FORMALDEIDE URINARIA in UV Codice Z65010 BIOCHIMICA Il dosaggio della Formaldeide urinaria viene effettuato in seguito all esposizione a Formaldeide e Metanolo. La Formaldeide è un inquinante così detto ubiquitario, perché lo si trova praticamente dappertutto, anche nelle città e lungo le strade a causa del traffico. E' uno dei principali inquinanti presente nelle abitazioni e negli uffici, a causa non solo del fumo di sigaretta, ma anche del lento rilascio dei mobili (è presente nel truciolato, nel compensato e nelle colle). Troviamo Formaldeide anche negli alimenti (in Italia è ammessa come conservante con la sigla E240), nella cosmesi, negli imballaggi, nella colla usata per i libri e le riviste. In campo industriale, la Formaldeide trova larghissimo impiego nella fabbricazione di resine sintetiche, colle, solventi, vernici, conservanti, disinfettanti e deodoranti, detergenti e saponi, cosmetici, tessuti ed inoltre come intermedio per la sintesi di farmaci. Il Metanolo è utilizzato nella produzione di cellulosa, resine sintetiche, formaldeide, acido acetico e carburanti. Esso viene metabolizzato nel fegato ed escreto nelle urine sotto forma di Formaldeide, Acido Formico e CO 2. L alcool deidrogenasi rappresenta la prima via metabolica che ossida il Metanolo in Formaldeide. La successiva ossidazione della Formaldeide ad Acido Formico avviene per opera dell aldeide deidrogenasi, reazione estremamente rapida, tanto che in pazienti con intossicazione certa da Metanolo non è possibile dosare la Formaldeide né nei tessuti né nei liquidi biologici. TOSSICITÀ Da lungo tempo sono noti gli effetti tossici della Formaldeide, presente già a basse dosi. Si tratta di una sostanza fortemente irritante; la sua presenza viene immediatamente avvertita a causa dell odore caratteristico e del tipico bruciore agli occhi. L effetto più preoccupante riguarda la sua capacità di indurre mutazioni e tumori. Lo IARC (International Agency for Research on Carcer), nel mese di giugno 2004 ha classificato la formaldeide nel gruppo 1 dei cancerogeni, cioè nei cancerogeni certi per l uomo. Il presente metodo permette di dosare la Formaldeide urinaria in HPLC. E una sostanza escreta per diffusione e quindi non dipende dalla concentrazione della Creatinina (v. linee guida AIDII- Associazione Italiana Degli Igienisti Industriali). EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Release N 003 Formaldeide urinaria in UV Marzo 2010 1
CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del Metodo: Il presente metodo consente di determinare le concentrazioni urinarie della Formaldeide dopo derivatizzazione del campione urinario a 70 C per 15 minuti. Il campione derivatizzato viene diluito ed iniettato nel cromatografo HPLC. Recupero del Metodo: 100 % Sensibilità del Metodo: 0,15 mg/l Range dinamico del Metodo: 0,15 100 mg/l Valori di riferimento: < 5,6 mg/l Contenuto della confezione: Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a temperatura ambiente (< 20 C). Reagente A - Soluzione Tampone 1, 1 x 10 ml Reagente B - Soluzione Tampone 2, 1 x 10 ml Reagente C - Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml Reagente D Soluzione Test/Standard chimico, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente M - Fase Mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl Detector UV λ = 385 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità di raccolta delle urine : Urine di fine turno. Stoccare il campione a 2-8 C per 2 giorni, a -20 C fino a 3 mesi. 2
PROCEDURA PREANALITICA Preparazione della Soluzione Test a 36,5 mg/l FASE 1 : Derivatizzazione della Soluzione Test Test Reagente A Soluzione Tampone 1 100 µl Reagente D Soluzione Test 50 µl Reagente B Soluzione Tampone 2 100 µl Reagente C Sol. Derivatizzante 100 µl Al vortex per 10 secondi FASE 2 : Incubare a 70 C per 15 minuti Raffreddare FASE 3 : Aggiungere al Test derivatizzato 500 µl di H 2 O di grado HPLC NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 50 µl di questa soluzione in HPLC per identificare il tempo di ritenzione della Formaldeide che deve essere simile a quello riportato in fig.1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questo Test così ottenuto non deve essere usato come calibratore. PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione della soluzione Standard di calibrazione a 3,65 mg/l In una provetta pipettare : 900 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente D - Standard Chimico IMPORTANTE: La soluzione standard di calibrazione va preparata di volta in volta FASE 2 : Derivatizzazione del Bianco (necessario come punto 0 di calibrazione), dei Campioni, dello Standard Chimico e degli eventuali Controlli Dispensare in provetta tipo eppendorf da 1,5 ml con tappo: Bianco Standard Campione Controllo Reagente A Soluzione Tampone 1 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Acqua di grado HPLC 50 µl Standard chimico a 3,65 mg/l 50 µl Campione 50 µl Controllo 50 µl Reagente B Soluzione Tampone 2 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Reagente C Sol. Derivatizzante 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Al vortex per 10 secondi Release N 003 Formaldeide urinaria in UV Marzo 2010 3
FASE 3 : Incubare a 70 C per 15 minuti Raffreddare FASE 4 : Aggiungere al Campione derivatizzato 500 µl di H 2 O di grado HPLC. N.B.: il campione così preparato è stabile 2-3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 50 µl del sovranatante limpido nel cromatografo HPLC e attendere la stampa del cromatogramma. Release N 003 Formaldeide urinaria in UV Marzo 2010 4
FORMALDEIDE - Avvertenze REAGENTE D : SOLUZIONE TEST/STANDARD CHIMICO FORMALDEIDE 36,5 mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 385 nm 0,002 AUFS 5 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column (1 x 3 pz), cod. ZA600MG e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ). Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. E possibile effettuare analisi anche a ricircolo di fase; in tal caso si osserverà un progressivo ingiallimento della Fase Mobile che, in genere, non disturba la linearità della linea di base. Se la temperatura amb. del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 100 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z65020 Standard chimico per Formaldeide 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S394983500 Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 5
FORMALDEIDE URINARIA ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 1 Soluzione Test Fig. 2 Bianco Fig. 3 Standard di Calibrazione R.T. 10.39 Formaldeide 36,5 mg/l R.T. 10.31 Formaldeide R.T. 10.33 Formaldeide 3,65 mg/l 6
FORMALDEIDE URINARIA ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 4 Standard di calibrazione diluito (Controllo) Fig. 5 Campione di urina arricchito R.T. 10.29 Formaldeide 0,365 mg/l R.T. 10.31 Formaldeide 0,40 mg/l 7