L assorbimento della luce
Una radiazione elettromagnetica consiste in 'pacchetti' di energia (fotoni) la cui energia dipende dalla frequenza. E = h n E, energia del quanto di luce (cal o Joules, 1 cal= 4,17 J). h,costante di Planck (6.6 x 10-34 Joules x sec) n, la frequenza, il numero di oscillazioni al secondo (Hertz). frequenza = velocità della luce (nel vuoto, 3 x 10 8 m/sec) / lunghezza d onda la lunghezza d'onda (l) è la distanza tra due massimi consecutivi (m,cm, nm) ENERGIA E FREQUENZA SONO DIRETTAMENTE PROPORZIONALI TRA DI LORO ED ENTRAMBE SONO INVERSAMENTE PROPORZIONALI ALLA LUNGHEZZA D'ONDA
Le radiazioni elettromagnetiche vanno dai raggi g (a minori lunghezze d onda ed alta energia/frequenza) alle onde radio (a maggiori lunghezze d onda e bassa energia/frequenza).
Gli elettroni di legame di tipo p (presenti nei legami doppi o tripli, negli anelli aromatici) sono costituiti da coppie di elettroni la cui maggiore densità è situata al di fuori dell asse di unione dei nuclei; questi elettroni sono meno legati e più facilmente eccitabili rispetto a quelli di tipo s presenti nei legami semplici. Questi elettroni possono raggiungere il livello energetico superiore quando ricevono una radiazione con frequenza tale che l'energia dei fotoni sia uguale alla differenza energetica tra lo stato fondamentale e lo stato eccitato. Le molecole in grado di assorbire la luce passando da stati ad energia minore a stati ad energia maggiore si chiamano cromòfori.
L assorbimento della luce nelle regioni dell ultravioletto (UV, 100-400 nm) e del visibile (VIS, 400-800 nm) è sfruttato in biochimica per analisi qualitative e quantitative. Ultravioletto: UV A (400-315 nm); UV B (315-280 nm); UV C (280-100 nm). Il sole emette ultravioletti in tutte le regioni ma il 99% degli UV che arrivano sulla terra sono UV A con molti effetti negativi sulla salute umana.
Una semplice considerazione che riguarda i cromofori nel VIS ci consente di capire il fenomeno dell assorbimento. La luce bianca è il risultato della mescolanza di 7 colori. Quando la luce bianca passa attraverso un cromòforo, una parte della miscela di lunghezza d'onda viene assorbita; la luce non assorbita assumerà allora il colore complementare alla lunghezza d'onda assorbita. Questa correlazione è descritta dalla ruota dove i colori complementari sono diametralmente opposti l'un l'altro. L'assorbimento della luce di 420-430 nm rende una sostanza gialla; un assorbimento a 500-520 nm la rende rossa. Il verde ha un comportamento insolito, in quanto può essere creato da un assorbimento a 400 nm ed a 800 nm. Il nostro occhio funziona come uno spettrofotometro che rivela la radiazione trasmessa dal cromoforo (il colore) che ha assorbito una parte della luce solare (composta da radiazioni nel VIS, nell UV e nell infrarosso)
Dopo l assorbimento dell energia, il decadimento spontaneo al livello inferiore impiega 10-15 sec. Alcuni cromofori possono emettere FLUORESCENZA: in questo caso, l energia passa agli atomi vicini attraverso urti (impiegando 10-8 sec) e il sistema emette luce a lunghezza d onda maggiore (energia minore) di quella che ha causato l eccitazione. Se la molecola fluoresce nel VIS, noi apprezziamo l evento ad occhio nudo; ad esempio, il bromuro di etidio è illuminato a 300 nm ed emette fluorescenza arancione.
Lo spettrofotometro è lo strumento che consente la misura dell assorbimento di cromofori in soluzione. I 0 I t La sorgente può essere una lampada a tungsteno (VIS) o una lampada ad idrogeno o deuterio (UV) Il monocromatore consente di ottenere un fascio di luce ad 1 lunghezza d onda partendo da una sorgente di radiazioni policromatica Il rivelatore produce un segnale elettrico che dipende dall energia delle radiazioni che lo investono La cella contenente il campione si chiama cuvetta. Le cuvette possono differire per natura del materiale (vetro/plastica per lettura nel VIS, quarzo per lettura nell UV) e cammino ottico (la distanza tra il raggio entrante e quello uscente), ma hanno sempre 2 facce opposte che non possono essere attraversate dalla luce (attenzione al loro posizionamento nello spettrofotometro!) I 0 (Intensità luce incidente) e I t (Intensità luce trasmessa) I t = I 0 non c è assorbimento I t < I 0 se c è assorbimento
ANALISI QUALITATIVA Se si registra in continuo l assorbanza (Densità Ottiche, OD) in funzione della variazione della lunghezza d onda (nm) si ottiene uno SPETTRO DI ASSORBIMENTO nel quale è possibile identificare una lunghezza d onda di massimo assorbimento caratteristica del cromoforo in esame. Le proteine e i peptidi sono cromofori nell UV soprattutto per il contributo del legame peptidico (intorno ai 200 nm) e degli AA aromatici (tra 260-280 nm). Alcune proteine assorbono anche nel VIS in virtù della presenza di gruppi non proteici ad esse associati: le emo-proteine assorbono a 420-540 nm; le proteine che contengono FAD/FMN assorbono a 420 nm. Per la presenza delle basi azotate, gli acidi nucleici presentano un massimo di assorbimento intorno a 260 nm. L assorbimento è maggiore per le catene singole in cui le basi sono maggiormente esposte.
ANALISI QUANTITATIVA A = e c l (Legge di Lambert-Beer) C, concentrazione del cromoforo, moli/litro (M) l, cammino ottico, di solito 1 cm e, coefficiente di estinzione caratteristico del cromoforo; coincide con l A quando C = 1 M e l =1 cm. La legge di Lambert-Beer è l equazione di una retta passante per l origine degli assi, in cui il prodotto e x l è il coefficiente angolare. Entro un certo intervallo, esiste una proporzionalità diretta tra concentrazione del cromoforo ed il suo assorbimento della luce. La legge di Lambert-Beer consente il calcolo della concentrazione di un cromoforo puro in soluzione e di cui è noto e con una semplice lettura di assorbimento della luce.
Radionuclìdi, radioattività
La scoperta della radioattività avvenne alla fine dell 800 grazie ad Henry Bequerel ed ai coniugi Pierre e Marie Curie; per queste ricerche, i 3 studiosi insieme ricevettero il Premio Nobel per la Fisica nel 1903. Gli studiosi scoprirono che alcuni minerali avevano la proprietà di impressionare delle lastre fotografiche poste nelle loro vicinanze. Le lastre fotografiche, una volta sviluppate, presentavano delle macchie scure. Per questa loro proprietà, elementi come l uranio, il radio e il polonio vennero denominati attivi e il fenomeno venne detto radioattività.
Ogni atomo è formato da un nucleo (contenente protoni e neutroni) ed elettroni (in numero equivalente a quello dei protoni) che orbitano intorno al nucleo. Mentre il numero di protoni di un elemento chimico è fisso (Z, caratterizza l elemento), il numero di neutroni può essere variabile ( isotopi di un elemento chimico). Gli isotopi sono identificati dal nome dell'elemento e dal numero di massa che viene riportato in alto a sinistra del simbolo dell elemento chimico. La maggior parte degli isotopi presenti in natura sono stabili. Il deuterio, 2 H, è l isotopo stabile dell idrogeno. La radioattività è il processo attraverso cui isotopi instabili si trasformano in isotopi di energia inferiore e maggiore stabilità mediante emissione di radiazioni o particelle ionizzanti. Un parametro molto usato per descrivere un decadimento radioattivo è dato dal tempo di decadimento (grafico esponenziale) che ci dice dopo quanto tempo saranno decaduti un numero di atomi pari alla metà del totale.
La radioattività non è stata inventata dall'uomo, anzi, l'uomo è esposto alla radioattività fin dal momento della sua apparizione sulla Terra. La radioattività è un fenomeno naturale: per questo motivo, qualsiasi cosa sulla Terra, inclusi i nostri corpi, contiene una certa percentuale di elementi radioattivi. La radioattività naturale è dovuta soprattutto alla presenza del Radon 222 prodotto dal decadimento dell uranio 238 che si trova soprattutto nelle rocce. Essendo gassoso, il radon riesce ad evaporare diffondendosi nell aria. Oltre ai radioisotopi naturali, esistono oggi un gran numero di radioisotopi artificiali, cioè prodotti dall'uomo. Esempi ne sono il cobalto-60 (27 protoni, 33 neutroni, usato in radioterapia) ed il plutonio-239 (94 protoni, 145 neutroni, usato come combustibile nelle centrali nucleari). Un altro protagonista della radioattività naturale è il 40 K (tempo di decadimento 1,3 miliardi di anni) che è presente nel nostro corpo, nei cibi, nella crosta terrestre e nell acqua di mare.
Esistono 3 principali forme di decadimento radioattivo, ognuna con proprietà e pericolosità diverse. Decadimento Alfa: il nucleo emette due protoni e due neutroni (un nucleo di elio) e si trasforma in un nucleo diverso, con numero atomico (Z - 2) e numero di massa (A 4). Un esempio è il decadimento dell uranio-238 in torio-234. Le radiazioni alfa sono poco penetranti e possono essere completamente bloccate da un semplice foglio di carta. Decadimento Beta: Il nucleo emette un elettrone e si trasforma in un nucleo con numero atomico (Z + 1) ma stesso numero di massa A. Un esempio è il decadimento del Cobalto-60 in Nichel-60. Le radiazioni beta sono più penetranti di quelle alfa, ma possono essere completamente bloccate da piccoli spessori di materiali metallici (ad esempio, pochi millimetri di alluminio). Decadimento Gamma: Il nucleo non si trasforma ma passa semplicemente in uno stato di energia inferiore ed emette un fotone. La radiazione gamma accompagna solitamente una radiazione alfa o una radiazione beta. Infatti, dopo l'emissione alfa o beta, il nucleo è ancora eccitato perché i suoi protoni e neutroni non hanno ancora raggiunto la nuova situazione di equilibrio: di conseguenza, il nucleo si libera rapidamente del surplus di energia attraverso l'emissione di una radiazione gamma. Per esempio il cobalto-60 si trasforma per decadimento beta in nichel-60, che raggiunge il suo stato di equilibrio emettendo una radiazione gamma. Al contrario delle radiazioni alfa e beta, le radiazioni gamma sono molto penetranti e per bloccarle occorrono materiali ad elevata densità come il piombo.
L'unità di misura della radioattività è il becquerel (Bq). 1 Bq corrisponde a 1 disintegrazione al secondo. Per la misura delle dosi di radiazioni assorbite dall'uomo (per una misura degli effetti biologici dovuti alla dose di radiazioni assorbita) è stato introdotto il concetto di equivalente di dose, che tiene conto della dannosità più o meno grande, a parità di dose, dei vari tipi di radiazioni ionizzanti. L'unità di misura è il Sievert (Sv). Di uso più comune è il sottomultiplo millisievert (msv). La dose annualmente assorbita da ogni individuo per effetto della radioattività naturale è in media di 2,4 msv per anno. Il limite massimo di dose stabilito dalla legge italiana per le persone è 1 msv/anno al di sopra della dose naturale di radiazioni. Radiografia del torace 0,14 msv Radiografia dell'addome 1,1 msv Radiografia del tubo digerente 4,1 7,2 msv Urografia 3,1 msv Mammografia 1,0 msv
L'effetto biologico deleterio della radioattività è dovuto alla produzione di radicali liberi che alterano gli acidi nucleici e molte biomolecole causando danni somatici e genetici; tale effetto è prodotto principalmente dalle radiazioni gamma più energiche e penetranti delle particelle alfa e beta. Il momento in cui le cellule sono più vulnerabili in rapporto alle radiazioni è quello della riproduzione in cui il DNA è in fase di duplicazione, le strutture del nucleo sono dissolte e gli enzimi che assicurano l'integrità del materiale genetico non possono operare. L'effetto macroscopico più vistoso della radioattività sulle cellule, quindi, è il rallentamento della velocità di riproduzione: le popolazioni di cellule che si riproducono molto rapidamente sono più vulnerabili di quelle che lo fanno lentamente. In virtù di questo fatto, gli organi più sensibili alle radiazioni sono il midollo osseo emopoietico e il sistema linfatico. A livello dell'intero organismo, sia nell'uomo che negli animali superiori, si nota un precoce invecchiamento dell'organismo correlato alla dose totale di radiazione assorbita, sia con forti dosi istantanee che con l'esposizione prolungata a bassi livelli di radioattività.
Tutti i metodi di rivelazione si basano sulla misura di una grandezza provocata dall interazione della radiazione con il rivelatore. Generalmente questa grandezza è una carica o una corrente elettrica, ma può essere anche calore, luce, un effetto chimico, l opacizzazione di una sostanza trasparente, la trasformazione in una radiazione diversa.