Il metabolismo cellulare

Il metabolismo cellulare 1 Il metabolismo cellulare CATABOLISMO Processo esoergonico (per produrre energia) Nutriliti NAD FAD NADP e - +H + ANABOLISMO Processo endoergonico Biopolimeri (x es. proteine) ossidazione (sottrazione di e - come H) CALORE ATP energia ADP Intermedi di sintesi Intermedi di biosintesi (x es. aminoacidi) Pool di precursori intracellulari riduzione (trasferimento di e - come H) Prodotti finali Nutrienti dall esterno (CO 2, H 2 O, molecole organiche più ossidate di quelle di partenza) 2

RUOLO DELL ATP NEL METABOLISMO È un derivato dell AMP (adenosin monofosfato) al quale sono legati altri 2 gruppi fosforici per mezzo di legami anidride ( ADP + Pi + energia = ATP ) fosfato inorganico I legami anidride sono legami ricchi di energia e quindi sono particolarmente reattivi - L ATP è in grado di cedere gruppi fosforici a numerosi intermedi metabolici, convertendoli nella forma attivata con livelli di energia libera tali da consentire a questi intermedi fosforilati di partecipare alle reazioni biosintetiche, che sono termodinamicamente favorevoli ( G <0) - Una analoga reazione con un reagente in forma non fosforilata sarebbe termodinamicamente sfavorevole ( G >0) La generazione di ATP è quindi necessaria per il funzionamento dei processi biosintetici 3 Come ottengono ATP i microrganismi? RESPIRAZIONE: sintesi di ATP attraverso il sistema enzimatico della Fo-F1 ATP sintasi (o Fo-F1 ATPasi), al termine della catena di trasporto degli elettroni Lettera O, non numero zero! FOTOFOSFORILAZIONE: sintesi di ATP attraverso l impiego di energia luminosa per creare una separazione di cariche FOSFORILAZIONE A LIVELLO DI SUBSTRATO: consiste nel diretto trasferimento di un fosfato ad alto contenuto energetico da un composto fosforilato ad ADP per formare ATP 4

REAZIONI di OSSIDO-RIDUZIONE - donatore di e - (agente riducente che si ossida!) - accettore di e - (agente ossidante che si riduce!) il valore del potenziale di RIDUZIONE è un indice di quanto la molecola in oggetto sia un buon donatore o un buon accettore di e - 2H + /H 2 O 2 /H 2 O - 0.42 V (infatti H 2 è un ottimo donatore di elettroni) + 0.82 V (infatti O 2 è un ottimo accettore di elettroni) per OGNI composto che si OSSIDA in una semireazione DEVE esserci un composto che si RIDUCE in un altra semireazione ad essa accoppiata H 2 2H + + 2 e - (semireazione 1) ½ O 2 + 2H + + 2 e - H 2 O (semireazione 1) REAZIONE NETTA H 2 + ½ O 2 H 2 O 5 REAZIONI di OSSIDO-RIDUZIONE - donatore di e - (agente riducente che si ossida!) - accettore di e - (agente ossidante che si riduce!) il valore del potenziale di RIDUZIONE è un indice di quanto la molecola in oggetto sia un buon donatore o un buon accettore di e - 2H + /H 2 O 2 /H 2 O - 0.42 V (infatti H 2 è un ottimo donatore di elettroni) + 0.82 V (infatti O 2 è un ottimo accettore di elettroni) per OGNI composto che si OSSIDA in una semireazione DEVE esserci un composto che si RIDUCE in un altra semireazione ad essa accoppiata H 2 2H + + 2 e - (semireazione 1) ½ O 2 + 2H + + 2 e - H 2 O (semireazione 1) REAZIONE NETTA H 2 + ½ O 2 H 2 O 6

Nei sistemi biologici le reazioni di ossido-riduzione UTILI ai fini energetici avvengono quando l e - e il protone (H + ) che lo segue sono rimossi da un substrato (per azione di un enzima) per essere trasferiti ad un TRASPORTATORE che agirà come intermedio di trasporto tra un donatore e un accettore associati ai protoni!!! Gli e - non esistono allo stato libero nei sistemi biologici MA SI SPOSTANO DA DONATORI AD ACCETTORI ATTRAVERSO LA MEDIAZIONE DI TRASPORTATORI FISSI LIBERI NAD + reazioni CATABOLICHE NADP + reazioni ANABOLICHE Associati alla membrana cofattori di enzimi responsabili delle deidrogenazioni per esempio lattato deidrogenasi Lattato + NAD + riduzione del NAD ossidazione del NAD + H + + Piruvato 7 NICOTINAMIDE ADENIN DINUCLEOTIDE FORMA OSSIDATA (NAD + ) NICOTINAMIDE ADENIN DINUCLEOTIDE FORMA RIDOTTA ( + H + ) NICOTINAMIDE ADENINA NICOTINAMIDE ADENINA RIBOSIO 2 FOSFATI RIBOSIO RIBOSIO 2 FOSFATI RIBOSIO Quando il NAD in forma ossidata (NAD + ) acquista 2 elettroni, cioè si riduce, acquista anche un H + e un H + viene rilasciato nel citoplasma per questo il NAD in forma ridotta deve essere indicato come + H + 8

Che bisogno c è, da un punto di vista metabolico, di due piridinnucleotidi (NAD e NADP) così simili a livello funzionale? RISPOSTA: i piridinnucleotidi ossidati entrano come reagenti nei processi catabolici, mentre quelli in forma ridotta partecipano ai processi biosintetici Ciò significa che: - i piridinnucleotidi si devono trovare per lo più in forma ossidata perché i processi catabolici possano funzionare - per le reazioni biosintetiche si devono trovare in gran parte in forma ridotta SONO QUINDI NECESSARI DUE TIPI DI PIRIDIN-NUCLEOTIDI Il NAD è mantenuto largamente nello stato ossidato interviene quindi nelle reazioni cataboliche (è importante ricordarlo per quando parleremo della fermentazione) Il NADP è mantenuto largamente nello stato ridotto interviene quindi nelle reazioni anaboliche 9 I meccanismi di produzione di energia A - RESPIRAZIONE Completa demolizione (=ossidazione) del substrato (fonte di energia) in CO 2 Permette il massimo recupero di energia dal substrato ridotto Respirazione AEROBIA: l accettore finale di elettroni è l O 2 Respirazione ANAEROBIA: l accettore finale di elettroni è un composto inorganico diverso dall O 2 come per esempio NO 2-, CO 3 --, SO 4 -- B - FERMENTAZIONE Non comporta la completa demolizione (=ossidazione) del substrato (fonte si energia) Non prevede il coinvolgimento dell O 2 È veloce ma energeticamente meno efficiente: minore ATP prodotto rispetto alla respirazione L accettore finale di elettroni è una molecola organica (per es. l acetaldeide: CH 3 -COH) C - FOTOSINTESI Ora ci occuperemo più nel dettaglio del metabolismo energetico di specifici batteri CHEMIO-ORGANOETEROTROFI che respirano o fermentano D - LITOTROFIA: una molecola INORGANICA è la fonte di energia (di elettroni) Per es. METANOGENESI: un antico tipo di metabolismo di alcuni archeobatteri che utilizza H 2 come fonte di energia e produce METANO 10

Il metabolismo energetico (catabolismo) degli eterotrofi Il destino del glucosio in una cellula batterica GLUCOSIO glicolisi (via di Embden-Meyerhof-Parnas) 1 pathway dei pentoso-fosfati 2 pathway di Entner-Doudoroff 3 via della fruttosio-6- fosfato fosfochetolasi (F6PPK) 4 PIRUVATO respirazione aerobica A respirazione anaerobica B fermentazione lattica, alcolica acido mista, eterolattica metabolismo dei bifidobatteri Le tre vie attraverso cui i batteri ottengono energia dalla degradazione di composti organici 11 1 2 Glicolisi e Via dei pentoso-fosfati 12

2 Via dei pentoso-fosfati (o degli esoso-monofosfati) La prima parte della via, definita fase ossidativa, vede una serie di reazioni che ossidano il glucosio-6- fosfato a ribosio-5-fosfato, uno zucchero basilare per la sintesi dei nucleotidi. Nella seconda fase, definita non ossidativa, avviene l'epimerizzazione e l'isomerizzazione del ribosio-5-fosfato che produce, alla fine, fruttosio-6-fosfato e gliceraldeide-3-fosfato. Il fruttosio-6-fosfato è facilmente interconvertito in glucosio-6-fosfato attraverso l'enzima fosfofruttosio isomerasi e il ciclo può continuare FASE OSSIDATIVA ribosio-5-p glucosio-6-p 6-P-gluconato- -δ-lattone 6-P-gluconato ribulosio-5-p xilulosio-5-p FASE NON OSSIDATIVA xilulosio-5-p ribosio-5-p gliceraldeide-3p eritrosio-4-p sedoeptulosio-7-p xilulosio-5-p fruttosio-6-p gliceraldeide-3p La via dei pentoso fosfati ha due scopi. Nella parte ossidativa serve a sintetizzare il ribosio-5- fosfato, precursore dei nucleotidi, mentre nella parte non ossidativa avvengono delle trasformazioni che rimettono in ciclo il fruttosio-6-fosfato, convertito facilmente in glucosio-6- fosfato. Questa seconda parte avviene perlopiù quando la cellula ha più necessità di potere riducente sotto forma di NADPH rispetto alla presenza di zuccheri o ribosio-6-fosfato 13 glucosio 3 Via di Entner/Doudoroff glucosio-6-p esochinasi glucosio-6-p deidrogenasi Via alternativa alla glicolisi tipica dei batteri. Tipica di alcune specie appartenenti al genere Pseudomonas e altri Proteobatteri che sono privi dell enzima FOSFOFRUTTOCHINASI si veda cosa fa! È una via tipica anche di Zymomonas (yeast like bacterium), che produce ETANOLO a partire dall acido piruvico batteri Gram-negativi della classe dei gamma-proteobatteri (divisione Proteobatteri) etanolo 6-P-gluconato-δ-lattone gliceraldeide- 3-fosfato NAD + +H + acetaldeide lattonasi piruvato 6-fosfogluconato deidratasi 2-cheto-3-deossi-6-fosfo gluconato chetodeossifosfogluconato aldolasi piruvato 14

DISTRIBUZIONE DELLE DIVERSE VIE DI UTILIZZAZIONE DEGLI ZUCCHERI TRA ALCUNI BATTERI Microrganismo Embden- Meyerhof Entner- Doudoroff Arthrobacter spp. + - glicolisi Azotobacter chroococcum + - Alcaligenes eutrophus - + Bacillus spp. + - Escherichia coli e altri batteri + - enterici Pseudomonas spp. - + Rhizobium spp. - + Thiobacillus spp. - + Xanthomonas spp. - + - La via di Entner-Doudoroff è di grandissima utilità per quei microrganismi che impiegano il gluconato o il mannonato come substrato - Alcuni microrganismi come Escherichia coli impiegano la glicolisi per il metabolismo del glucosio, ma quando il gluconato viene fornito come substrato, allora vengono indotti gli enzimi chiave della Entner-Doudoroff - A prescindere dal fatto che metabolizzi il glucosio attraverso la via Embden-Meyerhof o la via Entner-Doudoroff, un batterio possiede tutti o molti degli enzimi della via dei pentosofosfati (shunt dell esoso monofosfato). Questa apparente ridondanza metabolica può trovare una spiegazione nelle funzioni vitali della via dei pentosofosfati, relative alla generazione di NADPH e di altri due precursori metabolici, il ribosio-5-fosfato e l eritrosio-4-fosfato (quindi per anabolismo) 15 glucosio A La respirazione piruvato Ciclo di Krebs ATP sintasi (F o F 1 ATPasi) 16

A La respirazione La respirazione (aerobica) è un processo di ossido-riduzione Con la RESPIRAZIONE si genera un gradiente di ph e un potenziale elettrochimico che causano l energizzazione della membrana (in modo «simile ad una batteria») e parte di questa energia può essere conservata dalla cellula Così come lo stato di energia di una batteria è espresso in termini di forza elettromotrice (in volt), così lo stato energizzato della membrana viene espresso in termini di forza proton-motrice (pure in volt) Peter Mitchell nel 1961 propose la teoria della chemiosmosi, secondo la quale la forza per indurre la sintesi di ATP risiede nel gradiente protonico 17 OUT ATP SINTASI A RESPIRAZIONE: catena di trasporto degli elettroni Al posto dell ossigeno si possono IN avere altri accettori finali di e - : SO 4 2-, Fe 3+, Mn 4+, NO 3-, CO 2, S... Flavoproteina e - e - Ferro-proteina NON EME e - Coenzima Q http://www.youtube.com/w atch?v=oyr-cmu6dfq http://www.youtube.com/wat ch?v=pjdpty1whdq O 2 e - Citocromo (EME) e - http://www.youtube.com/wat ch?v=3y1do4nnaky 18

sostanza organica La fermentazione B È un processo metabolico anaerobico in cui il donatore e l accettore di elettroni (e - ) sono molecole organiche. Più precisamente, nel corso della fermentazione, un composto organico funge da donatore di e -, ossidandosi e generando nel contempo (cioè NAD in forma ridotta). Il piridindinucleotide ridotto () non può scaricare i suoi e- sulla catena di trasporto; perciò, per rigenerare il pool di NAD + necessario alla LA cellula FERMENTAZIONE per il proseguimento COME PROCESSO del processo, avviene la riossidazione del a spese di un composto intermedio del processo, che OSSIDO-RIDUTTIVO BILANCIATO AL SUO INTERNO funge da accettore di e-. La FERMENTAZIONE è quindi un processo ossidoriduttivo bilanciato al suo interno prodotto finale NAD + ATP La fermentazione è un processo metabolico anaerobico tipico di microrganismi anaerobi obbligati (es. Bifidobacterium spp.). Inoltre, molti anaerobi facoltativi (es. Escherichia coli), per la loro flessibilità metabolica, possono attuare la respirazione in aerobiosi e la fermentazione in assenza di O 2 19 B La fermentazione Nella fermentazione non si ha la completa demolizione del composto di partenza, che viene solo parzialmente fermentato in uno o più prodotti finali per lo più ancora organici, che mantengono ancora parte dell energia del composto iniziale. Pertanto la resa energetica della fermentazione non è paragonabile a quella dei processi respiratori e l ATP viene generato soltanto per trasferimento di un gruppo fosfato legato ad un intermedio del processo con un legame ad alto contenuto energetico all ADP (fosforilazione a livello di substrato) Rese teoriche in ATP per molecola di glucosio RESPIRAZIONE: 36-38 molecole teoriche di ATP (2 da glicolisi, 2 dal ciclo di Krebs (GTP) e 32-34 dalla catena di trasporto degli elettroni) FERMENTAZIONE ALCOLICA e LATTICA: 2 ATP FERMENTAZIONE dei BIFIDOBATTERI: 2,5 ATP Il metabolismo respiratorio è circa 15 volte più efficiente del metabolismo fermentativo Il metabolismo fermentativo, però, è molto rapido! 20

B La fermentazione La glicolisi è la principale via che precede numerose fermentazioni. Per la maggior parte dei processi fermentativi la stessa glicolisi è anche la via che frutta alle cellule l energia, scopo del processo metabolico (2 moli di ATP per mole di glucosio fermentato) attraverso le già citate reazioni di fosforilazione a livello di substrato. Le tappe successive della fermentazione hanno invece lo scopo di consentire la riossidazione delle due moli di, prodotte nell ossidazione della 3-fosfo gliceraldeide ad acido 1,3-difosfoglicerico, in quanto nei microrganismi anaerobi la catena di trasporto degli elettroni è incompleta. Pertanto l equilibrio ossido-riduttivo si ristabilisce mediante riossidazione del a spese di un intermedio del processo a valle dell acido piruvico. In qualche caso, in questo tratto della fermentazione si ha ulteriore produzione di ATP, che porta la resa energetica della fermentazione a valori comunque di ben poco superiori a 2 Quasi sempre le varie vie fermentative sono caratteristiche di ben definiti gruppi microbici, i quali dimostrano un elevata specificità di processo 21 B1 La fermentazione alcolica È caratteristicafermentazione dei lieviti, che sono ALCOOLICA eumiceti unicellulari anaerobi facoltativi di cui è ben noto il genere Saccharomyces. L enzima-chiave di questa fermentazione è la piruvato decarbossilasi glucosio 2ATP 2 etanolo 2 gliceraldeide-3- P + NAD 2 CO2 2 acetaldeide NAD + 2 piruvato Equazione generale: 4ATP glucosio 2 etanolo + 2 CO2 Avviene anche nel già citato batterio Zymomonas Resa energetica = 2 ATP 22

B2 La fermentazione omolattica È operata dai batteri omolattici od omofermentanti, anaerobi obbligati ossigeno-tolleranti appartenenti ai generi Gram positivi Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus In questa fermentazione è lo stesso acido piruvico di origine glicolitica a fungere da accettore di elettroni per la riossidazione del, riducendosi così ad acido lattico lattato deidrogenasi 23 succinato acetaldeide etanolo B3 La fermentazione acido-mista FERMENTAZIONE ACIDO-MISTA ossaloacetato acetil-coa acetil- P acetato glucosio 2 2ATP CO2 fosfoenolpiruvato ATP piruvato 2ATP CoA CO2 (PEP) formiato H2 formico idrogenoliasi lattato Gli enterobatteri come Escherichia, Salmonella, Shigella e i generi Proteus, Vibrio e Photobacterium sono microrganismi Gramnegativi anaerobi facoltativi che in anaerobiosi fermentano il glucosio secondo questa via. I diversi prodotti finali caratteristici di questo provesso sono acidi organici a basso peso molecolare quali acido formico, acido acetico, acido lattico e acido succinico e piccole quantità di etanolo (in E. coli e Proteus l acido formico è scisso in CO 2 e H 2 dalla formico idrogenoliasi, un enzima la cui presenza assume una rilevante importanza tassonomica e diagnostica) I rapporti percentuali di questi prodotti variano nei diversi microrganismi e a seconda delle condizioni colturali e ambientali, sempre nel rispetto dell equilibrio ossido-riduttivo del processo 24

La fermentazione 2,3-butilenglicolica FERMENTAZIONE B4 2.3-BUTILENGLICOL acetaldeide etanolo glucosio 2 2 ATP lattato piruvato formiato acetil-coa 4 CO 2 H2 CO 2 Tipica di altre Enterobacteriaceae aventi come habitat il suolo o le acque (Enterobacter aerogenes e i generi Erwinia, e Serratia, patogeni delle piante). Il prodotto principale è il 2,3-butilenglicol che si forma dalla condensazione di due molecole di piruvato con la liberazione di due molecole di CO 2. In minore quantità si producono anche gli acidi della precedente fermentazione accanto a notevoli quantità di etanolo per il mantenimento dell equilibrio ossido-riduttivo. In E. aerogenes è presente la formico idrogenoliasi α-acetolattato acetoino acetoina CO 2 2,32,3-butilenglicol butilenglicole L uso di questa via causa il decremento della formazione di acidi (il butilenglicole è neutro) e la formazione dell intermedio ACETOINO. Coloro che si occupano di analisi microbiologica dell acqua possono distinguere i coliformi fecali (ferm. acidomista) dai non fecali (ferm. butileglicolica tipica dei generi come Klebsiella) andando a svelare la presenza di acetoino ed un ph più alto o butandiolo 25 3 3 1.5 glucosio 3 CH 3 - C O - C OOH 3 C H 3 - CHOH - C OOH FERMENTAZIONE PROPIONICA 3ATP 2 C H 3 - CH 2 - COOH 2 C H 3 - CH 2 - CO SCoA VIA DEL METILMALONIL-CoA in Propionibacterium e Veillonella CO 2 B5 ac. acetico CO 2 Biotina Biotina La fermentazione propionica 2 HOOC - CH 2 - C O - COOH 2 HOOC - CH 2 - C HOH - COOH H 2 O 2 HOOC - CH - CH - COOH ATP 2 HOOC - CH 2 - C H 2 - COOH 2 HOOC - CH 2 - C H 2 - CO SCoA Coenzima B12 2 HOOC - CH - CO SCoA CH 3 Il glucosio viene fermentato ad acido acetico, CO 2 ed acido propionico dal genere Propionibacterium attraverso una via complessa detta del metilmalonilcoa. Veillonella, il cui habitat è il rumine dei bovini, compie la stessa fermentazione partendo dall acido lattico. Altri microrganismi producono acido propionico da acido lattico attraverso una via diversa La resa energetica, tra le più elevate, include anche una mole di ATP prodotto per fosforilazione ossidativa tramite una breve catena di trasporto degli elettroni nella riduzione del fumarato a succinato (respirazione del fumarato) CoA transferasi Resa energetica = 5 ATP / 1,5 glucosio o 2 ATP / 3 ac. lattico 26

CH 3 - CH 2 - CH 2 - COOH ATP CoA P i CH 3 - CH CH - CO - CoA H 2 O butirrato CH3 - CH2 - CH2 - CO - O - P butirril fosfato CH 3 - CH 2 - CH 2 - CO - CoA butirril-coa crotonil-coa CH 3 - CH - CH 2 - CO - CoA OH L (+) -β-idrossibutirril-coa FERMENTAZIONE BUTIRRICA B6 Ferredossina idrogenasi La fermentazione butirrica Ferredossina 2H 2 2H + 2 glucosio 2CH 3 - CO - COOH 2Fd OX 2Fd RED 2CH 3 - CO - CoA 2ATP 2CO 2 2CoA CoA CH 3 - CO - CH 2 - CO - CoA acetoacetil-coa Si ritrova in Clostridium, sporigeno anaerobio obbligato ossigeno-intollerante, in grado di fermentare il glucosio. Caratteristica di questa via è la produzione di CO 2 e H 2 nella reazione del coenzima A (CoASH) con il piruvato. Il principale prodotto finale è l acido butirrico, la cui formazione consente il mantenimento dell equilibrio ossido-riduttivo In altre condizioni e per la presenza di ferredossina, parte dell H 2 liberato viene trasportato al NAD +, che si riossida scaricandosi sui prodotti acidi con conseguente produzione degli alcooli corrispondenti Alcuni Clostridi producono in particolari condizioni butanolo e acetone, che sono di interesse industriale Equazione generale: glucosio butirrato + 2CO 2 + 2H 2 Resa: 3 ATP N.B.: la ferredossina è una ferro-zolfo proteina che media il trasferimento di elettroni in diverse reazioni metaboliche 27 B7 La fermentazione omoacetica In alcuni clostridi, il glucosio (1 mole) viene stechiometricamente fermentato a 3 moli di acetato, una delle quali deriva dalla riduzione delle 2 moli di CO 2, che provengono dalla scissione del piruvato ad acetil-coa Non va confusa con la produzione di acido acetico da parte di Acetobacter e Gluconobaceter, i quali, per produrre acido acetico, non operano una fermentazione, ma ossidano l etanolo ad acido acetico per recuperare potere riducente ( + H + ) 28

4 B8 Il metabolismo fermentativo dei bifidobatteri Ha scarsa attività nei bifidobatteri È assente nei bifidobatteri Aldolasi Il fruttosio 1,6 bisfosfato funge da induttore della lattato deidrogenasi 29 Fruttosio-6-P Pi H 2 O F6PPK (xfp) 4 B8 1 Acetil-P ADP ATP Acetato D-gliceraldeide-3-P D-eritrosio-4-P Diidrossiaceton transferasi Fruttosio-6-P D-sedoeptulosio-7-P Via fermetativa di Bifidobacterium o via della Fruttosio-6-P Fosfochetolasi D-xilulosio-5P D-ribosio-5-P 2 Acetil-P ADP ATP 2 Acetate D-ribulosio-5-P D-xilulosio-5-P Pi H 2 O 2 D-gliceraldeide-3-P F6PPK (xfp) ACETATO:LATTATO = 3:2 2 Formiato Etanolo 30

I BATTERI LATTICI Sono batteri Gram POSITIVI, immobili, chemioeterotrofi a forma di bastoncino o cocco Il loro nome deriva dal fatto che formano ACIDO LATTICO come principale (e talvolta unico) prodotto finale del loro metabolismo energetico Hanno un metabolismo fermentativo; sono tutti anaerobi con variabile capacità di tollerare l ossigeno (con rare eccezioni, legate alla presenza di EME esogeno) Sono incapaci di produrre ATP attraverso un metabolismo aerobio, a causa dell incapacità di sintetizzare citocromi o altri enzimi contenenti il gruppo eme. A causa dell impossibilità di produrre proteine eminiche, sono CATALASI NEGATIVI e quindi non possono operare la decomposizione dell H 2 O 2 in H 2 O e O 2 Una caratteristica propria dei batteri lattici è la loro elevata ACIDO-RESISTENZA, la quale consente loro di crescere fino a quando il ph raggiunge valori inferiori a 5. Questa caratteristica fisiologica è di grande importanza ecologica, perché permette loro di vincere la competizione di altri batteri in ambienti ricchi di materia organica. Come risultato della loro specializzazione fisiologica, i batteri lattici sono confinati in pochi e caratteristici ambienti naturali: alcuni vivono in associazione con le piante e crescono a spese delle sostanze nutritive liberate in seguito alla morte e alla decomposizione dei tessuti vegetali; si trovano quindi in alimenti e bevande preparate con materiale vegetale come sottaceti, crauti, foraggi insilati, vino e birra. Altri fanno parte del normale microbiota degli animali (bocca, intestino, mucosa vaginale). Infine, alcuni sono spesso associati al latte (per es. Streptococcus thermophilus) 31 Streptococcus Alcuni generi di batteri lattici Oenococcus Lactococcus Carnobacterium Pediococcus Enterococcus Leuconostoc Lactobacillus 32 Immagini al SEM 32

I BATTERI LATTICI Sulla base dei loro prodotti di fermentazione, sono divisi in tre sottogruppi metabolici 1 OMOFERMENTANTI: degradano il glucosio via glicolisi e non sono in grado di utilizzare i pentosi. Il piruvato viene poi ridotto ad acido lattico, unico prodotto della loro fermentazione 2 ETEROFERMENTANTI OBBLIGATI: non possono degradare il glucosio via glicolisi in quanto non possiedono l enzima FRUTTOSIO 1,6 DIFOSFATO ALDOLASI che catalizza la scissione del fruttosio 1,6 difosfato in gliceraldeide-3- fosfato e diidrossi-acetone-fosfato. Per tale ragione essi fermentano il glucosio attraverso la via dei pentoso fosfati, ottenendo tre prodotti finali in rapporto equimolare: ACIDO LATTICO, ETANOLO e CO 2. Possono utilizzare anche i pentosi, nel qual caso senza produzione di CO 2. Possono produrre anche piccole quantità di acido acetico 3 ETEROFERMENTANTI FACOLTATIVI: in presenza di ESOSI essi li fermentano attraverso la glicolisi con produzione di solo ACIDO LATTICO, comportandosi perciò come omofermentanti. In presenza di PENTOSI, effettuano l ossidazione di tali composti attraverso la via dei pentoso fosfati, senza produzione di CO 2 L acido lattico prodotto può essere in configurazione L, D oppure in miscela racemica DL 33 34

Omofermentanti Zuccheri esosi X Zuccheri pentosi Eterofermentanti Esosi facoltativi Eterofermentanti esosi obbligati Pentosi in quantità ridotte ( ) 35 TERRENI COLTURALI PER BATTERI LATTICI Terreno MRS a ph 6,2-7: non selettivo, adatto per il mantenimento dei lattobacilli Terreno SL: selettivo per l isolamento dei lattobacilli (tripticase, estratto di lievito, citrato, glucosio, arabinosio, saccarosio, acetato, ph finale 5,4) Terreno ATB: adatto per l isolamento di Oenococcus oeni (peptone, estratto di lievito, succo di pomodoro 25 %, ph finale 4,8) Poiché i batteri lattici sono anaerobi (sebbene ossigeno tolleranti), i migliori risultati di crescita si ottengono incubando le piastre di isolamento in giare di anaerobiosi (Gas-Pak) 36

I BATTERI ACETICI Appartengono alla famiglia delle Acetobacteraceae Sono bastoncini Gram NEGATIVI, aerobi chemio-eterotrofi, catalasi positivi, termolabili e psicrotrofi Sono marcatamente acidofili (crescono fino a ph 4, a concentrazioni di ac. acetico fino a 0,4 M) Il ph ottimale è compreso tra 5,4 e 6,3. Acetobacter pasteurianus cresce anche a ph 3 se l etanolo è inferiore all 8% Si localizzano soprattutto sulla superficie di piante, in particolare fiori e frutti Sono microrganismi mesofili che crescono con temperatura ottimale intorno a 30 C; alcuni ceppi si riescono a sviluppare anche a 5 C, altri sono blandamente termotolleranti (37-40 C) Tollerano basse concentrazioni di acido acetico; tollerano bene l etanolo e molti ceppi crescono in un range compreso tra 8 e 15 %. La concentrazione tollerata dipende da ph, temperatura e concertazione di O 2 I tre generi più noti: Acetobacter: A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus, A. cerevisiae, A. pomorum Gluconoacetobacter: G. xylinus, G. diazotrophicus, G. intermedius, G. liquefaciens Gluconobacter: G. oxydans, G. frateurii Altri generi e specie: Acidomonas methanolica, Asaia spp., Kozakia baliensis, Saccharibacter spp., Swaminathania spp., Frateuria spp. 37 Le specie più importanti nella produzione industriale dell aceto sono: - Acetobacter aceti subsp. orleanensis - Acetobacter aceti subsp. xylinum (madre dell aceto) - Acetobacter pasteurianus subsp. lovaniensis - Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens - Acetobacter pasteurianus subsp. paradoxus In particolare, i membri del genere Acetobacter sono particolarmente importati da un punto di vista industriale (sia positivamente che negativamente) per diversi motivi, tra i quali: 1. sono usati per la produzione dell aceto (usati per convertire intenzionalmente l etanolo del vino o di altri prodotti alcolici in acido acetico) 2. possono deteriorare il vino producendo quantità eccessive di acido acetico o etil-acetato (entrambi rendono sgradevole il vino). La crescita di Acetobacter nel vino può essere inibita attraverso la completa eliminazione dell ossigeno durante la conservazione del vino oppure con l aggiunta di moderate quantità di SO 2 3. sono usati per acidificare intenzionalmente alcune birre aventi periodi di maturazione lunghi (per esempio per la produzione della birra tradizionale Flemish Sour Ale) 38 38

Peculiarità metaboliche I batteri acetici sono aerobi obbligati aventi metabolismo aerobio (respirazione aerobica) In particolare, i batteri acetici sono caratterizzati da metabolismo aerobio con ossidazione incompleta dei substrati organici Utilizzano diverse fonti di carbonio, dagli zuccheri agli aminoacidi. Preferiscono etanolo, glicerolo, lattato, mannitolo, sorbitolo, fruttosio, glucosio Come fonte di azoto molti ceppi utilizzano NH 4 + Gli zuccheri sono ossidati esclusivamente attraverso la via del pentosio fosfato L acetato deriva dalla ossidazione parziale della materia organica e non da un vero processo di fermentazione Il PIRUVATO è trasformato attraverso una decarbossilazione non ossidativa ad acetaldeide (la decarbossilazione ossidativa del piruvato ad Acetil-CoA e CO 2, tipicamente presente nel processo di respirazione, non avviene in quanto il COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI nei batteri acetici è inattivo) 39 I BATTERI ACETICI tutto il generato in queste reazioni di ossidazione è destinato alla catena di trasporto degli elettroni, per creare il gradiente di H+ che permette la sintesi dell ATP ACIDO LATTICO NAD + +H + lattato deidrogenasi Glucosio via del pentosio fosfato pentosi-p interconversione non ossidativa triosi-p ultime tappe della glicolisi Ac. piruvico ETANOLO NAD + +H + alcol deidrogenasi CO 2 decarbossilazione non ossidativa Acetaldeide NAD + +H + per opera dell enzima aldeide deidrogenasi acetil-coa ligasi Gluconobacter non ha un ciclo di Krebs funzionale e non può dunque ossidare l acetato Ac. acetico Acetil-CoA Ciclo dei TCA CO 2 CO 2 In Acetobacter il ciclo di Krebs è inibito solo a concentrazioni elevate di etanolo 40