Il controllo della fertilizzazione e la qualità embrionaria
FECONDAZIONE processo che porta alla fusione del patrimonio genetico materno e di quello paterno con la formazione di un nuovo individuo
La normale fecondazione avviene secondo una serie di eventi che si svolgono in tempi differenti per ogni ovocita. Payne et al., 1997
Eventi nel processo fecondazione: di aumento intracellulare del calcio esocitosi dei granuli corticali modificazione della ZP e blocco alla polispermia
Fattori coinvolgenti l esito delle tecniche di fecondazione assistita Infertilità Stimolazione ovarica Manipolazione Transfer Classificazione Condizioni di coltura
L osservazione viene eseguita all invertoscopio dopo 16-18 ore dall inseminazione CRITERI PRATICI Si valuta sia la presenza dei 2PN ravvicinati al centro dell ovocita con la configurazione dei nucleoli in num. ridotto e la presenza dei 2 PB; Per la FIVET si esegue prima la rimozione meccanica del cumulo ooforo e della corona radiata; Per l ICSI: osservazione diretta
Valutazione nella coltura in vitro
Valutazione della qualità dello zigote Scott & al, 2000 Timing: 16-18 ore post- inseminazione Parametri: - disposizione PN e nucleoli - aspetto citoplasma Halo - timing breakdown membrana dei PN (24-2626 h) Tesarik & Greco,1999 Timing: 12-20 ore post- inseminazione Parametri: - numero di nucleoli - disposizione dei nucleoli NUCLEOLI L asincronia nella formazione e nella polarizzazione può severamente compromettere lo sviluppo dell embrione e il suo impianto. Van Blerkom, 1990; Tesarik and Greco, 1999; Scottet al., 2000
Tesarik e Greco, 1999
S t a d i o LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA P r o n u c l e a r e 0 PN 2 PN 3 PN > PN
FERTILIZZAZIONE ANOMALA Presenza di un pronucleo (1pn): Rappresenta circa l 1% degli ovociti fertilizzati in vitro; Può risultare da un attivazione partenogenetica dell ovocita Può risultare da un asincronia nella formazione dei pronuclei; Può risultare da una singamia precoce
FERTILIZZAZIONE ANOMALA Presenza di tre pronuclei: Rappresenta circa il 5% degli ovociti fertilizzati in vitro; Può derivare dalla fertilizzazione di un ovocita con uno spermatozoo diploide; Può derivare dalla fertilizzazione di un ovocita con due spermatozoi.
FERTILIZZAZIONE ANOMALA Arresto del clivaggio allo stato di zigote dovuto ad un fallimento nell attivazione ovocitaria; dovuto a difetti nella struttura ovocitaria; dovuto a incorretta localizzazione del centrosoma spermatico.
Pattern 1 Pattern 2 Pattern 3
SVILUPPO EMBRIONALE L embrione si sviluppa per una continua successione di: Divisione citoplasmatica Divisione cellulare Il primo clivaggio è l unica divisione sincrona che porta alla formazione di due blastomeri uguali che contengono la stessa allocazione dei due poli animale e vegetale dell ovocita. Nel caso in cui essa si verifichi a 24 27h dall inseminazione, si parla di Early Cleavage
SVILUPPO EMBRIONALE Il secondo clivaggio è invece asincrono e associato ad una rotazione che porta alla formazione di un embrione a 4 cellule. Tutti i successivi clivaggi sono asincroni e avvengono sempre nello spazio delimitato dalla zona pellucida
Il criterio di valutazione della qualità embrionale è principalmente morfologico: N e grandezza dei blastomeri Assenza di frammentazioni Assenza di multinucleazioni
L embrione viene sempre osservato all invertoscopio e si esegue una classificazione Un ineguale clivaggio cellulare è un indicatore della qualità embrionaria e della sua capacità di sviluppo. Conseguenze: Ineguale distribuzione di mrna, mitocondri e organelli citoplasmatici tra le due cellule gemelle. Un embrione è considerato di buona qualità quando presenta 4 cellule in II giornata (36 36-50 h dall insemin.) e 6-8 cellule in III giornata (72 h dall insem.)
GRADO I Cellule di uguale grandezza Assenza di frammenti Ben espanse nello spazio perivitellino
GRADO I 10 20% frammenti
GRADO II Cellule di grandezza simile ma con una differenza non superiore al 20% tra l una e l altra 20 50% di frammentazione
GRADO III Cellule con una differenza nelle dimensioni dei blastomeri superiore al 20% tra l uno e l altro > 50% di frammentazione Basso numero di cellule rispetto a quelle attese
Il criterio principale di selezione embrionale si basa su valutazioni morfologiche: N e grandezza dei blastomeri Assenza di frammentazioni Assenza di multinucleazioni
Classificazione Descrizione Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Frammentazione minima Frammenti localizzati perifericamente allo PVS Piccoli frammenti sparsi tra le cellule o in tutto il PVS Grandi frammenti,blastomeri di differente misura Molti preembrioni contengono frammenti cellulari nello pvs per le continue modificazioni di forma e rottura dei blastomeri durante la loro divisione.
Il criterio principale di selezione embrionale si basa su valutazioni morfologiche: N e grandezza dei blastomeri Assenza di frammentazioni Assenza di multinucleazioni
Presenza di due o più nuclei nei blastomeri Presenti in circa il 30% di embrioni Multinucleazioni Assenza di citochine Cause Parziale frammentazione di nuclei Difetti nella migrazione dei cromosomi Since mulinucleation in early embryos may reflect gross chromosomal abnormalities or development of mosaic embryos, it is advisable not to replace embryos with MNB. Occasional transfers, however can be considered because defective embryos may sometimes develop normally. Balakier et al., Hum. Rep., 1997
P I T T I N G Desai et al, 2000
ASPETTO DEL CITOPLASMA La presenza di granulosità nel citoplasma pare non sia correlato con la morfologia dell embrione e quindi che non abbia impatto sulla percentuale di impianto (Rienzi et al. 2003).
Dal giorno +3... FASI DELLO SVILUPPO..Alla blastocisti
Giorno +4 : COMPATTAZIONE I singoli blastomeri non sono distinguibili Le cellule della morula compattata iniziano a polarizzarsi. Si vede l inizio della cavitazione
Giorno +5 : CAVITAZIONE ED ESPANSIONE Inizia la formazione del blastocele. L embrione aumenta di volume e la ZP si assottiglia. TE e ICM divengono identificabili.
Giorno +6 : ESPANSIONE Il volume del blastocele aumenta. La ZP si assottiglia. L embrione accresce il suo volume.
Giorno +6 / +7 : HATCHING L embrione continua ad aumentare di volume. Si crea una breccia nella ZP e inizia a fuoriuscire una porzione di TE. L embrione sguscia completamente dalla ZP e si rigonfia.
Prolungare la coltura in vitro fino al giorno +5 e trasferire gli embrioni a blastocisti non è una strategia che può migliorare i risultati di un programma di PMA.