Relazione presentata al II Congresso Nazionale "Le micotossine nella filiera agroalimentare " (Roma, 16/10/2006), presentata da CRA Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura, sezione di Bergamo. Le micotossine nelle produzioni italiane di mais Flora fungina e micotossine vengono ritrovate in una vasta gamma di commodities agricole e di alimenti raffinati destinati al consumo diretto ed agli allevamenti (CAST, 2003). I cereali costituiscono la fonte di nutrimento principale per i quasi sette miliardi di uomini che attualmente popolano la terra; il mais, dopo frumento e riso, è la terza coltura per volumi di produzione (122 milioni di ettari investiti, 604 milioni di tonnellate prodotte, rese medie intorno a 5 t/ha). L Italia è il secondo produttore ed il primo consumatore di mais in Europa; alla coltura sono stati destinati nell ultimo decennio oltre un milione di ettari per la produzione di granella e 250-300 mila ettari per la produzione di trinciato integrale. I volumi prodotti pari a 10-10,4 milioni di tonnellate di granella e 4.5 miliardi di unità foraggere, sono superiori a quelli degli altri cereali insieme considerati: le rese sono cresciute ad una percentuale media dell 1,4% per anno e la produzione nazionale, a partire dal 1995-96 è riuscita a saturare la domanda interna per gli impieghi zootecnici (84% del totale), per l industria amidiera (12%) e per gli usi alimentari (4%). Il mais è anche la specie più studiata per tutti gli aspetti di interazione con i funghi micotossigeni e la più monitorata per la concentrazione delle varie classi di tossine presenti nelle diverse aree di coltivazione, estese dal sub-tropico alle zone temperate fredde delle alte latitudini. I funghi e le tossine Le più importanti classi di micotossine trovate in mais comprendono le aflatossine, prodotte da funghi del genere Aspergillus, i tricoteceni (tra i quali il Desossinivalenolo) e lo Zearalenone prodotti da specie di Fusarium della Sezione Discolor; le Fumonisine prodotte da specie di Fusarium della Sezione Liseola, le ocratossine prodotte da funghi del genere Penicillium ed Aspergillus. Lo sviluppo dei diversi generi-razze fungine e la sintesi di micotossine sono fondamentalmente influenzati dai determinanti climatici ed agro-ambientali delle macroaree di coltivazione ed in special modo dalle temperature e dall umidità. Diverse indagini e monitoraggi condotti nelle principali aree maidicole mondiali indicano come i funghi del genere Aspergillus, responsabili della produzione di Aflatossine, siano specialmente diffusi nelle aree più calde di coltivazione comprese tra i 26 ed i 35 gradi di latitudine (Klich et al., 1992) e possano causare infezioni di campo significative anche a latitudini elevate in corrispondenza con andamenti stagionali eccezionalmente caldi ed asciutti (CAST, 2003). 1
Relativamente al genere Fusarium, di gran lunga il più frequente nella vasta area temperata di coltivazione, le specie F. verticilloides e F. proliferatum, agenti del Marciume rosa della spiga e responsabili della produzione di fumonisine, hanno un maggior adattamento nei climi più caldi e siccitosi nella fase di riempimento della granella; le specie F. graminearum e F. culmorum agenti del marciume rosso della spiga e responsabili della produzione di DON e Zearalenone sono frequenti nei climi più freschi e piovosi nella fase riproduttiva del mais. Alcuni recenti lavori indicano una stretta relazione tra la latitudine e la frequenza dei marciumi rossi e rosato della spiga: F. verticilloides è di gran lunga prevalente nelle aree subtropicali e negli stati del Sud e del Sud-Est della fascia del mais americane (Lesile, 1995); procedendo verso Nord la sua incidenza diminuisce in corrispondenza dell affermazione di F. graminearum che diventa prevalente a partire dall area nord dell Illinois. Una zona di transizione è stata osservata in Iowa (Munkvold, 2003) dove isolati da coltivazioni delle contee centrali e meridionali hanno rilevato la predominanza di F. verticilloides, mentre nelle contee settentrionali è stato ritrovato principalmente F. subglutinans e quindi F. graminearum. Distribuzioni simili per effetto della latitudine sono state osservate anche nelle aree di coltivazione europee (Bottalico, 2004); le indicazioni sono state confermate da una vasta indagine condotta da Syngenta Seeds negli anni 1999-2003 (Tanzi, 2005) nella quale sono state rilevate concentrazioni di fumonisine superiori alla media europea nelle aree di coltivazione meridionali (Spagna, Portogallo, Italia, Grecia, Francia meridionale, Paesi balcanici) e, di contro, una prevalenza di DON e Zearalenone nelle aree settentrionali (Francia, Germania, Austria, Ungheria, polonia, Slovacchia). In Italia sono state recentemente condotte diverse indagini sulla diffusione delle principali tossine con campionamento di partite commerciali o di prodotti ancora in campo (Pietri et al., 2004; Verderio et al., 2005; Battilani et al., 2005; Reyneri et al., 2004; Logrieco et al., 2004). Inoltre, sono stati resi disponibili dati di laboratorio relativi alle analisi di controllo di granelle, farine e mangimi. Fumonisina B1 Le fumonisine vengono rilevate come la classe di micotossine più diffusa nelle aree di coltivazione italiane. Pochissimi campioni tra gli oltre 4000 raccolti nel periodo 1995-2004 sono risultati negativi all analisi. In tutte le indagini considerate solo il 30/40% dei campioni presentava concentrazioni della tossina inferiore a 1500-2000 μg/kg, valori di riferimento discussi in sede europea per il prodotto grezzo destinato a trasformazioni alimentari. Prendendo in considerazione valori di concentrazione di 4-5000 μg/kg indicati da più parti come limite di attenzione, verrebbe esclusa dagli usi normali una quota di produzione che risulta mediamente pari al 20% nel periodo considerato ma che in annate particolarmente favorevoli al fungo (anni 2002 e 2003) può raggiungere valori intorno al 35-40%. 2
Aflatossina AFB1 In tutte le reti di monitoraggio ed anni di indagine la quota preponderante dei campioni, pari all 80-85% del totale, ha presentato concentrazioni nulle o molto basse, e comunque al di sotto del limite di 2 μg/kg indicato in Europa per la destinazione alimentare. Una ulteriore quota oscillante intorno al 10-15% del totale è risultato contenere concentrazioni della micotossina compresi tra i 2 ed i 20 μg/kg. Solo nelle annate 2003 (temperature e stress evapotraspirativo eccezionalmente elevati lungo tutto il ciclo di sviluppo, raccolta fortemente anticipata con granella postmaturata in campo) ed, in misura minore nell annata 2004, la frequenza dei campioni con valori critici (< 20 μg/kg) o molto critici (< 50 μg/kg) è diventata consistente risultando pari al 11% del totale nel 2003 ed al 6% del totale nel 2004. Deossinivalenolo (DON) e Zearalenone (ZEA). La produzione di DON e ZEA avviene generalmente nelle aree di coltivazione più fresche, in corrispondenza ad andamenti stagionali piovosi nei mesi di agosto-settembre, in colture che, dopo la comparsa dello strato nero, permangono a lungo in campo con elevata umidità della granella. Negli anni delle indagini (1995-2004) la concentrazione di Zearalenone si è mediamente mantenuta al di sotto del valore di 200 μg/kg nel 90% dei campioni esaminati. Una drammatica impennata dei livelli di contaminazione è stata rilevata nel 1996 in corrispondenza ad un andamento stagionale eccezionalmente favorevole allo sviluppo dei funghi del marciume rosso della spiga. Le concentrazioni di DON hanno mostrato valori inferiori ai 500 μg/kg nell 85-90% dei campioni esaminati con qualche incremento, nel 2002 e 2004, delle frequenze dei campioni con valori intorno a 1000-1500 μg/kg. La contaminazione è risultata critica nel 1996 con quote importanti di produzione ben al di sopra della soglia di 1500-2000 μg/kg. Il controllo delle contaminazioni I funghi tossigeni sono ubiquitari nel terreno, nei residui colturali, negli impianti di condizionamento-stoccaggio, nei depositi di alimenti e mangimi. La capacità dei funghi di infettare la pianta di mais o la granella e le circostanze che inducono il fungo a produrre micotossine in quantità elevate o modeste sono ampiamente determinate dai parametri climatici delle macroaree di coltivazione e dagli andamenti stagionali delle singole annate di crescita. La temperatura e l umidità dell aria influenzano in modo sensibile l andamento delle contaminazioni anche nelle fasi di post-raccolta. Le pratiche agronomiche intese a ridurre il grado di multistress delle coltivazioni ed i processi di condizionamento-conservazione dei raccolti influenzano la concentrazione finale delle tossine. La conoscenza dell ecologia dei funghi tossigeni e del modo di attacco alle coltivazioni ed alle produzioni permette di indirizzare la messa a punto di procedure ed accorgimenti per la 3
prevenzione ed il controllo delle micotossine. Da alcuni autori sono state proposte classificazioni degli agenti patogeni sulla base delle caratteristiche fisiologiche e del loro modo di agire nelle fasi critiche dell interazione ospite-parassita: riempimento-maturazione della granella, raccolta ed essiccazione, ammassamento e conservazione. Una prima suddivisione dei patogeni tra funghi da campo e funghi da stoccaggio si basa sulla diversa capacità di attaccare la pianta in vegetazione causando malattie sistemiche unitamente alle note sindromi dei marciumi della spiga: Gibberella zeae, forma sessuata di F. graminearum, e F. verticilloides sono tra i principali agenti del marciume dello stocco e delle radici (stalk rot) e della morte prematura della pianta (Compendium of corn diseases, 2000). Di contro, Aspergillus e Penicillium si collocano, in questa suddivisione, tra i funghi da stoccaggio per la loro limitata capacità di attacco in campo e per l adattamento alla crescita su granella a bassa umidità durante le fasi di raccolta e post-raccolta. La capacità di crescere su substrati con umidità inferiore od uguale al 18% è spesso citata come criterio di separazione tra le due categorie di patogeni (Smith and White, 1988). Questa suddivisione, senz altro utile ai fini orientativi, non è in grado di separare completamente le due categorie (Munlvold, 2003): alcune specie di Aspergillus e Penicillium (ed in particolare A. flavus) presentano, nelle macroaree calde o nelle stagioni favorevoli, evidenti fenomeni di crescita sulle spighe in maturazione: di contro, alcune specie di Fusarium possono crescere in fase di post-raccolta se l umidità della granella non è adeguatamente controllata. Miller (1995) propone una diversa classificazione dei funghi fondata sul tipo di interazione fungo-pianta nelle diverse fasi si crescita; egli distingue tra funghi patogeni aggressivi come F. graminearum che provoca malattie sistemiche della pianta, patogeni opportunisti come F. verticilloides ed A. flavus i quali crescono e producono tossine su piante stressate (insetti e siccità) o piante senescenti, funghi come A. flavus che sviluppano inizialmente sulla pianta e predispongono una più estesa contaminazione dopo la raccolta; funghi come P. verrucosum ed A. ochraceous presenti nel suolo e su tessuti morti in grado di moltiplicarsi in situazioni di stoccaggio permissive. Il controllo in fase di coltivazione L adozione delle pratiche agronomiche atte a massimizzare la performance finale della coltivazione diminuendo il grado di multistress ( strategia del benessere della pianta) e degli accorgimenti capaci di diminuire la quantità-durata dell interazione pianta-patogeno ( strategia dell evitamento ) o di spostarne l equilibrio a favore della pianta, è in grado di ridurre la contaminazione di micotossine in campo. Di seguito vengono discussi alcuni aspetti notevoli in relazione all ambiente di coltivazione padano. Stabilità produttiva ed adattamento alle condizioni locali sono i caratteri da considerare nella scelta dell ibrido 4
Nel settore delle grandi colture l introduzione delle resistenza genetiche nelle piante coltivate è l approccio più praticato ed efficace per il controllo delle fitopatie. Sfortunatamente la selezione di ibridi di mais resistenti alle micotossine è un processo ancora in corso ed appare di non facile soluzione. Fonti di resistenza a base genetica semplice o più spesso poligenica sono state ritrovate in mais (Reid et al., 1994; Brown et al., 1999; Holley et al., 1989), tuttavia difficoltà di inoculo, alto costo delle analisi, scarsa ripetibilità degli esperimenti, elusività dei patogeni, e complicanze nel trasferimento dei geni utili nel germoplasma elite costituiscono seri ostacoli per l ottenimento di ibridi resistenti. Il ricorso alle tecniche della transgenosi secondo diverse strategie miranti ad incrementare direttamente la capacità di difesa della pianta verso il fungo o miranti ad indurre la sintesi di enzimi in grado di detossificare le micotossine (Duvik, 2001) offre buone opportunità per il futuro; già al presente ibridi transgenici per gli eventi Bt assicurano, indirettamente attraverso il controllo della piralide, una significativa riduzione della concentrazione di fumonisina (Munkvold et al., 1999; Masoero et al., 1999). Nelle diverse fasi dei normali programmi di selezione i breeders rutinariamente eliminano i genotipi più suscettibili e nella gamma degli ibridi coltivati e senz altro presente una quota di variabilità genetica per il grado di suscettibilità alle infezioni fungine. Tuttavia la valutazione dei materiali commerciali incontra, come ovvio, le stesse difficoltà descritte per il lavoro di miglioramento genetico; è quindi non facile per i servizi di extension mettere a disposizione degli operatori indicazioni consistenti e graduatorie per il grado di resistenza dei materiali disponibili. Peraltro, alcune caratteristiche fisiologiche o morfologhice della pianta quali: a) speficihe tolleranze allo stress d acqua; b) adattamento all ambiente di coltivazione e stabilità produttiva per tolleranza ai fattori locali di stress; c) portamento non eretto della spiga in fase di riempimento della granella; d) completa copertura della spiga da parte delle brattee) e) cartoccio bratteale tenace ed aderente alla spiga (favorevole contro Aspergillum e F. verticilloides, non favorevole contro F. graminearum); f) pericarpo di buon spessore; g) granella meno suscettibile alle rotture per forma della cariosside o tessitura dell endosperma, possono indirettamente limitare le contaminazioni. Lo stress evapotraspirativo è da considerarsi tra le condizioni più favorevoli per lìinfezione fungina L infezione primaria ed il successivo sviluppo dei funghi trovano condizioni molto favorevoli in corrispondenza dei periodi, più o meno lunghi, nei quali la pianta si trova in stato di stress evapotraspirativo per inadeguata disponibilità di acqua in relazione alle temperature. La fase più critica della coltura per lo sviluppo e la produzione finale (fecondazione delle sete, sviluppo dell embrione e prima fase di riempimento dell endosperma) costituisce anche la fase più critica in relazione all esito dell infezione fungina; gli stress d acqua in fase di avanzato riempimento della 5
granella influenzano meno la produzione ma favoriscono fortemente lo sviluppo dei funghi opportunisti e la contaminazione di fumonisine ed aflatossine. Nei mostri ambienti si rende necessaria la pratica dell irrigazione per assicurare un adeguato e regolare rifornimento di acqua alla coltura. Nelle situazioni di non completo controllo del fattore acqua per ridotta disponibilità o alti costi di distribuzione ed inoltre nelle aree con maggiore frequenza di eccessi termici, risulta utile integrare l irrigazione con procedure agronomiche efficaci per contenere il livello di stress. Tra queste, l anticipo dell epoca di fioritura è ottenibile con una semina precoce, con il contrasto dei fattori di stress in prefioritura (malerbe, insetti, destrutturazione dei suoli, stasi da siccità), con l adozione di ibridi più precoci rispetto ai materiali di piena stagione. L adozione di investimenti moderati evita alla coltura gli stress da popolazione : le colture fitte manifestano anticipatamente ed in modo più grave i sintomi della mancanza di acqua (appassimento, proterandria, eccessivo allungamento delle sete, disseccamenti basali) e le conseguenze produttive (disordini nel settaggio delle cariossidi e nello sviluppo della spiga, premorienza e striminzimento della granella). L infestazione della piralide è un fondamentale fattore concomitante dell invasione fungina Le larve di prima generazione indeboliscono la pianta già in fase di inizio levata; quelle di seconda generazione compaiono durante o appena dopo la fase di fecondazione, quindi si approfondiscono con lunghe gallerie in tutti gli organi della pianta diffondendo o favorendo l infezione dei funghi nello stocco e nei tessuti danneggiati della spiga e della granella; larve di terza generazione sono state osservate nelle aree più calde con una infestazione preferenziale a carico della spiga. La strategia più efficace per contenere i danni diretti ed indiretti dell insetto è di posizionare le fasi fenologiche della coltura in modo disaccoppiato dal ciclo di riproduzione dell insetto: l anticipo dell epoca di fioritura con le modalità descritte precedentemente e la rinuncia a coltivazioni di granella in semina ritardata sono gli accorgimenti più comunemente messi in atto nei nostri ambienti. Le pratiche di evitamento sono utilmente integrabili con le pratiche di controllo diretto dell insetto mediante trattamenti di pieno campo in post fioritura contro larve di seconda generazione e, recentemente, contro le masse-uova prima della schiusura. La tempestività della raccolta dopo la formazione dello strato nero previene la fase più attiva dell invasione fungina Il mais conclude il riempimento della cariosside e raggiunge il massimo della sostanza secca dopo la comparsa dello strato nero (maturazione fisiologica); in questo stadio la granella presenta una umidità intorno al 31-33%. La successiva fase di perdita di umidità in campo fino allo stadio di maturazione agronomica può avere diversa durata, in relazione all epoca di comparsa 6
dello strato nero ed all andamento stagionale. La granella di mais, isolata dalla pianta madre, diventa in questa fase estremamente suscettibile all invasione dei funghi. Il livello finale di concentrazione delle micotossine, oltre che dal potenziale di inoculo del fungo, dalle condizioni di incubazione (temperature, umidità relativa, eliofania) e dall attività della piralide, dipende anche dalla durata del periodo durante il quale il substrato (la granella di mais) è lasciata a disposizione dei patogeni. Le indicazioni per l agricoltore sono immediatamente conseguenti: diminuire i tempi di permanenza del mais in campo (oggi valutabili tra i 20 e i 45 giorni) dopo la formazione dello strato nero, accettando di raccogliere ad una umidità ragionevolmente più alta di quella consentita dall ibrido o dall andamento stagionale, ed evitare la postmaturazione in pianta fino a valori dell umidità prossimi a quelli di conservazione: Aspergillus cresce e produce aflatossine fino ad una umidità della granella di 15-16%; F. verticilloides cresce e produce fumonisine fino ad una umidità della granella del 18-20%. L applicazione di un intervento agronomico intensivo e convenzionale diminuisce il grado di multistress e fornisce alla pianta migliori difese Una concimazione razionale ed equilibrata tra i diversi macroelementi (soprattutto azoto e potassio) e con quantità di azoto calcolate con criteri di anticipazione alla coltura delle quantità asportate od assorbite sulla base delle aspettative di resa; l adozione di tecniche di lavorazione del terreno in grado di massimizzarne la strutturazione e la capacità idrica; il puntuale controllo delle malerbe ed, in generale, tutte le pratiche e gli interventi agronomici capaci di aumentare il benessere della pianta sono state descritte da diversi autori come non favorevoli all infestazione dei funghi. A questo proposito, prescindendo da ogni altra considerazione di carattere generale e focalizzando specialisticamente l attenzione sull argomento trattato, appaiono evidenze secondo le quali il prodotto da agricolture non convenzionali quali agricolture low input, agricolture conservative, agricolture biologiche, messe in atto per considerazioni di ordine economico (non sufficiente risposta dei mezzi tecnici e degli interventi agronomici) o con intenti di salvaguardia ambientale, appare più a rischio per il fattore sanità-micotossine. Infine, la rotazione e l effetto dei residui colturali: la più importante fonte di inoculo dei funghi tossigeni è certamente costituita dei residui colturali ed, in linea generale, la rotazione con specie diverse dai cereali e l interramento dei residui sono pratiche raccomandabili per il controllo dei livelli di infestazione. Diversi autori (McMullen et al., 1997, Shaafsma et al., 2001) hanno messo in evidenza un sensibile incremento delle concentrazioni di DON in colture di frumento in successione a se stesso ed in successione a mais ed inoltre in colture sod seeding rispetto a colture seminate su terreno arato. Lo stesso comportamento non appare invece evidente in mais, per il quale non sono 7
stati rilevati effetti consistenti della rotazione sulla concentrazione finale di micotossine (McGee et al., 1996; Cotten e Munkvold, 1998). A cura di: Alberto Verderio CRA - Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura, sezione di Bergamo 8