IDENTIFICAZIONE DI SPECIE SALMONELLA

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1 METODO NAZIONALE STANDARD IDENTIFICAZIONE DI SPECIE SALMONELLA BSOP ID 24 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Specialist and Reference Microbiology Division Revisione no: 1.1 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 1 di 12 Riferimento no: BSOP ID 24i1.1 Questa POS deve essere usata congiuntamente alle altre POS emesse dalla Health Protection Agency

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo [email protected]. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo [email protected]. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2004). Identification of Salmonella species. National Standard Method BSOP ID 24 Emissione 1. Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 12

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 INTRODUZIONE... 5 SCOPO DEL DOCUMENTO TASSONOMIA CARATTERISTICHE PRINCIPI DI IDENTIFICAZIONE CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA MICRORGANISMI BERSAGLIO IDENTIFICAZIONE PROVE E RISULTATI IDENTIFICAZIONE DI SALMONELLA - PROPOSTA OPERATIVA INTERPRETAZIONE E REFERTAZIONE DEI RISULTATI SEGNALAZIONI BIBLIOGRAFIA Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 12

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato BSOP D 20 Procedura Operativa Standard per l identificazione delle specie Salmonella Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la [email protected]. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 1/ Prima pagina Stato del documento Ridisegnata Rinominato 4 Pagina di modifica Ridisegnata Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 12

5 PROCEDURA OPERATIVA STANDARD PER IDENTIFICAZIONE DELLE SPECIE SALMONELLA INTRODUZIONE Scopo del documento Questa POS descrive l identificazione delle specie Salmonella. La maggior parte delle Salmonellae è isolata dalle feci, ma i microrganismi possono essere isolati anche da altri campioni quale sangue, midollo ed urine. Tassonomia I sierotipi di Salmonella ed Arizona appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae ed attualmente sono considerate componenti di due specie, Salmonella bongori (precedente sottospecie V) e Salmonella enterica 1,2,3 (che comprende sei sottospecie: I = enterica, II = salamae, IIIa = arizonae, IIIb = diarizonae, IV = houtenae, e VI = indica). La maggior parte delle salmonelle isolate (>99.5%) dall uomo appartiene ai sierotipi di Salmonella enterica. E probabile che nel prossimo futuro 4 i laboratori continueranno a refertare i sierotipi come specie ed è la scelta adottata anche in questa POS. Caratteristiche Le specie Salmonella sono bastoncini Gram-negativi. Su agar sangue, le colonie presentano un diametro di 2-3. Di solito non fermentano il lattosio. Le specie Salmonella sono mobili (con poche eccezioni) anaerobie facoltative, producono acido da glucosio, solitamente con produzione di gas, e sono ossidasi negative 5. La maggior parte produce idrogeno solforato, tranne Salmonella typhi e Salmonella paratyphi A, che è una debole produttrice. Sono identificate utilizzando prove sierologiche e biochimiche. Le specie Salmonella sono classificate ed identificate in sierotipi secondo lo schema di Kauffmann-White6, che raggruppa altre 2000 sierotipi. La suddivisione primaria è rappresentata dai sierogruppi O (quelli con antigene somatico comune), che sono poi suddivisi in funzione delle caratteristiche degli antigeni H (flagelli) 6. I ceppi di Salmonella typhi possono produrre antigene Vi, formando uno strato di acido polisaccarico all esterno della parete cellulare. Quando completamente sviluppato, questo manto conferisce al battere la capacità di agglutinare con l antisiero Vi e lo rende non agglutinabile con l antisiero O 7. Antigeni simili al Vi sono pure presenti in alcuni ceppi di Salmonella paratyphi C e Salmonella dublin. Sono note infezioni acquisite in laboratorio, compresa S. typhi 8. Principi di identificazione Gli isolati delle colture sono identificati associando aspetto delle colonie, sierologia (agglutinazione con antisieri specifici) e prove biochimiche. Se è richiesta la conferma dell identificazione, gli isolati devono essere inviati al Laboratorio di Riferimento. Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 12

6 1.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA La maggior parte delle specie Salmonella appartiene al Gruppo di Rischio 2 con eccezioni importanti per che comprendono S. typhi e S. paratyphi A, B & C. Tutte le manipolazioni con S. typhi e S. paratyphi A, B & C devono essere eseguite in condizioni di livello di Contenimento 3 S. typhi, e S. paratyphi A, B & C. Causano malattie gravi e talvolta mortali. Sono state segnalate infezioni acquisite in Laboratorio. E disponibile la vaccinazione per S. typhi; procedure per la politica di immunizzazione sono fornite dal PHLS Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza nella manipolazione dei microrganismi del Gruppo di Rischio 2 documentati in questa POS Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza microbiologica Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto 2 MICRORGANISMI BERSAGLIO Sierotipi di Salmonella di più frequente isolamento nel Regno Unito (1998) Salmonella enteritidis (1,9,12:g, m) Salmonella typhimurium (1,4,5:i: 1,2) Salmonella virchow (6,7:r: 1,2) Salmonella hadar (6,8:z10: e, n, x) Salmonella heidelberg (1,4,5,12:r: 1,2) Salmonella newport (6,8:e, h: 1,2) Salmonella infantis ((6,7:r: 1,5) Salmonella agona (4,12:f, g, s:-) 2.2 Sierotipi di Salmonella che causano febbre enterica Salmonella paratyphi A (1,2,12:a: 1,2) Salmonella paratyphi B (1,4,5,12:b: 1,2) Salmonella paratyphi C (6,7,Vi: c: 1,5) Salmonella typhi (9,12,Vi: d:-) Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 12

7 3.0 IDENTIFICAZIONE PROVE E RISULTATI 3.1 Terreni di primo isolamento Agar sangue incubato in aria a C per ore Agar CLED incubato in aria a C per ore Agar XLD incubato in aria a C per ore DCA incubato in aria a C per ore 3.2 Aspetto delle colonie Le colonie su agar sangue sono umide e di 2-3 mm di diametro Su agar CLED le specie Salmonella non fermentano il lattosio (alcuni sierotipi quali S. arizonaee e S. indiana possono fermentare il lattosio) Su agar XLD le specie Salmonella formano colonie rosse di solito con centro nero (alcuni sierotipi quali S. paratyphi A e S. typhi possono non presentare centro nero) Su DCA le colonie sono prive di colore di solito con centro nero (alcuni serotini come S. paratyphi A e S. typhi possono non presentare centro nero) 3.3 Aspetto microscopico Colorazione Gram (BSOP SP 8) Bastoncini Gram-negativi 3.4 Agglutinazione Agglutinazione con antisiero polivalente O e H (BSOP TP 3) Le specie Salmonella dovrebbero agglutinare con antisiero Polivalente O. Alcuni sierotipi quali S. typhi possono produrre l antigene Vi che può prevenire l agglutinazione con l antisiero polivalente O. Nell antisiero Polivalente O non sono inclusi tutti i sierotipi. Gli antigeni H possono non svilupparsi su terreni di agar solidi. Se richieste, eseguire sottocolture su agar-semisolido. Sono sufficienti, per uso di routine, i seguenti antisieri a capacità limitata: Polivalente O Singolo componente O (2,4,6.7,8,9,3.10) Polivalente H Sieri rapidi H (RSD 1,2,3) Polivalente H fase 2 (1-7) Singolo componente H (a, b, c, d, E, G, i, r) Prove biochimiche Ureasi (BSOP TP 36) Le specie Salmonella non producono ureasi Ossidasi (BSOP TP 26) Le specie Salmonella sono ossidasi-negative Confezioni commerciali per identificazione Confezioni di laboratorio per identificazione Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 12

8 3.5 Conservazione ed invio Se richiesto, purificare un isolato su un becco di clarino di agar nutriente per l invio al Laboratorio di Riferimento Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 12

9 4.0 IDENTIFICAZIONE DI SALMONELLA - PROPOSTA OPERATIVA Campione clinico Piastra di isolamento primario (agar sangue, agar CLED, agar XLD o DCA) Agar sangue - colonie umide 2-3 mm in diametro Agar CLED - lacttosio non fermentante Agar XLD colonie rosse solitamente con centro nero DCA - colone prive di colore solitamente con centro nero Ossidasi (opzionale) Ossidasi positiva Ossidasi negativa Scartare Agglutinazione con antisiero polivalente O e Vi (opzionale)* Agglutinazione negativa Agglutinazione positiva Ureasi (37 C fino a 4 ore in aria) CLED piastra per la purezza (37 C per 18 ore in aria) Ureasi negativa Ureasi positiva Prove biochimiche CLED piastra per la purezza (37 C per 18 ore in aria) Verificare la purezza della coltura Interpretare le prove biochimiche Verificare la purezza della coltura Possibile Salmonella spp Non Salmonella spp Scartare Dalla piastra di CLED Agglutinazione con polivalente O* Agglutinazione con polivalente H* Agglutinazione Vi* Scartare Uno o tutti +ve Tutti ve Singolo componente O Sieri rapidi H (RSD 1,2,3) Singolo componente H (2,4,6.7,8,9,3.10) Fase polivalente 2 (1-7) (a, b, c, d, E, G, i, r) * Per le prove di agglutinazione segire le indicazioni del produttore. Negli antisieri Polivalenti O non sono inclusi tutti gli antigeni O Considerare le informazioni cliniche. Se opportuno, ripetere la agglutinazioni su sottocolture recenti da agar non-selettivo Se richiesto, isolare una cotura pura su becco di clarino di agar nutriente per l'nvio al Laboratorio di Riferimento per conferma fagotipizzazione e sierotipizzazione La carta di flusso è solo una proposta operativa Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Riferimento no: BSOP ID 24i1.1 Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Pagina 9 di 11

10 5.0 INTERPRETAZIONE E REFERTAZIONE DEI RISULTATI 5.1 Esecuzione di presunta identificazione Se riscontrate le appropriate caratteristiche della crescita, aspetto delle colonie, confermati i risultati di ureasi e sierologici 5.2 Conferma dell identificazione Dopo i risultati ottenuti per l identificazione con confezione commerciale e/o referto del Laboratorio di Riferimento 5.3 Medico microbiologo In accordo con il protocollo locale, informare il medico microbiologo di tutte le colture positive da sedi normalmente sterili e di tutti gli isolati presunti o confermati di tutti gli isolati di S. typhi e S. paratyphi 5.4 CCDC In accordo al protocollo locale informare il medico microbiologo di un presunto o confermato isolamento Salmonella se il modulo di richiesta contiene importanti informazioni quali: piressia/febbre di origine ignota (PUO, FUO - pyrexia/fever of unknown origine setticemia enterocolite, in modo particolare con ulcerazione e possibile perforazione intestinale condizioni precedenti, associate a disfunzioni neurologiche sub-acute / stati confusionali o esantemi macchie rosa ) viaggi all estero infezioni urinarie secondarie a schistosomiasi storia di abuso di sostanze, alcolismo, immunodeficienza o altre malattie concomitanti, quali tumori o soggetti in trattamento anti-neoplastico, includente neutropenia e/o mucosità lavoro in laboratorio intossicazione alimentare, specialmente se coinvolge importazione alimentare di prodotti usuali manipolazione alimentare ricerche in condizioni epidemiche o per condizione di portatore Seguire i protocolli locali per la refertazione al clinico 5.5 CDSC 21 Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle indicazioni del COSURV 5.6 Gruppo di lavoro delle infezioni Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati confermati delle specie Salmonella, Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 10 di 12

11 6.0 SEGNALAZIONI 6.1 Esami richiesti Conferma dell identificazione, sierotipizzazione e fagotipizzazione. 6.2 Le colture devono essere inviate su becco di clarino di agar nutriente E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto 6.3 Altre richieste Segnalare sempre al Laboratorio di Riferimento l invio di colture urgenti 6.4 Laboratorio di Riferimento Laboratory of Enteric Pathogens Specialist and Reference Microbiology Division Health Protection Agency 61 Colindale Avenue London NW9 5HT Contattare il centralino del SRMD: Tel. +44 (0) Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 12

12 BIBLIOGRAFIA 1 Le Minor L, Popoff MY. Request for an opinion. Designation of Salmonella enterica sp. nov., nom. rev., as the type and only species of the genus Salmonella. Int J Syst Bacteriol 1987;37: Old DC. Nomenclature of Salmonella. J Med Microbiol 1992;37: Gillespie SH. Salmonella. In: Emmerson AM, Hawkey PM, Gillespie SH, editors. Principles and Practice of Clinical Bacteriology. Chichester: John Wiley & Sons; p Reeves MW, Evins GM, Heiba AA, Plikaytis BD, Farmer JJ 3 rd. Clonal nature of Salmonella typhi and its genetic relatedness to other Salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis and proposal of Salmonella bongori comb.nov. J Clin Microbiol 1989;27: LeMinor L. genus III. Salmonella. In : Krieg NR, Holt JG, editors. Bergey s Manual of Systematic Bacteriology. Vol 1. Baltimore: Williams and Wilkins: p Salmonella Subcommittee of Nomenclature Committee of the International Society for Microbiology. The Genus Salmonella lignières, J Hyg 1934;34: Old DC. Salmonella. In: Collee JG, Fraser AG, Marmion BP, Simmons A, editors. Mackie & McCartney Practical Medical Microbiology. 14 th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; p Blaser MJ, Lofgren JP. Fatal salmonellosis originating in a clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol 1981;13: Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Categorisation of biological agents according to hazard and categories of containment, 4th ed. Suffolk: HSE books; 1995 (with supplements 1, 1998 and 2, 2000) 10 Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety precautions: notes for guidance, 4th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step-by-step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; April Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; March Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2nd ed. Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Accommodation for pathology services. 1st ed. London: Her Majesty s Stationary Office (HMSO); 1991 (Out of print 2nd edition in press) 16 BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strockbine NA. Escherichia, Shigella, and Salmonella. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, editors. Manual of Clinical Microbiology. 7 th ed. Washington D.C: American Society of Microbiology; p PHLS CDSC. Reporting to the PHLS Communicable Disease Surveillance Centre: a reference for laboratories. May 2001 Revisione no: 1.1 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 12 di 12 Riferimento no: BSOP ID 24i1.1