Caratterizzazione molecolare mediante elettroforesi in campo pulsato (PFGE) e riboprinting di isolati di Pseudomonas fluorescens a seguito dell evento mozzarelle blu C. NOGAROL 1, C. PANTEGHINI 2, S. GALLINA 1, P. DAMINELLI 2, M. FAVRETTI 3, S. BILEI 4, S. SCUOTA 5, V. CALIGIURI 6, N. ADDANTE 7, C. PIRAINO 8, L. DECASTELLI 1, B. BERTASI 2 1 IZS del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta, Via Bologna 148, 10154 Torino 2 IZS della Lombardia ed Emilia Romagna, V. Bianchi 9, 25124 Brescia 3 IZS delle Venezie, Viale dell Università 10, 35020 Legnaro (PD) 4 IZS Lazio e Toscana, Via Appia Nuova 1411, 00178 Roma 5 IZS Umbria e Marche, Via G. Salvemini 1, 06126 Perugia 6 IZS del Mezzogiorno, Via Salute 2, 80055 Napoli 7 IZS Puglia e Basilicata, Via Manfredonia 20, 71121 Foggia 8 IZS delle Sicilie, Via G. Marinuzzi 3, 90129 Palermo C. Nogarol et al. Large Animal Review 2013; 19: 115-121 115 RIASSUNTO Le specie appartenenti al genere Pseudomonas sono considerate ubiquitarie e possono venire facilmente a contatto con qualsiasi tipo di alimento. In particolare, la loro rilevanza nella filiera lattiero-casearia risulta collegata alla capacità di adattamento anche a temperature di refrigerazione. L incremento della soglia di attenzione, a seguito dell evento mozzarelle blu, ha comportato sia l aumento delle indagini analitiche per la verifica della diffusione di tali specie batteriche che la messa a punto di tecniche di caratterizzazione molecolare degli isolati. Scopo del presente studio è stato caratterizzare a livello molecolare 94 isolati di P. fluorescens mediante PFGE e ribotipizzazione automatica al fine di valutare la correlazione genetica tra gli isolati, individuare eventuali fonti di contaminazione dei prodotti lattiero-caseari in oggetto ed escludere che il caso mediatico fosse legato ad un possibile focolaio epidemico. Nonostante le due metodiche di tipizzazione molecolare abbiano un diverso potere discriminatorio, è stato possibile ottenere risultati sovrapponibili applicando specifici criteri di analisi. I dati ottenuti sottolineano la normale circolazione di numerosi ceppi di P. fluorescens nei diversi stabilimenti produttivi, tra loro geneticamente non correlati; questo consente di escludere sia una univoca fonte di contaminazione che la possibile presenza di un focolaio epidemico. PAROLE CHIAVE Pseudomonas fluorescens, PFGE, ribotipizzazione automatica, mozzarella. INTRODUZIONE Il genere Pseudomonas è costituito da un gruppo di batteri Gram negativi di forma bastoncellare. Essi hanno una temperatura di crescita ottimale intorno ai 25 C, ma possono moltiplicarsi anche a temperature di refrigerazione, ovvero sono considerate specie psicrotrofe 1. È considerato uno dei generi batterici più eterogenei ed ubiquitari, riscontrabile in sedimenti, campioni clinici, piante, funghi, acqua, suolo, rizosfera delle piante, mare, deserti 2. Alcune specie, ed in particolare P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens e alcuni fitopatogeni quali P. syringae, possono presentare stipiti che, in determinate condizioni di crescita, producono pigmenti blu, giallo-verdi, fluorescenti e idrosolubili 3, poiché possiedono nel loro genoma sequenze geniche codificanti enzimi produttori di molecole colorate 4. Lunghi tempi di conservazione a temperature di refrigerazione creano un ambiente selettivo Autore per la corrispondenza: Chiara Nogarol (chiara.nogarol@libero.it). per le specie psicrotrofe, rendendole specie di interesse dell intera catena produttiva alimentare, ed in particolare quella lattiero-casearia. È stato dimostrato che P. fluorescens rappresenta uno dei principali microrganismi della microflora naturale del latte crudo 5 ; inoltre, la sua presenza in campioni di latte trattato termicamente, sottolinea la sua capacità di aderire alle superfici mediante la formazione di biofilm. I trattamenti termici sono in grado di distruggere i microrganismi, ma non i loro enzimi termoresistenti: essi sono in grado di persistere durante le fasi di lavorazione 6 risultando attivi nel prodotto finito 7. Nonostante queste specie microbiche non siano strettamente patogene, l evento mozzarelle blu, verificatosi a partire dal giugno 2010, ha ottenuto un enorme impatto mediatico. In quei mesi si sono registrati in Italia ed in Germania numerosi casi di colorazione anomala in mozzarelle e prodotti lattiero-caseari freschi. Tutte le analisi effettuate dagli Istituti Zooprofilattici delle diverse regioni italiane hanno confermato la presenza di P. fluorescens. Tuttavia, relativamente al genere Pseudomonas non esistono riferimenti normativi e limiti di accettabilità per alimenti, ma la presenza di colora-
116 Caratterizzazione molecolare mediante elettroforesi in campo pulsato (PFGE) e riboprinting di isolati di Pseudomonas fluorescens zione anomala è uno stato di alterazione che potrebbe rientrare da quanto previsto nell art. 5 della Legge 283/62. L incremento della soglia di attenzione sia da parte dei consumatori che da parte dell autorità competente nelle sue attività di controllo, ha comportato l aumento delle indagini analitiche per la verifica della diffusione dei ceppi di P. fluorescens nei prodotti lattiero-caseari e negli stabilimenti produttivi 8,9,10 e la messa a punto di tecniche di caratterizzazione molecolare dei ceppi. Fra le diverse metodiche di biologia molecolare esistenti sono state scelte, per questo studio, la ribotipizzazione automatica e l elettroforesi in campo pulsato (PFGE). La scelta di tali metodiche è stata effettuata in funzione di alcune caratteristiche intrinseche delle stesse, ed in particolare la loro capacità di differenziare due ceppi realmente diversi, producendo un risultato per ogni ceppo analizzato, sensibilità fondamentale per caratterizzare il genoma di Pseudomonas, altamente variabile. Inoltre, entrambe sono metodiche altamente riproducibili, seppure con tempi e costi di esecuzione differenti. La ribotipizzazione automatica analizza uno specifico locus sugli operoni degli RNA ribosomiali, classificando in ribogruppi ceppi appartenenti alla stessa specie; la PFGE, invece, pur non essendo una metodica automatizzata, è considerata la tecnica d elezione per la caratterizzazione molecolare di isolati batterici grazie al suo elevato potere discriminatorio, ovvero alla possibilità di identificare come non geneticamente correlati due microrganismi appartenenti alla stessa specie. Obiettivo del presente studio è la valutazione del grado di correlazione genetica (mediante analisi del DNA) esistente tra i microrganismi appartenenti alla specie fluorescens, isolati da prodotti lattierocaseari freschi, presentanti o meno alterazione cromatica, ed eventualmente individuare le potenziali fonti di contaminazione dei prodotti. Tale analisi consentirebbe inoltre di individuare la possibile diffusione di un unico ceppo di P. fluorescens, in grado di contaminare diversi stabilimenti, anche geograficamente distanti fra loro. MATERIALI E METODI Isolamento e selezione degli isolati di P. fluorescens È stata considerata una selezione di 94 isolati di P. fluorescens collezionati nel periodo compreso tra Giugno 2010 e Giugno 2011 a partire da matrici lattiero-casearie fresche di tipo mozzarella. Le matrici analizzate sono state tutte prelevate dalla grande distribuzione italiana, ma prodotte e confezionate in diversi stabilimenti (12 italiani e 2 tedeschi). Il 56% degli isolati derivava da stabilimenti produttivi italiani (n=53), mentre il 44% da stabilimenti produttivi tedeschi (n=41). Il 50% (n=47) degli isolati era stato ottenuto da campioni cromaticamente alterati, mentre il 50% (n=47) era stato isolato da campioni con esame ispettivo conforme (Tab. 1). I campioni sono stati raccolti grazie alla rete degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali (II.ZZ.SS.) presenti sul territorio nazionale. Le analisi sono state eseguite presso la S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni di Torino dell IZS del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta e presso il Reparto di Tecnologia Acidi Nucleici Applicata agli Alimenti di Brescia dell IZS della Lombardia e dell Emilia Romagna. L isolamento è stato eseguito in accordo con quanto previsto dalla norma ISO/TS 11059:2009 Milk and milk products- Tabella 1 - Elenco e classificazione in codice degli stabilimenti analizzati: IT, Italia, G, Germania; distribuzione del numero di isolati nei vari stabilimenti e numerazione degli stessi in base alla capacità alterante. Identificativo Stabilimento N campioni Ceppi cromogeni IT ST1 4 4 IT ST2 2 0 IT ST3 33 14 IT ST4 3 2 IT ST5 2 1 IT ST6 2 1 IT ST7 2 1 IT ST8 1 1 IT ST9 1 1 IT ST10 1 0 IT ST11 1 0 IT ST12 1 1 G ST1 26 18 G ST2 15 3 Totale 94 47 Method for the enumeration of Pseudomonas spp.. La selezione dei 94 isolati è stata effettuata sulla base dell identificazione fenotipica mediante sistema miniaturizzato API 20E (Bio Merieux) e semina su terreno di crescita Nutrient Agar per 24h a 42 C per discriminare P. aeruginosa da P. fluorescens. Ribotipizzazione automatica I 94 isolati sono stati sottoposti a ribotipizzazione automatica mediante RiboPrinter Du Pont (Qualicon, Ltd. USA). L analisi mediante RiboPrinter si basa sul confronto di pattern ottenuti tramite digestione enzimatica del frammento genico 16S rrna. Questa metodica consente di effettuare sia l identificazione che la caratterizzazione batterica: ciascuno dei 94 isolati è stato incluso nello studio poiché l identificazione fenotipica mediante sistema miniaturizzato e l analisi del DNA confermavano l appartenenza alla specie fluorescens. L assegnazione ai diversi ribogruppi viene subordinata ad una valutazione di similarità eseguita con un algoritmo matematico basato su un cut-off del 95%. La sospensione batterica viene inattivata termicamente e successivamente sottoposta a digestione enzimatica, corsa elettroforetica, trasferimento su membrana ed ibridazione con una sonda specifica. Il segnale emesso, catturato da una macchina fotografica, viene rielaborato automaticamente dal software dello strumento in un report. In questo studio sono stati utilizzati gli enzimi di restrizione EcoRI e PvuII. L analisi di correlazione dei pattern di restrizione è stata effettuata grazie al software di analisi d immagine BioNumerics (versione 6.6, Applied Maths). L analisi di cluster è stata effettuata con metodo UPGMA, ottimizzazione dell 1,56%. Al fine di calcolare le percentuali di correlazione tra i profili ottenuti, è stato utilizzato il metodo curvebased, calcolato secondo il coefficiente di Pearson. Pulsed-field-gel-electrophoresis (PFGE) I 94 isolati di P. fluorescens sono stati sottoposti a restrizione enzimatica mediante SpeI 11;12. Il protocollo standard per l e-
C. Nogarol et al. Large Animal Review 2013; 19: 115-121 117 strazione del DNA prevede i seguenti passaggi: dopo isolamento su piastre di CBA (Columbia Agar Sangue) Microbiol, alcune colonie batteriche vengono stemperate in buffer CBS (100 mmtris-hcl, 100 mmedta) fino a raggiungere una densità ottica (OD) di 0,4; la sospensione viene mescolata con egual volume di gel di agarosio al 2% e colata in appositi supporti (mould), al fine di generare blocchetti da agar chiamati plug. Dopo solidificazione i plug vengono incubati per 2 ore a 55 C nel tampone di lisi (50 mm Tris-HCl, 50 mm EDTA, ph8 1%, Sarcosyl) contenente proteinasi K 0,1 mg/ml; dopo 2 lavaggi di 10 min in acqua deionizzata sterile e 3 lavaggi in buffer TE (10 mm Tris-HCl e 1 mm EDTA ph 8) ciascun plug viene quindi messo ad incubare overnight nella miscela di restrizione con l enzima secondo le istruzioni del produttore. Per valutare l efficacia di restrizione è stato utilizzato il ceppo di P. fluorescens NCTC 10038. Dopo incubazione i plug vengono caricati nel gel di agarosio 1% (Pulsed Field Certified Agarose, BioRad) e sottoposti a corsa elettroforetica utilizzando il CHEF Mapper XA (BioRad). L analisi di similarità dei pattern di restrizione è stata effettuata grazie al software di analisi d immagine BioNumerics (versione 6.1, Applied Maths). Al fine di calcolare le percentuali di similitudine tra i profili ottenuti, è stato utilizzato il metodo band-based, calcolato secondo il coefficiente di Dice. L analisi di cluster è stata effettuata con metodo UPGMA, ottimizzazione dello 0,5% e tolleranza del 2%. Grazie all elevato potere discriminatorio della metodica, ed in accordo con criteri analitici impiegati in altri lavori e scientificamente accettati 11,12,13, è stato impiegato un valore cut-off per considerare la correlazione genetica degli isolati. Pulsotipi con percentuale di similitudine maggiore all 80% sono stati considerati geneticamente correlati. RISULTATI L analisi mediante ribotipizzazione automatica (mediante enzima EcoRI) ha consentito di identificare 6 differenti ribogruppi: in Tabella 2 è riassunta la composizione di ciascun ribogruppo indicato con il numero attribuito in automatico dal sistema di analisi. Lo studio effettuato con EcoRI non ha permesso di associare particolari stabilimenti o zone geografiche a specifici ribogruppi (Tab. 3); inoltre non è stato possibile effettuare una discriminazione tra ceppi cromogeni e non cromogeni (Tab. 4). L analisi della Tabella 4 consente di riassumere che, relativamente agli stabilimenti maggiormente rappresentati: tutti i ceppi isolati dagli stabilimenti italiani IT ST1 (4 ceppi), IT ST2 (2 ceppi) e G ST2 (15 ceppi) sono confluiti nel ribogruppo EcoRI 1438-S-1; gli isolati dallo stabilimento G ST1 (26 ceppi), invece, sono confluiti nei ribogruppi EcoRI 1438-S-1 e EcoRI 1509- S-1; gli isolati dallo stabilimento IT ST3 (33 ceppi) si sono distribuiti nei ribogruppi EcoRI 1438-S-1, EcoRI 1509-S-1 e EcoRI 1450-S-1. Allo scopo di verificare la possibilità di discriminare ulteriormente i pattern e ottenere eventuali suddivisioni in cluster di affinità, sono stati selezionati random 36 ceppi appartenenti al ribogruppo principale EcoRI 1438-S-1 e sono stati ribotipizzati con un secondo enzima di restrizione, PvuII, portando all identificazione di 7 differenti ribogruppi, riportati in Tabella 5. Tabella 2 - Ribogruppi riscontrati mediante taglio con enzima EcoRI e numero di isolati appartenenti a ciascuno di essi. EcoRI Distribuzione ceppi 1438-S-1 72 1509-S-1 11 1450-S-1 7 1608-S-3 2 1450-S-6 1 1613-S-8 1 Totale 94 Tabella 3 - Distribuzione degli isolati dei vari stabilimenti nei ribogruppi EcoRI 1438-S-1, EcoRI 1509-S-1, EcoRI 1450-S-1. Ribogruppo EcoRI Ribogruppo EcoRI Ribogruppo EcoRI 1438-S-1 1509-S-1 1450-S-1 (tot isolati=72) (tot isolati=11) (tot isolati=7) IT ST1 n 4/4 ceppi n 0/4 ceppi n 0/4 ceppi IT ST2 n 2/2 ceppi n 0/2 ceppi n 0/2 ceppi IT ST3 n 24/33 ceppi n 4/33 ceppi n 5/33 ceppi G ST1 n 20/26 ceppi n 6/26 ceppi n 0/26 ceppi G ST2 n 15/15 ceppi n 0/15 ceppi n 0/15 ceppi Altro n 7/14 ceppi n 1/14 ceppi n 2/14 ceppi Tabella 4 - Distribuzione dei ceppi cromogeni e non cromogeni nei ribogruppi EcoRI 1438-S-1, EcoRI 1509-S-1, EcoRI 1450-S-1. Ribogruppo EcoRI Ribogruppo EcoRI Ribogruppo EcoRI 1438-S-1 1509-S-1 1450-S-1 (tot isolati=72) (tot isolati=11) (tot isolati=7) Ceppi cromogeni n 39 ceppi n 5 ceppi n 0 ceppi Ceppi non cromogeni n 33 ceppi n 6 ceppi n 7 ceppi
118 Caratterizzazione molecolare mediante elettroforesi in campo pulsato (PFGE) e riboprinting di isolati di Pseudomonas fluorescens Tabella 5 - Ribogruppi riscontrati mediante taglio con enzima PvuII e numero di ceppi appartenenti a ciascuno di essi. PvuII Distribuzione ceppi 1513-S-1 12 1513-S-4 18 1635-S-2 2 1634-S-7 1 1634-S-8 1 1635-S-1 1 1516-S-6 1 Totale 36 Lo studio effettuato con PvuII ha permesso di associare zone geografiche a specifici ribogruppi; anche in questo caso però non è stato possibile effettuare una discriminazione tra ceppi cromogeni e non cromogeni. Come si evince dalla Tabella 6 tutti i ceppi isolati dagli stabilimenti italiani si raggruppano nel ribogruppo PvuII 1513-S- 1, mentre tutti i ceppi isolati dagli stabilimenti tedeschi si raggruppano nel ribogruppo PvuII 1513-S-4. Risulta importante sottolineare che i ceppi appartenenti ai ribogruppi PvuII 1513-S-1 e PvuII 1513-S-4 rappresentano solo una parte dei ceppi contenuti nei cluster A e B ottenuti mediante PFGE. L analisi mediante programma Bionumerics dei profili ottenuti con gli enzimi EcoRI e PvuII restituisce i dendrogrammi in Figura 2 e 3. Sulla base del cut-off dell 80% sono stati identificati 6 cluster con EcoRI e 7 cluster con PvuII, confermando la suddivisione in ribogruppi. L analisi mediante PFGE ha portato all identificazione di 44 diversi pulsotipi. Trentadue pulsotipi sono costituiti da un solo isolato, mentre all interno dei restanti 12 pulsotipi è presente più di un isolato (da 2 a 20). Nella quasi totalità dei casi, gli isolati provenienti da stabilimenti italiani e accomunati da stesso pulsotipo provengono dal medesimo stabilimento. Fanno eccezione solo due pulsotipi, numerati progressivamente P13 e P19. In Tabella 7 è schematizzata la composizione dei due pulsotipi di interesse. Il pulsotipo P13 è presente in tre stabilimenti italiani, mentre il pulsotipo P19 risulta in comune a due dei tre suddetti stabilimenti e ad uno stabilimento tedesco. L analisi mediante programma Bionumerics dei profili elettroforetici restituisce il dendrogramma in Figura 3. Sono stati identificati due cluster contenenti isolati fra loro correlati con un grado di similitudine superiore all 80%. Il cluster A comprende isolati italiani (similitudine pari a Tabella 6 - Composizione ribogruppi PvuII 1513-S-1 e PvuII 1513-S-4. Ribogruppo PvuII Ribogruppo PvuII 1513-S-1 1513-S-4 (tot isolati=12) (tot isolati=18) IT ST1 n 3/3 ceppi n 0/3 ceppi IT ST2 n 2/2 ceppi n 0/2 ceppi IT ST3 n 7/7 ceppi n 0/7 ceppi G ST1 n 0/ 13ceppi n 12/13ceppi G ST2 n 0/6 ceppi n 6/6 ceppi Figura 1 - Dendrogramma comprendente i 94 isolati di P. fluorescens ottenuto a seguito di restrizione enzimatica mediante ribotipizzazione automatica, enzima EcoRI. Nella prima colonna è riportato il codice assegnato a ciascun stabilimento produttivo; nella seconda colonna è riportata la colorazione dei campioni di mozzarella; nella terza colonna è riportata l assegnazione ai diversi ribogruppi; nella quarta colonna è riportato il numero arbitrario progressivo assegnato a ciascun stabilimento.
C. Nogarol et al. Large Animal Review 2013; 19: 115-121 119 Figura 2 - Dendrogramma comprendente i 36 isolati di P. fluorescens ottenuto a seguito di restrizione enzimatica mediante ribotipizzazione automatica, enzima PvuII. Nella prima colonna è riportato il numero arbitrario progressivo assegnato a ciascun stabilimento; nella seconda colonna è riportata la presenza o assenza di colorazione dei campioni di mozzarella; nella terza colonna è riportato il codice assegnato a ciascuno stabilimento produttivo; nella quarta colonna è riportata l assegnazione ai diversi ribogruppi. Tabella 7 - Composizione pulsotipi P13 e P19. IT ST1 Pulsotipo P13 (tot isolati=20) n 1 isolato 82,2%) provenienti dai tre diversi stabilimenti precedentemente indicati e un solo isolato tedesco (Tab. 7). Il cluster B, invece, comprende isolati con grado di similitudine pari a 83,3%, tutti derivanti dai due stabilimenti tedeschi ad eccezione di un solo isolato proveniente da uno stabilimento italiano. L elevato numero di pulsotipi riscontrato sottolinea l elevata variabilità genetica di questa specie. DISCUSSIONE Pulsotipo P19 (tot isolati=5) IT ST2 n 1 isolato n 1 isolato IT ST3 n 18 isolati n 3 isolati G ST1 n 1 isolato Le tecniche di caratterizzazione genotipica dei microrganismi si pongono l obiettivo di stabilire la correlazione genetica tra isolati microbici provenienti da diversi substrati e in tempi differenti, consentendo di mappare sia a livello temporale che spaziale questi microrganismi. A tale scopo risulta di fondamentale importanza l utilizzo di tecniche di tipizzazione molecolare, come la ribotipizzazione e la PFGE, che permettono attraverso il confronto dei pattern di discriminare le differenze tra ceppi batterici appartenenti alla stessa specie. Inoltre, nell ambito di indagini finalizzate alla valutazione di una possibile correlazione tra ceppo batterico ed espressione di una specifica capacità metabolica, risulta di fondamentale importanza identificare la tipologia di tecnica in grado di mettere in evidenza, se possibile, quelle differenze genotipiche direttamente correlabili all espressione di definite caratteristiche fenotipiche. Tale approccio è stato applicato nel presente lavoro per verificare un eventuale associazione dei ribogruppi e/o pulsotipi alla collocazione geografica e alla capacità o meno di produrre colorazione anomala. È necessario puntualizzare, ai fini della discussione dei risultati ottenuti, che le due metodiche biomolecolari impiegate possiedono un potere discriminatorio diverso. La ribotipizzazione, poiché basata sull analisi di restrizione delle regioni conservate degli operoni codificanti rrna, presenta teoricamente un potere discriminatorio minore rispetto alla PFGE, metodo che analizzando l intero genoma batterico, consente di ottenere informazioni a maggiore risoluzio-
120 Caratterizzazione molecolare mediante elettroforesi in campo pulsato (PFGE) e riboprinting di isolati di Pseudomonas fluorescens Figura 3 - Dendrogramma comprendente i 94 isolati di P. fluorescens ottenuto a seguito di restrizione enzimatica mediante PFGE: nella prima colonna è riportata la colorazione dei campioni di mozzarella; nella seconda colonna è riportato il codice assegnato a ciascun stabilimento produttivo; nella terza colonna è riportato il numero arbitrario progressivo assegnato a ciascuno stabilimento. ne. Nel presente lavoro il maggiore potere discriminatorio della PFGE è stato confermato dall ottenimento di un numero maggiore di pulsotipi (n=44) rispetto al numero di ribogruppi (n=6). Tuttavia, considerando geneticamente correlati solo gli isolati con similitudine maggiore all 80%, è possibile evidenziare solo due cluster contenenti isolati geneticamente correlati (A e B, Figura 3). Confrontando la composizione dei due cluster A e B e quella dei due ribogruppi a numerosità maggiore (restrizione con PvuII), è possibile evidenziare la presenza degli stessi isolati. Seppure questi risultati siano fra loro concordi e sovrapponibili, non permettono di ipotizzare quale sia stato il punto d origine della contaminazione. L analisi dei dendrogrammi ottenuti (Figure 1, 2 e 3) conferma le diversità genetiche fra isolati appartenenti alla stessa specie, evidenziando la correlazione genetica esclusivamente tra isolati provenienti da una stessa area geografica (Italia, cluster A e Germania, cluster B). Tale risultato consente una ipotizzabile discriminazione genetica utile in futuro per studi sulla diffusione del batterio nelle due grandi aree geografiche di interesse. Per quanto riguarda la capacità alterante, i dati ottenuti non permettono di correlare tale caratteristica fenotipica con la suddivisione in ribogruppi e/o pulsotipi: all interno di ciascuna suddivisione rientrano isolati provenienti da matrici conformi e non.
C. Nogarol et al. Large Animal Review 2013; 19: 115-121 121 CONCLUSIONI Entrambi i metodi hanno consentito di caratterizzare gli isolati di Pseudomonas fluorescens derivanti da alcuni dei prodotti lattiero-caseari coinvolti nell evento mediatico mozzarelle blu. La molteplicità di cloni emersa dalle indagini analitiche sottolinea l elevata variabilità della specie fluorescens escludendo, in questo caso, sia cross-contaminazioni tra stabilimenti produttivi italiani e tedeschi, che la massiva diffusione, grazie a condizioni ambientali favorevoli, di un particolare ceppo. Si può dunque affermare che dietro al fenomeno mozzarelle blu, che ha creato preoccupazione fra i cittadini, assumendo un forte impatto sulla percezione del livello di sicurezza da parte del consumatore, non sia presente alcuna inusuale e massiva diffusione di P. fluorescens. In generale Pseudomonas fluorescens non è dotata di particolare virulenza e non costituisce un serio pericolo per la salute dei consumatori; tali microrganismi, essendo contaminanti ambientali, potrebbero essere considerati tra i criteri di igiene di processo (attualmente non rientrano tra quelli previsti dal Reg. (CE) n. 2073/2005). Tuttavia ceppi cromogeni di P. fluorescens possono rendere l alimento inadatto al consumo umano e quindi, in base all articolo 14 comma 5 del Reg. (CE) n. 178/2002, passibile di ritiro dal mercato. Ad oggi, non sono ancora chiare le eventuali implicazioni di P. fluorescens in infezioni secondarie ed in soggetti immunocompromessi. Le indagini analitiche effettuate consentono di considerare l accaduto una problematica di esclusivo interesse produttivo, gestibile dalle aziende grazie all impiego di adeguati piani di autocontrollo. I risultati ottenuti sembrerebbero sostenere l ipotesi di una normale circolazione di diversi ceppi di P. fluorescens a livello ambientale e/o negli impianti produttivi, escludendo l ipotesi della presenza di un focolaio epidemico. PFGE and automated riboprinting methods for molecular characterization of Pseudomonas fluorescens isolates involved in the blue-mozzarella event SUMMARY Introduction - Since June 2010, an amazing high number of mozzarella cheese, produced in Italian and German plants, caused complaints in Italian consumers due to their unusual blue colour. The samples resulted positive for Pseudomonas fluorescens, psychrotrophic microorganisms, classified as ubiquitous in nature, isolated from soil, water, and vegetation. These species are particularly worrying for dairy industry as they could enter in processed dairy products through postpasteurization contamination in the milk processing plant; moreover the temperature of transport and distribution are considered permissive for the growth of these organisms. Aim - The aim of this study was the molecular characterization of P. fluorescens isolates with two different molecular techniques, in order to evaluate the genetic correlation between isolates and eventually the contamination source. Material and methods - 94 isolates of P. fluorescens, deriving from food microbiological laboratories of Italian network of Istituti Zooprofilattici Sperimentali, were collected between June 2010 and July 2011. The two molecular techniques analyze different portion of DNA: PFGE restriction endonuclease digestion was conducted on the whole genome of isolates with a rare-cutting enzymes SpeI, whereas automated riboprinting was conducted with two enzymes, EcoRI and PvuII on locus coding for rrna operons. Results and discussion - PFGE analysis gave 44 different pulsotypes, while riboprinting with EcoRI gave 6 different ribogroups; the second restriction, operated with PvuII, gave other 7 ribogroups. All the restriction profiles were analysed with BioNumerics software, resulting in three different phylogenetic trees. Applying appropriate criteria of analysis, it was possible to evidence two different cluster of isolates, one including Italian isolates and the other including German ones. Conclusions - Our results demonstrate that the blue-mozzarella event was not correlated to an unusual spread of one P. fluorescens strain diffusion, underlining the high genetic variability of 94 P. fluorescens isolates, pointed out with both molecular methods. KEY WORDS Pseudomonas fluorescens, PFGE, automated riboprinting, mozzarella cheese. Bibliografia 1. De Jonghe V., Coorevits A., Van Hoorde K., Messens W., Van Landschoot A., De Vos P., Heyndrickx M. 2011. Influence of Storage Conditions on the Growth of Pseudomonas Species in Refrigerated Raw Milk. Appl. Environ. Microbiol., 77 (2): 460-470. 2. Peix A., Ramìrez-Bahena M.H., Velàzquez E. 2009. Historical evolution and current status of the taxonomy of genus Pseudomonas Inf. Genet. and Evol. (2009) 9: 1132-1147. 3. Palleroni J., Ballard R.W., Erika Ralston and Doudoroff. 1972. Deoxyribonucleic acid homologies among some Pseudomonas species. J. of Bacter.; p.1-11. 4. Mayer J.M. and Abdallah M.A. 1978. 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