BIOCHIMICA APPLICATA e CLINICA Regolazione Enzimatica Biosegnalazione Regolazione Ormonale Specializzazioni metaboliche (Biochimica d Organo) Integrazione del metabolismo
BIOCHIMICA APPLICATA e CLINICA Password Moodle: BACfarma Regolazione enzimatica, Biosegnalazione, Regolazione delle vie metaboliche, Integrazione metabolica Nelson DL e Cox MM - I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, (V edizione) Zanichelli 2010 Cap. 6, 12, 14, 15, 16,17, 19, 21, 23 Ormoni Levy MN, Koeppen, BM, Stanton, BA PRINCIPI DI FISIOLOGIA di Berne & Levy, (IV edizione) Elsevier Masson 2007 Capitoli 41-48 in alternativa Carbone E, Cicirata F e Aicardi G FISIOLOGIA dalle molecole ai sistemi integrati (I edizione) EdiSES 2008 Capitoli 20-25, 28 Biochimica d organo Caldarera CM BIOCHIMICA SISTEMATICA UMANA, (II edizione), CLUEB Economica, 2007 (.pdf allegato)
REGOLAZIONE ENZIMATICA Cap. 6, 15 Lehninger L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO Legge di Michaelis-Menten CONTROLLO GENICO Viene regolata la quantità dell enzima CONTROLLO ALLOSTERICO INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE (Partners) MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI Fosforilazione MODIFICAZIONI COVALENTI IRREVERSIBILI taglio proteolitico della catena enzimatica
Cinetica secondo Michaelis e Menten Il valore di K M è una misura di quanto strettamente il substrato sia legato all enzima (affinità) Tanto maggiore sarà il valore di K M tanto più debole sarà l interazione tra substrato ed enzima
CONFRONTO TRA K M È la prima reazione di modificazione del glucosio una volta trasportato all interno della cellula: TAPPA FONDAMENTALE PER ogni suo impiego (in senso catabolico o anabolico) Fosforilazione del glucosio a glucosio-6-fosfato La fosforilazione del glucosio è catalizzata da una famiglia di enzimi diversi: ESOCHINASI (I, II, e III) e GLUCOCHINASI (Esochinasi IV) ESOCHINASI e GLUCOCHINASI hanno una diversa K M K M ESOCHINASI (I,II,III) = 20-150 µm (0.02-0.15 mm) K M GLUCOCHINASI = 10 mm Il legame del glucosio alla glucochinasi è da 66 a 500 volte più debole di quello all esochinasi
V Vmax K M ESOCHINASI = 150 µm (0.15 mm) ½ Vmax A [glucosio] > 0.7 mm l enzima è saturo: concentrazioni ancora maggiori non alterano la velocità. 0 0.15 0.5 1.0 1.5 [glucosio] mm Con questo intervallo di [glucosio] come sarà la curva per la glucochinasi (K M = 10 mm)? Per ottenere la curva della glucochinasi bisogna usare concentrazioni di glucosio maggiori V Vmax K M GLUCOCHINASI = 10 mm ½ Vmax Per saturare l enzima bisogna arrivare a 30mM glucosio 0.15 0 10 20 30 [glucosio] mm Con questo intervallo di [glucosio] come sarà la curva per l esochinasi?
Che senso ha avere enzimi che catalizzano la stessa reazione, ma con K M così diverse? K M ESOCHINASI (I, II, III) = 20 150 μm K M GLUCOCHINASI (ESOCHINASI IV) = 10 mm È espressa in tutti i tessuti È espressa solo nel FEGATO e nelle cellule β del pancreas La concentrazione di glucosio nel sangue (glicemia) varia da 4mM a digiuno a circa 10 mm dopo un pasto (nel circolo entero-epatico) V Vmax ½ Vmax 0.15 0 10 20 30 [glucosio] mm
V Vmax ½ Vmax 0.15 0 10 20 30 [glucosio] mm K M ESOCHINASI =0.02-0.15 mm È espressa in tutti i tessuti A digiuno l enzima lavora alla sua Vmax (saturo): aumenti di glucosio non alterano la velocità della reazione. I tessuti vengono EGUALMENTE riforniti di G6P INDIPENDENTEMENTE dallo stato nutrizionale K M GLUCOCHINASI = 10 mm È espressa solo nel FEGATO Dopo un pasto, l aumento della [glucosio] fa aumentare la velocità della reazione catalizzata dalla glucochinasi nel FEGATO, (ma NON negli altri tessuti) aumenta la fosforilazione del glucosio.
REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+/-) Viene regolata la quantità dell enzima
REGOLAZIONE ENZIMATICA CONTROLLO GENICO (+/-) Viene regolata l ESPRESSIONE (quantità) dell enzima a livello di trascrizione e traduzione del gene Tempo: decine di min - ore E REVERSIBILE interruttore trascrizionale: Attivazione (o inattivazione) di Fattori di Trascrizione su specifici Promotori Vmax è funzione della quantità di enzima presente K cat è chiamata numero di turnover: pari al numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell unità di tempo (sec) per ciascuna molecola di enzima. Dimensioni = sec -1
V Vmax 20 E Glucosio 6-P µmol/min Vmax E K M GLUCOCHINASI = 10 mm l insulina ne stimola la trascrizione di circa 20 volte in 30 min. 0 10 20 30 40 50 [glucosio] mm
REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+) Viene regolata la quantità dell enzima CONTROLLO ALLOSTERICO (+/-) deriva da una molecola che si lega ad un sito diverso dal sito di legame
Regolazione allosterica. Gli enzimi allosterici hanno siti di legame per gli attivatori o inibitori (EFFETTORI o MODULATORI) diversi dal sito attivo del substrato enzima allosterico è in generale una proteina oligomerica che può esistere in due conformazioni (T e R) caratterizzate da bassa (T) o elevata (R) attività catalitica Enzima inattivo T effettore + effettore - Enzima attivo R Il legame con l effettore ha la conseguenza di stabilizzare una delle due conformazioni
Effettori allosterici sono soprattutto METABOLITI INTRACELLULARI Tra i principali modulatori allosterici ci sono gli indicatori dello stato energetico ATP/ADP/AMP NAD/NADH Citrato & acetil CoA E la CONCENTRAZIONE dei modulatori allosterici a determinare l effetto La costante di dissociazione definisce l affinità di un modulatore allosterico per il suo sito di legame sull enzima, ed ha le dimensioni di una concentrazione E + M [E] [M] [EM] EM = K d
REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+/-) CONTROLLO ALLOSTERICO (+/-) da metaboliti Per INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE (Partners; +/-)
STIMOLAZIONE O INIBIZIONE DA PARTE DI PROTEINE DI CONTROLLO INTERAZIONE PROTEINA-PROTEINA Partner attivatore Enzima inattivo Transizione conformazionale Attivazione di altre copie dell enzima substrati Enzima attivo prodotti
REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+/-) l enzima è prodotto solo quando serve. Viene regolata la quantità dell enzima CONTROLLO ALLOSTERICO (+/-) da metaboliti Per INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE (Partners; +/-) MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI (+/-) Fosforilazione
Lo stato di fosforilazione di molti enzimi ne regola DIRETTAMENTE l attività
Protein chinasi I substrati sono proteine Chinasi: fosforilazione Protein fosfatasi H 2 O Per poter avere un significato biologico la fosforilazione deve poter essere REVERSIBILE DEFOSFORILAZIONE: idrolisi del legame fosfo-estere
REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO Tutti CONTROLLO GENICO CONTROLLO ALLOSTERICO metaboliti o partners proteici MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI Fosforilazione ENZIMI REGOLATORI Catalizzano la reazione più lenta di una via metabolica e quindi controllano la velocità complessiva della via stessa. In generale sono enzimi allosterici e vengono controllati anche mediante fosforilazione e controllo genico (non tutti) COORDINAMENTO dell ATTIVITA METABOLICA