio di Riferimento per conferma tipizzazione fagica e sierologica Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 12

5 REFERTAZIONE 5.1 IDENTIFICAZIONE PRELIMINARE Se riscontrate le appropriate caratteristiche della crescita, aspetto delle colonie e sono confermati i risultati della ureasi e di quelli sierologici. 5.2 CONFERMA IDENTIFICAZIONE Dopo i risultati ottenuti per l identificazione con confezione commerciale o di laboratorio e/o referto del Laboratorio di Riferimento. 5.3 MEDICO MICROBIOLOGO In accordo con il protocollo locale, informare il medico microbiologo di tutte le colture positive da sedi normalmente sterili e di tutti gli isolati presunti o confermati di Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi. In accordo al protocollo locale informare il medico microbiologo di un presunto o confermato isolamento di Salmonella se il modulo di richiesta contiene importanti informazioni quali: Piressia/febbre di origine ignota (PUO, FUO - pyrexia/fever of unknown origin) Setticemia Enterocolite, in modo particolare se ulcerativa con possibile perforazione intestinale Condizioni precedenti, associate a disfunzioni neurologiche sub-acute / stati confusionali o esantemi ( macchie rosa ) Viaggi all estero Infezioni urinarie secondarie a schistosomiasi Anamnesi di abuso di droghe, alcolismo, immunodeficienza o altre malattie concomitanti, quali tumori o soggetti in trattamento anti-neoplastico inducente neutropenia e/o mucosite Lavoro in laboratorio Intossicazione alimentare, specialmente se coinvolge prodotti alimentari insoliti o importati Manipolazione alimentare Ricerche in condizioni epidemiche o per condizione di portatore Seguire i protocolli locali per la refertazione al clinico 5.4 CCDC Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione. 5.5 CENTRO PER INFEZIONI 20 Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle indicazioni del COSURV. 5.6 GRUPPO CONTROLLO INFEZIONI Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati presunti e confermati delle specie Salmonella. Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 9 di 13

6 SEGNALAZIONI 6.1 LABORATORIO DI RIFERIMENTO Per informazioni sugli accertamenti disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altre, riguardanti il laboratorio di riferimento, rivolgersi a: http://www.hpa.org.uk/cfi/lep/default.htm Laboratory of Enteric Pathogens Specialist and Reference Microbiology Division Health Protection Agency 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ Contattare il centralino del SRMD: Tel. +44 (0) 20 8200 4400 Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 10 di 13

7 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questo Metodo Nazionale Standard è stato sviluppato, revisionato e controllato dallo Standard Methods Working Group for Bacteriology (http://www.hpastandardmethods.org.uk/wg bacteriology.asp). Si ringraziano per la collaborazione i numerosi operatori dei laboratori di batteriologia e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento, ed il Redattore Medico per la revisione finale. I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per altre informazioni prendere contatti con: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale London NW9 5EQ E-mail: standards@hpa.org.uk Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 13

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18. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; 2001. 19. Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strockbine NA. Escherichia, Shigella, and Salmonella. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, editors. Manual of Clinical Microbiology. 7 th ed. Washington D.C: American Society for Microbiology; 1999. p. 459-74. 20. Health Protection Agency. Laboratory Reporting to the Health Protection Agency. Guide for diagnostic laboratories. February 2007. Revisione no: 2 Data di revisione 09.11.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 13 di 13 Riferimento no: BSOP ID 24i2