MECCANISMI D AZIONE DELLE ESPOSIZIONI AMBIENTALI ED OCCUPAZIONALI A CAMPI MAGNETICI ELF: VALUTAZIONE DELLE HSP IN PBL DI SOGGETTI ESPOSTI

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1 MECCANISMI D AZIONE DELLE ESPOSIZIONI AMBIENTALI ED OCCUPAZIONALI A CAMPI MAGNETICI ELF: VALUTAZIONE DELLE HSP IN PBL DI SOGGETTI ESPOSTI

2 HEAT SHOCK PROTEINS (HSP70): SONO PROTEINE COINVOLTE NELLA RISPOSTA BIOLOGICA AGLI STRESS TERMICI (Young,1996) COMPRENDONO NUMEROSE PROTEINE ALTAMENTE CONSERVATE E MOLTO ABBONDANTI IN NATURA COINVOLTE IN UN AMPIA GAMMA DI FUNZIONI TRA CUI LA REAZIONE A STIMOLI STRESSANTI QUALI LA PRIVAZIONE DEI NUTRIENTI, RADICALI DELL OSSIGENO E INFEZIONI HANNO ATTIVITA DI CHAPERONES OLTRE A REGOLARE LO STATO DI OSSIDO RIDUZIONE DELLA CELLULA E A REGOLARE IL RICAMBIO DELLE PROTEINE L IMPORTANZA FISIOLOGICA DELLE HSP RISIEDE NELLA LORO CAPACITA DI ASSOCIARSI CON ALTRE PROTEINE MODIFICANDONE IL DESTINO E LA FUNZIONE (Feder e Hofmann, 1999)

3 STUDI SU ANIMALI: I CAMPI ELF, APPLICATI PER TEMPI ED INTENSITA APPROPRIATI, SONO IN GRADO DI AUMENTARE L ESPRESSIONE DI HSP70 E HSP90 NEGLI IMMUNOCITI DI M.galloprovincialis (Gobba et al, 2002; Ottaviani et al, 2002) ESPERIMENTI CONDOTTI SUL MOLLUSCO BIVALVE M.galloprovincialis INDICANO COME CAMPI MAGNETICI A FREQUENZA ESTREMAMENTE BASSA POSSANO INFLUENZARE SIGNIFICATIVAMENTE L ESPRESSIONE DI MOLECOLE DELLA FAMIGLIA HSP, IN PARTICOLAR MODO DELLE HSP70 (Malagoli et al, 2004) L INDUZIONE INDOTTA DAGLI ELF MOSTRA UN ANDAMENTO CORRELABILE ALL INTENSITA DEL CAMPO MAGNETICO PER UNA RANGE DI LIVELLI DI ESPOSIZIONE SPERIMENTALE COMPRESO TRA CIRCA 200 E 800 ut

4 SCOPO DELLO STUDIO STUDIARE L ESPRESSIONE L DELLE HSP NEI LEUCOCITI DI SANGUE PERIFERICO (PBL) RACCOLTI DA SOGGETTI ESPOSTI A VARI LIVELLI DI ELF

5 MATERIALI E METODI VALUTAZIONE DELL ESPRESSIONE ESPRESSIONE DELLE HSP SONO STATI ANALIZZATI 58 CAMPIONI DI SOSPENSIONE LINFOCITIARIA OGNI CAMPIONE E E STATO CENTRIFUGATO AL FINE DI SEPARARE LE CELLULE DALLA SOSPENSIONE SALINA IN CUI GIUNGEVANO L ESTRAZIONE CONTEMPORANEA DI RNA E PROTEINE E E STATA EFFETTUATA CON UNA SOLUZIONE COMMERCIALE (TRIREAGENT, Sigma, St Louis,, USA) LA QUALITA DEL MATERIALE ESTRATTO E E STATA VALUTATA MEDIANTE SPETTROFOTOMETRIA TUTTI I CAMPIONI SONO STATI SOTTOPOSTI A RETROTRASCRIZIONE PER LA SUCCESSIVA AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR

6 TUTTI I CAMPIONI SONO STATI NORMALIZZATI RISPETTO ALL ESPRESSIONE DEL UN GENE housekeeping GAPDH (gliceraldeide-3- fosfato deidrogenasi) AL TERMINE DI QUESTA FASE TUTTAVIA, 20 CAMPIONI SONO STATI SCARTATI PER QUANTITA RELATIVAMENTE SCARSA DI RNA IN RAGIONE DEI RISULTATI OTTENUTI E DELLA QUANTITA DI MATERIALE A DISPOSIZIONE, L INDAGINE L MEDIANTE RT-PCR E E STATA CIRCOSCRITTA ALLE PIU SIGNIFICATIVE HSP70 L ANALISI SEMIQUANTITATIVA DELL ESPRESSIONE DELLE HSP E E STATA OTTENUTA MEDIANTE IL SOFTWARE DELLO STRUMENTO GelDoc (BIO- RAD, USA) CHE PERMETTE DI VALUTARE L ENTITAL ENTITA DI UNA POSITIVITA BASANDOSI SULL INTENSITA DI SEGNALE DI STANDARD INTRODOTTI DALL OPERATORE

7 CONTEMPORANEAMENTE E E STATA CONDOTTA UN INDAGINE MEDIANTE IMMUNOBLOT L ESTRATTO PROTEICO DEI LINFOCITI E E STATO SOTTOPOSTO A DOSAGGIO ELETTROFORETICO IN CONDIZIONI DENATURANTI (SDS- PAGE) SEGUITO DALLA COLORAZIONE DI COMASSIE IL PEPTIDE housekeeping SCELTO E E STATO LA β - TUBULINA DOPO NORMALIZZAZIONE I DATI SONO STATI ACQUISITI COME IN PRECEDENZA E QUINDI ANALIZZATI IN MODO SEMIQUANTITATIVO GLI IMMUNOBLOT SONO STATI ESEGUITI VERSO LE HSP70, 90 E 27

8 RISULTATI I LAVORATORI SONO STATI RAGGRUPPATI IN 2 GRUPPI UTILIZZANDO UN CUT- OFF DI O,2 µt T SULLA BASE DI PRECEDENTI RISULTATI EPIDEMIOLOGICI CHE SUGGERIVANO UN AUMENTO DEL RISCHIO RELATIVO PER ALCUNI EFFETTI CRONICI SOPRA QUESTO LIVELLO (Feychting e Ahlbom 1993, Floderus et al. 1996) BASSA ESPOSIZIONE ( 0,2 µt) ESPOSIZIONE MAGGIORE (> 0,2 µt) E STATO POI SELEZIONATO UN SOTTOGRUPPO DI LAVORATORI A PIU ALTA ESPOSIZIONE PIU ALTA ESPOSIZIONE ( 1 µt)

9 TWA VALORE MEDIO DI ESPRESSIONE 0,2 µt 2,24±3,71 > 0,2 µt 1,36 ±2,28 TWA VALORE MEDIO DI ESPRESSIONE 0,2 µt 2,24±3,71 1µT 3,08 ±5,57

10 VALORE MEDIO DELL ESPRESSIONE HSP70 IN SOGGETTI CON ESPOSIZIONE 0,2 µt T E > 0,2 µt 2,5 VALORE MEDIO DI ESPRESSIONE 2 1,5 1 0,5 0 TWA<=0,2 TWA>0,2 Significativita della differenza: p= n.s.

11 VALORE MEDIO DELL ESPRESSIONE HSP70 IN SOGGETTI CON ESPOSIZIONE 0,2 µt E 1 µt 3,5 3 VALORE MEDIO DI ESPRESSIONE 2,5 2 1,5 1 0,5 0 TWA<=0,2 TWA>=1 Significativita della differenza: p= n.s.

12 UN ULTERIORE ULTERIORE SOTTOCLASSIFICAZIONE E E STATA COMPIUTA PER DISTINGUERE L ESPRESSIONE L DELLE HSP70 DOPO RT- PCR, IN FUNZIONE DELL ESPRESSIONE DEL GENE housekeeping GAPDH I GRUPPI OTTENUTI SONO STATI COSI DENOMINATI: SOTTO MEDIA MEDIA SOPRA LA MEDIA

13 TWA SOTTO MEDIA (N soggetti) MEDIA (N soggetti) SOPRA MEDIA (N soggetti) 0,2 µt > 0,2 µt µt 0 9 6

14 LIVELLO DI ESPRESSIONE DI HSP IN SOGGETTI ESPOSTI A LIVELLI TWA 0,2 µt T, > 0,2 µt T e 1 µt N Soggetti sotto media HSP media sopra media TWA>0,2 TWA 0,2 TWA 1 Significativita della differenza: p= n.s.

15 RISULTATI L ANALISI DEI RISULTATI OTTENUTI MEDIANTE RT-PCR CONSENTE DI ESCLUDERE UNA QUALUNQUE RELAZIONE EVIDENTE FRA INTENSITA DELL ESPOSIZIONE ESPOSIZIONE E LIVELLO DELL ESPRESSIONE ESPRESSIONE DI HSP70 I LINFOCITI PRESENTANO UN AMPIA VARIABILITA INDIVIDUALE IN TERMINI DI ESPRESSIONE DELLE HSP70, MA NON SI OSSERVA CORRISPONDENZA FRA ENTITA DELL ESPOSIZIONE ESPOSIZIONE E LIVELLO DI ESPRESSIONE DELLE HSP70

16 QUANTO OSSERVATO MEDIANTE ESPERIMENTI DI RT-PCR PER LE HSP70 E E SOSTANZIALMENTE CONFERMATO DAI DATI OTTENUTI MEDIANTE IMMUNOBLOT L ETEROGENEITA IN TERMINI DI LIVELLI DI ESPRESSIONE APPARE ESSERE FORTEMENTE MITIGATA IN SEDE DI TRADUZIONE LA MAGGIOR PARTE DEI CAMPIONI PRESENTA UN ESPRESSIONE BASSA O SCARSAMENTE RILEVABILE L ESPRESSIONE E E UGUALMENTE AL LIMITE DEL RILEVABILE, SIA PER HSP27 CHE 90, TANTO TRA GLI INDIVIDUI MAGGIORMENTE ESPOSTI QUANTO TRA QUELLI SOGGETTI AD ESPOSIZIONE MINIMA

17 DISCUSSIONE ESPOSIZIONI ALL INTENSITA INTENSITA MASSIMA NON CORRISPONDONO A LIVELLI PARTICOLARMENTE ELEVATI DI HSP70, COSI COME ESPOSIZIONI RELATIVAMENTE MODESTE POSSONO COMUNQUE CORRISPONDERE A LIVELLI ELEVATI DI HSP70 LE INTENSITA DEI CAMPI CUI I LAVORATORI SONO STATI ESPOSTI SONO INSUFFICIENTI A DETERMINARE UNO STRESS TALE DA INCREMENTARE SIGNIFICATIVAMENTE LA PRODUZIONE DI HSP LE HSP POSSONO ESSERE INFLUENZATE DA NUMEROSE ALTRE VARIABILI: LE ABITUDINI DEI SINGOLI INDIVIDUI POSSONO AVER MASCHERATO UN EVENTUALE LIEVE EFFETTO DEI CAMPI ELF

18 CONCLUSIONI I NOSTRI DATI NON CONSENTONO DI EVIDENZIARE ALCUNA SIGNIFICATIVA CORRELAZIONE TRA L INTENSITA DEI CAMPI MAGNETICI CUI ERANO ESPOSTI I SOGGETTI DELLO STUDIO E I LORO LIVELLI DI ESPRESSIONE DI HSP70 E 90 I LIVELLI DI ESPOSIZIONE A CAMPI ELF REGISTRATI NELLA NOSTRA INDAGINE NON SEMBRANO TALI DA ESSERE IN GRADO DI AUMENTARE SIGNIFICATIVAMENTE L ESPRESSIONE DI PROTEINE CORRELATE ALLO STRESS NEI LINFOCITI CIRCOLANTI DEI LAVORATORI ESPOSTI

19 N Soggetti sotto media HSP media sopra media TWA>0,2 TWA 0,2 TWA 1

20 ESPRESSIONE HSP E NUMERO DI SOGGETTI ESPOSTI A CAMPI 0,2 µt T, > 0,2 µt T e 1 µt N Soggetti sotto media HSP media sopra media TWA>2 TWA 0,2 TWA 1 Significativita della differenza: p= n.s.