CITOMEGALOVIRUS IgG AVIDITY

0123 CITOMEGALOVIRUS IgG AVIDITY EIA WELL REF K3CGA 96 45 Determinazioni Italiano p. 3 English p. 12 M169 Rev.8 02/2006 Pag. 1/24

REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant. Stato fisico, Physical state MTP 1 x 96 Pronti per l'uso, Ready for use WASH 1 x 50 ml Conc. DIL CTR BA CTR AA DISS CONJ TMB STOP 1 x 20 ml Conc. 1 x 2 ml Liof. Lyoph. 1 x 2 ml Liof. Lyoph. 1 x 10 ml Pronto per l'uso Ready for use 1 x 14 ml Pronto per l'uso Ready for use 2 x 15 ml Pronto per l'uso Ready for use 1 x 14 ml Pronto per l'uso Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo www.radim.com". The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website www.radim.com". Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση www.radim.com". In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse www.radim.com konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse www.radim.com. Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet www.radim.com. "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço www.radim.com." M169 Rev.8 02/2006 Pag. 2/24

DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE DELL'AVIDITÀ DELLE IgG ANTI-CITOMEGALOVIRUS NEL SIERO O PLASMA UMANO. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE Il Citomegalovirus (CMV) è un virus con struttura icosaedrica di diametro ca. 180-250 nm, appartenente alla famiglia dei virus erpetici. L'effetto del virus è di tipo citopatico, con ingrossamento delle cellule ospiti e rilevazioni di inclusi citoplasmatici e nucleari. Il CMV è considerato oggi la più frequente causa di anomalie congenite in seguito ad infezioni intrauterine. Circa il 2% delle donne in gravidanza contrae un'infezione primaria o una reinfezione, mentre il 10-20% di neonati con infezioni congenita da CMV presenta danni significativi al sistema nervoso centrale. Si ritiene attualmente che il danno fetale sia principalmente dovuto ad una infezione primaria, piuttosto che ad una reinfezione. Il CMV è anche una importante causa di complicazioni nel trapianto di organi, specialmente del rene. Anche in questi casi l'infezione primaria ha un impatto clinico molto maggiore della reinfezione. La diagnosi di infezione primaria di recente acquisizione mediante dosaggio delle IgM specifiche è resa difficile dalla presenza di questa classe di anticorpi anche in caso di infezione ricorrente; inoltre le IgM possono persistere in circolo per molti mesi, e nei pazienti immunodepressi, anche per 2 anni. La misura dell'avidità delle IgG specifiche si è rivelata particolarmente utile nell'identificare una infezione primaria, in quanto la prima risposta anticorpale IgG all'infezione è costituita da anticorpi con bassa avidità, il cui legame con l'antigene specifico può essere facilmente dissociato. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il presente kit è basato su una metodica immunoenzimatica (ELISA), in cui il siero del paziente viene fatto reagire in duplicato con l'antigene CMV adeso nei pozzetti di una micropiastra. Dopo la prima incubazione, seguita da un lavaggio della micropiastra, i due pozzetti vengono incubati con due soluzioni tampone diverse, una delle quali contiene urea. Quest'ultimo reagente provoca la dissociazione del legame antigene-anticorpo precedentemente formatosi, in misura diversa a seconda dell'avidità degli anticorpi. Dopo un ulteriore lavaggio, gli anticorpi rimasti legati alla fase solida vengono evidenziati mediante successive reazioni con un anticorpo anti-igg umane marcato con perossidasi (HRPO) e con un Cromogeno (TMB) in tampone substrato. Il rapporto tra le densità ottiche dei due pozzetti, misurate a 450 e a 405 nm, viene calcolato ed espresso come percentuale di avidità. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 3/24

3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA' I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti, corrispondenti a 45 determinazioni. Il kit deve essere conservato a 2-8 C. La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. Una volta aperto il kit è stabile 2 mesi a 2-8 C. 3.1 Reagenti Specifici MTP Micropiastra sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti divisibili singolarmente, sensibilizzati con antigene del virus CMV. I pozzetti non utilizzati devono essere riposti a 2-8 C nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata accuratamente. CTR BA Controllo a Bassa Avidità: 1 flacone di matrice sierica contenente IgG umane anti-cmv a bassa avidità. Liofilo e colorato in rosso. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Al momento dell'uso, ricostituire il contenuto del flacone con 2 ml di H 2 O distillata. Dopo ricostituzione, conservare a 2-8 C per 2 mesi; per periodi più lunghi congelare a -20 C. CTR AA Controllo ad Alta Avidità: 1 flacone di matrice sierica contenente IgG umane anti-cmv ad alta avidità. Liofilo e colorato in azzurro. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Al momento dell'uso, ricostituire il contenuto del flacone con 2 ml di H 2 O distillata. Dopo ricostituzione, conservare a 2-8 C per 2 mesi; per periodi più lunghi congelare a -20 C. DISS Reattivo Dissociante: 1 flacone (10 ml) di Urea in soluzione tampone. Pronto per l'uso. CONJ Coniugato Enzimatico: 1 flacone (14 ml) di anti-igg umane monoclonali da topo coniugate con perossidasi di rafano (HRPO) in matrice sierica e stabilizzanti. Pronto per l'uso e colorato in rosa. Conservante: Neomicina. 3.2 Reagenti Comuni per i kit delle Linee To.R.C.H. M.S.T. e Malattie dell infanzia WASH Soluzione di Lavaggio (concentrata): 1 flacone (50 ml) di PBS- Tween20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). Al momento dell'uso diluire la quantità necessaria 1:20 con H 2 O distillata. Dopo diluizione il tampone di lavaggio è stabile 30 giorni a 2-8 C. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli, ponendo il flacone a 37 C per qualche minuto. DIL Diluente dei Campioni (concentrato): 1 flacone (20 ml) di matrice sierica e stabilizzanti, colorato in rosso. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Al momento dell'uso diluire 1:20 con la soluzione di lavaggio già diluita. Il diluente così preparato è stabile 30 giorni a 2-8 C. TMB Cromogeno: 2 flaconi (15 ml) di tetrametilbenzidina in tampone citrato-fosfato, DMSO e H 2 O 2. Pronto per l uso. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 4/24

STOP Reagente Bloccante: 1 flacone (14 ml) di H 2 SO 4 1N. Pronto per l'uso. CPA Copripiastra adesivo Bustina di plastica trasparente con minigrip 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 4.1 Dosaggio Manuale Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile. Stufa termostatata a 37±2 C. Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi. Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre. Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in assorbanza nell'intervallo 0-3.0 A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm. H 2 O distillata. 4.2 Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti. E possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 5/24

Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale non rispetto di: sequenza e quantità nell aggiunta dei reattivi tempi e temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare l ottenimento di dati clinici non attendibili. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Assicurarsi che la pompa di aspirazione oppure l apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre sia perfettamente funzionante. Un lavaggio non accurato delle micropiastre può dare luogo a misclassificazione dei campioni. E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione. Assicurarsi che lo spettrofotometro per micropiastre sia perfettamente funzionante. L utilizzo di uno spettrofotometro non calibrato o con filtri non puliti, può comportare un errore nella lettura dei campioni, con conseguente possibile misclassificazione degli stessi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Assicurarsi che la stufa termostatata (se necessaria) sia perfettamente funzionante. L incubazione a temperature diverse da 37±2 C può dare luogo a perdita di sensibilità e/o a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata. Assicurarsi che l agitatore per micropiastre (se necessario) sia perfettamente funzionante. L agitazione in condizione diverse dall atteso può dare luogo a misclassificazione dei campioni. E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione. Assicurarsi che la strumentazione utilizzata per la conservazione dei campioni e/o del dispositivo sia perfettamente funzionante. La conservazione a temperature diverse dall atteso, può dare luogo a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 6/24

Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-hiv e anti-hcv e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER 180103; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. 6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma umano. Campioni moderatamente lipemici non influenzano i risultati del dosaggio; campioni fortemente lipemici o emolizzati possono alterare i risultati. La presenza di filamenti di fibrina può interferire nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni siano perfettamente limpidi prima di dosarli. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 1-2 giorni, a -20 C per tempi più lunghi. Si consiglia di non congelare e scongelare ripetutamente i campioni. Allo scopo di confrontare tra loro successivi prelievi dello stesso paziente, si consiglia di inserirli nello stesso dosaggio. Prima dell uso, diluire i campioni 1:300 con il Diluente dei Campioni precedentemente preparato (es. 10 µl di campione + 2990 µl di Diluente). 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO * Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 7/24

Agitare i campioni per inversione prima dell'uso. 7.1 Preparare i pozzetti in duplicato per: Bianco, Controllo a Bassa Avidità, Controllo ad Alta Avidità e campioni. 7.2 Dispensare 100 µl di Controllo a Bassa Avidità nei pozzetti C1 e D1; 100 µl di Controllo ad Alta Avidità nei pozzetti E1 e F1; 100 µl del primo campione (diluito) nei pozzetti G1 e H1 e proseguire così per i campioni successivi. 7.3 Incubare la micropiastra per 60±5 minuti a 37±2 C, coperta con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.4 Aspirare la miscela di incubazione ed effettuare 4 lavaggi con un volume di 350 µl per pozzetto, impiegando la Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i pozzetti. 7.5 Dispensare 100 µl di Diluente dei Campioni nei pozzetti dispari (A1, C1, E1, G1 ecc.) e 100 µl di Reattivo Dissociante nei pozzetti pari (B1, D1, F1, H1 ecc.). 7.6 Incubare la micropiastra per 30±2 minuti a 37±2 C, coperta con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.7 Aspirare e lavare la micropiastra come al punto 7.4. 7.8 Dispensare 100 µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti. 7.9 Incubare la micropiastra per 30±2 minuti a 37±2 C, coperta con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.10 Aspirare e lavare la micropiastra come al punto 7.4. 7.11 Dispensare 100 µl di Cromogeno in tutti i pozzetti. 7.12 Incubare per 10 minuti a 37±2 C, al riparo dalla luce. 7.13 Dispensare 100 µl di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti. 7.14 Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow, utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere effettuata entro 15 minuti dal termine del dosaggio. * Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p. 22 M169 Rev.8 02/2006 Pag. 8/24

9. CALCOLO DEI RISULTATI * 9.a Sottrarre a tutti i pozzetti il valore del Bianco (media delle densità ottiche dei pozzetti A1 e B1). 9.b Verificare per ogni campione che la densità ottica dei pozzetti incubati con il Diluente dei Campioni sia >0.300. In caso negativo, il campione non presenta una concentrazione di IgG sufficiente per la valutazione della loro avidità (pazienti negativi all'infezione da CMV, o infetti ma con una risposta anticorpale ancora molto debole). In caso affermativo, procedere con il calcolo dei risultati. 9.c Calcolare per ogni campione e per i Sieri di Controllo il rapporto percentuale tra la densità ottica del pozzetto incubato con il Reattivo Dissociante e quella del corrispondente pozzetto incubato con il Diluente dei Campioni. Questo rapporto corrisponde alla percentuale di avidità del campione o del Siero di Controllo. D.O. con R. Dissociante D.O. con Dil. Campioni x 100 = % di avidità 9.d I campioni che presentano, in uno o in entrambi i pozzetti, D.O. >3.000 a 450 nm devono essere letti a 405 nm. Su questa lettura deve essere calcolata la percentuale di avidità come indicato al punto 9.c. * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura. 9.1 Esempio di Calcolo Campione D.O. con D.O. con % di avidità Dil. Campioni R. Dissoc. C. Bassa Av. 0.947 0.178 18.8 C. Alta Av. 1.244 0.972 78.1 Campione 0.565 0.080 14.1 9.2 Criteri di Accettazione La densità ottica a 450 nm del Controllo a Bassa Avidità e del Controllo ad Alta Avidità, misurata nei pozzetti incubati con il Diluente dei Campioni deve essere >0.500 per entrambi i controlli. La percentuale di avidità, calcolata come indicato in metodica, deve risultare <35% per il Controllo a Bassa Avidità e > 45% per il Controllo ad Alta Avidità. I risultati del dosaggio devono, comunque, essere convalidati da valutazioni cliniche ed ulteriori prove diagnostiche. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 9/24

9.3 Interpretazione dei Risultati % avidità > 45% = presenza di IgG anti-cmv ad alta avidità % avidità 35-45% = presenza di IgG anti-cmv a media avidità (zona grigia) % avidità < 35% = presenza di IgG anti-cmv a bassa avidità 10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Specificità Diagnostica La specificità diagnostica è stata valutata su un gruppo di 118 campioni con infezioni pregresse o secondarie clinicamente certe, ed è risultata essere del 97.4%. 10.2 Sensibilità Diagnostica La sensibilità è stata valutata su un gruppo di 33 campioni con infezione primaria, ed è risultata essere del 93.9%. 10.3 Specificità Analitica La specificità analitica, è definita come la capacità del test di rilevare esattamente l analita in presenza di fattori potenzialmente interferenti nella matrice del campione. Studi controllati su fattori potenzialmente interferenti hanno dimostrato che le prestazioni del test non sono influenzate da anticoagulanti (EDTA ed eparina). 10.5 Precisione La precisione é stata valutata su uno strumento Radim misurando la ripetibilità e la riproducibilità (variabilità intra-saggio ed inter-saggio) su 3 sieri a differenti % di avidità. Ripetibilità (Intra-saggio) Siero Media ± D.S. C.V. Replicati (% avidità) % n. a 11.5 ± 0.8 7.1 10 b 53.2 ± 3.6 6.7 10 c 82.9 ± 2.1 2.5 10 M169 Rev.8 02/2006 Pag. 10/24

Riproducibilità (Inter-saggio) Siero Media ± D.S. C.V. Dosaggi (% avidità) % n. d 11.15 ± 2.98 26.7 10 e 18.44 ± 2.26 12.3 10 f 76.39 ± 10.64 13.9 10 11. LIMITI DEL DOSAGGIO Un risultato di alta avidità non esclude la possibilità che vi sia stata una infezione recente. Per contro, data l alta specificità del test un risultato positivo è fortemente indicativo di una infezione entro i precedenti 3 mesi. 12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20 M169 Rev.8 02/2006 Pag. 11/24

ENZYME IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF ANTI-CITOMEGALOVIRUS IgG ANTIBODIES AVIDITY IN HUMAN SERUM OR PLASMA. FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS Cytomegalovirus (CMV) is a virus of icosahedral shape, 180-250 nm in diameter, belonging to the Herpes Viruses family. The Virus has a cytopathological effect, with enlargement of the host cells and evidence of cytoplasmic as well as nuclear inclusions. Currently CMV is currently considered the most frequent cause of congenital anomalies in consequence of intrauterine infections. About 2% of pregnant women contract primary infection or reinfection, whereas 10-20% of new-born babies with CMV congenital infections show significant injuries to the central nervous system. Fetal damage is now thought to be mainly due to primary infection, rather than to a re-infection. CMV is also an important cause of complications in organ transplantation, particularly in kidney transplantation. Again in these cases, primary infection is more harmful than a re-infection. The diagnosis of recently acquired primary infection by means of specific IgM antibodies can be difficult, due to the IgM presence even in recurring infections. In addition, circulating IgM antibodies may persist for a lot of months and even for two years in immunodepressed subjects. Measuring the avidity of specific IgG was demonstrated to be particularly useful in identifying primary infection. As a matter of fact, the initial IgG antibody response to infection is characterized by antibodies with low avidity, in which binding to the specific antigen sites is easily dissociated. 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), in which the patient serum is allowed to react in duplicate with the CMV antigen coating of a microplate. After the first incubation, followed by microplate washing, the replicate wells are incubated, each with a different buffer solution, one of which containing urea. The urea reagent causes dissociation of the previously formed antigenantibody binding. The degree of dissociation depends upon the given antibody avidity. After a further wash cycle, the antibodies which are still bound to the solid phase will be evidenced by subsequent reactions, first with anti-human IgG antibody (conjugated with horseradish peroxidase) and then with a chromogen solution (Tetramethylbenzidine, TMB) in substrate buffer. Colorimetric reading will be performed by using a spectrophotometer at 450 nm and at 405 nm. The ratio between the optical densities of the two wells is then calculated and expressed as percent Avidity. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 12/24

3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY The reagents are sufficient for 96 wells, which correspond to 45 tests. Store the kit at 2-8 C. The expiry date of each reagent is shown on the vial label. Once opened, the kit is stable at 2-8 C for 2 months. 3.1 Specific Reagents MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with CMV viral antigen. Keep unused wells at 2-8 C in the provided plastic bag (microplate container) and accurately sealed. CTR BA Low Avidity Control: 1 vial of serum matrix with low avidity human anti-cmv IgG. Lyophilized and red-colored. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Reconstitute the vial content with 2 ml of distilled water, before use. After reconstitution, store at 2-8 C for 2 months; for longer periods freeze at -20 C. CTR AA High Avidity Control: 1 vial of serum matrix with high avidity human anti-cmv IgG. Lyophilized and blue-colored. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Reconstitute the vial content with 2 ml of distilled water, before use. After reconstitution, store at 2-8 C for 2 months; for longer periods freeze at -20 C. DISS Dissociating Reagent: 1 vial (10 ml) of Urea in buffer solution. Ready for use. CONJ Enzyme Conjugate: 1 vial (14 ml) of mouse monoclonal anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRPO) in serum matrix with stabilizers. Ready for use and pink-colored. Preservative: Neomycin. 3.2 Common Reagents for kits of the To.R.C.H. S.T.D. and Child Disease Lines WASH Washing Solution (concentrated): 1 vial (50 ml) of PBS-Tween 20. Preservative: Thimerosal (<0.05%). Just before use, dilute the needed amount 1:20 with distilled H 2 O. Store the diluted Washing Solution for 30 days at 2-8 C. In case of undissolved crystals, re-suspend the solution by placing the vial at 37 C for a few minutes. DIL Sample Diluent (concentrated): 1 vial (20 ml) of serum matrix with stabilizers, red-colored. Preservative: NaN 3 (< 0.1%). Just before use, dilute 1:20 with the previously diluted Washing Solution. Store the diluted Sample Diluent for 30 days at 2-8 C. TMB Chromogen: 2 vials (15 ml) of Tetramethylbenzidine with citratephosphate buffer, DMSO and H 2 O 2. Ready for use. STOP Blocking Reagent: 1 vial (14 ml) of 1N H 2 SO 4. Ready for use. CPA Adhesive plate-sealers Plastic bag M169 Rev.8 02/2006 Pag. 13/24

4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 4.1 Manual Test Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. Dry Heater, adjustable at 37±2 C. Graduated cylinders for reagent dilution. Aspiration pump or automated well washing device. Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a 0-3.0 A interval at 450 nm and 405 nm. Distilled H 2 O. 4.2 Automatic Test This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots. It is possible to mix common reagents (see 3.2) from different lots. Do not use reagents beyond their expiry date. Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect: exact incubation times and quantities adding the reagents incubation times and temperature may cause incorrect clinical results. Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability of results obtained. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 14/24

In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that the aspiration pump or automated well washing device is in perfect working order. Inadequate rinsing of wells may cause an incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order. Ensure that the microplate spectrophotometer is in perfect working order. The use of a not calibrated spectrophotometer or not clean filters may cause a wrong reading samples with consequent incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order. Ensure that the dry heater (if necessary) is in perfect working order. The incubation temperature different from 37±2 C may cause a sensitivity losses and/or biological denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature. Ensure that the microplate shaker (if necessary) is in perfect working order. Incorrect agitation may cause wrong samples classifications. Ensure that the equipment used is in perfect working order. Ensure that all the equipment used for samples storage and/or the system is in perfect working order. The storage at different suggested temperature may cause biological material denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-hiv and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 15/24

Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. 6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum or plasma samples. Highly lipemic or hemolyzed samples must be discarded. Plasma samples may present fibrin filaments which could interfere with the assay; make sure that samples are always perfectly clear before testing. Keep samples properly stored at 2-8 C for 1-2 days; for longer periods it is advisable to freeze samples at -20 C. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided. Before use, dilute samples 1:300 with diluted Sample Diluent (see REAGENTS). Example: 10 µl sample + 2990 µl diluted Sample Diluent. 7. ASSAY PROCEDURE* Allow reagents and samples to warm up at room temperature. Mix samples by inversion before use. 7.1 Prepare duplicate wells for: Blank, Low Avidity Control, High Avidity Control and Samples. 7.2 Pipette 100 µl of the Low Avidity Control into wells C1 and D1; 100 µl of the High Avidity Control into wells E1 and F1; 100 µl of the first (diluted) sample into wells G1 and H1; proceed as such for all other samples. 7.3 Cover the microplate with the provided adhesive sheet and incubate the wells for 60±5 minutes at 37±2 C. 7.4 Aspirate the incubation mixture and wash the wells 4 times with 350 µl of diluted Washing Solution. Aspirate all liquid from the wells. 7.5 Pipette 100 µl of Sample Diluent into the odd wells (A1, C1, E1, G1, etc.) and 100 µl of Dissociating Reagent into the even wells (B1, D1, F1, H1, etc.). 7.6 Cover the microplate with the provided adhesive sheet and incubate the wells for 30±2 minutes at 37±2 C. 7.7 Aspirate and wash the wells as described in point 7.4. 7.8 Add 100 µl of Enzyme Conjugate into all wells. 7.9 Cover the microplate with the provided adhesive sheet and incubate the wells for 30±2 minutes at 37±2 C. 7.10 Aspirate and wash the wells as described in point 7.4. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 16/24

7.11 Pipette 100 µl of Chromogen into all wells. 7.12 Incubate the wells for 10 minutes at 37±2 C. 7.13 Pipette 100 µl of Blocking Reagent into all wells. 7.14 Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance values, read at 405 nm. Reading must be completed within 15 minutes from the end of the assay. * While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. 8. ASSAY SCHEME: see p.22 9. CALCULATION OF RESULTS * 9.a Substract the Blank value (mean O.D. of A1 and B1 wells) from all other wells. 9.b For each sample, make sure that the O.D. of the wells incubated with Sample Diluent is > 0.300. If so, you may proceed. If not, the sample does not have enough concentration to evaluate IgG avidity (patients negative to CMV infection or else infected patients with an antibody response which is still too weak). 9.c For each sample and control, calculate the percent ratio between the O.D. of the well treated with Dissociating Reagent and the O.D. of the well treated with Sample Diluent. This ratio will be the sample/control percent Avidity. O.D. with Dissoc. Reagent O.D. with Sample Diluent x 100 = % Avidity 9.d Samples with O.D. >3.000 at 450 nm in either well, must be read at 405nm. In such cases, the percent avidity must be calculated, based upon the reading at point 3. * While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 17/24

9.1 Example of Calculation Sample O.D. with O.D. with % Avidity Sample Dil. Dissoc. R. Low Av. C. 0.947 0.178 18.8 High Av. C. 1.244 0.972 78.1 Sample 0.565 0.080 14.1 9.2 Validation Criteria The O.D. at 450 nm of both Low and High Avidity Controls in the wells treated with Sample Diluent must be greater than 0.500. The percent Avidity (calculated as above) must be less than 35% for the Low Avidity Control and greater than 45% for the High Avidity Control. In any case, the results must be established by clinical evaluation and further diagnostic testing. 9.3 Interpretation of Results % avidity > 45% = IgG anti-cmv with high avidity % avidity 35-45% = IgG anti-cmv with mean avidity (grey zone) % avidity < 35% = IgG anti-cmv with low avidity 10. PERFORMANCES OF THE ASSAY 10.1 Diagnostic Specificity The diagnostic specificity of the method was evaluated on a group of 118 samples with past or secondary infection. The result was 97.4%. 10.2 Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity of the method was evaluated on a group of 33 samples with primary infection. The result was 93.9%. 10.3 Analytical Specificity Analytical specificity may be defined as the ability of the assay to accurately detect specific analyte in the presence of potentially interfering factors in the sample matrix. Controlled studies of potentially interfering substances showed that the assay performance was not affected by anticoagulants (EDTA and heparin). M169 Rev.8 02/2006 Pag. 18/24

10.5 Precision Precision was evaluated on a Radim instrument determining the repeatability and the reproducibility of the assay (intra- and inter-assay variability), on 3 sera at different % avidity. Repeatability (Intra-assay) Serum Mean ± S.D. C.V. Replicates (Avidity %) % no. a 11.5 ± 0.8 7.1 10 b 53.2 ± 3.6 6.7 10 c 82.9 ± 2.1 2.5 10 Reproducibility (Inter-assay) Serum Mean ± S.D. C.V. Assays (Avidity %) % no. d 11.15 ± 2.98 26.7 10 e 18.44 ± 2.26 12.3 10 f 76.39 ± 10.64 13.9 10 11. LIMITS OF THE ASSAY A result of high avidity does not exclude the possibility of a recent infection. On the other hand, given the high specificity of the test, a positive result strongly indicates an infection within the previous 3 months. 12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20 M169 Rev.8 02/2006 Pag. 19/24

SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 - EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití M169 Rev.8 02/2006 Pag. 20/24

96 RDATE Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda M169 Rev.8 02/2006 Pag. 21/24

8. SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME Prediluizione del campione, Sample predilution: 1:300 Pozzetti Wells A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 Reag. CTR BA ---- ---- 100 µl 100 µl ---- ---- ---- ---- CTR AA ---- ---- ---- ---- 100 µl 100 µl ---- ---- Campioni Sample ---- ---- ---- ---- ---- ---- 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 37±2 C, 60±5 min. Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µl DIL 100 µl ---- 100 µl ---- 100 µl ---- 100 µl ---- DISS ---- 100 µl ---- 100 µl ---- 100 µl ---- 100 µl Incubare, Incubate: 37±2 C, 30±2 min. Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µl CONJ 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 37±2 C, 30±2 min. Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µl TMB 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubare: 37±2 C, 10' STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leggere, Read: 450-405 nm M169 Rev.8 02/2006 Pag. 22/24

BIBLIOGRAFIA - REFERENCES 1 - Ahlfors K (1982). Epidemiological studies of congenital cytomegalovirus infection. Scand. J. Inf. Dis., suppl. 34. 2 - Stern H., Turker SM. (1973). Prospective study of cytomegalovirus infection in pregnancy. Br. Med. J. 2: 268-270. 3 - Doerr MW. (1987). Cytomegalovirus infection in pregnancy. J. Virol. Methods 17: 127-132. 4 - Stagno S., Pass RF., Cloud G., Britt WJ., Henderson RE., Walton PD., Veren DA., Page F., Alford CA. (1986). Primary cytomegalovirus infection in pregnancy. J. Am. Med. Ass. 256: 1904-1908. 5 - Pass RF., Griffiths PD., August AM (1983). Antibody response to cytomegalovirus after renal transplantation: Comparison of patients with primary and recurrent infections. J. Inf. Dis. 147: 40-46. 6 - Blackburn NK., Besselaar TG., Schoub BD., O'Connell KF. (1991). Differentiation of primary cytomegalovirus infection from reactivation using the urea denaturation test for measuring antibody avidity. J. Med. Virol. 33: 6-9. 7 - Lutz E., Ward KN., Gray JJ. (1994). Maturation of antibody avidity after primary human cytomegalovirus infection is delayed in immunosuppressed solid organ transplant patients. J. Med. Virol. 44: 317-322. M169 Rev.8 02/2006 Pag. 23/24

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