La PMA in Laboratorio, il lavoro dell embriologo: ICSI e FIVET

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1 CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania La PMA in Laboratorio, il lavoro dell embriologo: ICSI e FIVET Dott.ssa Raffaella Cavallaro Dott.ssa Giovanna Tomasi

2 TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA Prelievo ovocitario Inseminazione in vitro Le tecniche di secondo livello sono quelle nelle quali la fecondazione tra gamete maschile e femminile avviene in sede extra corporea cioè in vitro. Coltura embrionale Embryo Transfer

3 FIVET o ICSI? FIVET Età della donna < 35 Motilità veloce e rettilinea > 80% Morfologia FN > 4% (Kruger s.c.) ICSI Età della donna > 35 Motilità veloce e rettilinea 0-50% Morfologia FN < 4% (Kruger s.c.)

4 Le Tecniche di PMA: FIVET Nella tecnica FIVET l incontro tra lo spermatozoo e l ovocita avviene in una goccia di terreno di coltura deposta sotto olio di paraffina. Il meccanismo di legame e di entrata dello spermatozoo è naturale e fisiologico. Sono ricreate in laboratorio le condizioni presenti nelle vie genitali femminili per consentire l incontro tra i gameti e la successiva fertilizzazione.

5 Le Tecniche di PMA: FIVET Il giorno del pick-up, il partner maschile produce un campione di liquido seminale che viene trattato in laboratorio con le stesse modalità dell inseminazione semplice. Una certa quota di spermatozoi mobili ottenuti vengono incubati in una piastra di coltura insieme agli ovociti prelevati. Dopo ore di incubazione si verifica l avvenuta fertilizzazione, cioè la formazione dello zigote dove si possono osservare i due pronuclei (quello maschile e femminile). Per poter osservare l avvenuta formazione degli zigoti, è necessario allontanare meccanicamente le cellule del cumulo ooforo dalla cellula uovo. Gli ovociti correttamente fecondati vengono mantenuti in coltura per altre ore (al Giorno 2 o Giorno 3) dall inseminazione, quindi gli embrioni vengono trasferiti in utero attraverso un catetere. Gli embrioni trasferiti al terzo giorno dovrebbero essere formati dalle 6 alle 8 cellule.

6 Le Tecniche di PMA: FIVET

7 2010 Nobel a Robert Edwards padre della Fecondazione In Vitro Louise Joy Brown (Oldham, 25 luglio 1978) è stata la prima persona al mondo concepita "in provetta" attraverso il metodo dellaf ertilizzazione in vitro. I suoi genitori, Lesley e John Brown, decisero di ricorrere alla fecondazione assistita (metodica sviluppata da Robert Geoffrey Edwards e Patrick Steptoe), dopo aver provato inutilmente a concepire per nove anni, a causa di un problema alle tube di Falloppio di Lesley. Sebbene i Brown sapessero che la procedura era sperimentale, i medici non dissero loro che fino al quel momento non era ancora nato nessun bambino attraverso quel metodo. Louise nacque alle 23:47 al Oldham General Hospital, attraverso un parto cesareo programmato. Alla nascita pesava 2,608 kg. La sua nascita fu ripresa su nastro. L assegnazione del premio Nobel 2010 per la Medicina, al biologo Robert Edwards, costituisce non solo un riconoscimento del prestigio di tutti i professionisti impegnati nelle attività collegate alla riproduzione assistita, ma soprattutto dimostra come oggi non sia più possibile ignorare gli straordinari progressi della scienza medica in questo campo.

8 Le Tecniche di PMA: ICSI INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION L inseminazione nella tecnica ICSI, a differenza della tecnica FIVET, prevede che l entrata dello spermatozoo all interno del citoplasma ovocitario avvenga con l aiuto di una micropipetta quindi meccanico. La tecnica prevede l uso di un micromanipolatore montato su un invertoscopio.

9 Le Tecniche di PMA: ICSI Nel 1992 Giampiero Palermo riportava su Lancet la prima gravidanza al mondo dopo microiniezione di uno spermatozoo direttamente all interno di un ovocita umano. INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION Gravi dispermie Presenza di anticorpi antispermatozoi (> 50%) Assenza di fertilizzazione dopo FIVET senza apparente motivo seminale Utilizzo di spermatozoi epididimali e/o testicolari (MESA/TESE) Uomini con disfunzioni eiaculatorie (paraplegici, eiaculazione retrograda) Pazienti che hanno subito chemio/radioterapia ed hanno la necessità di congelare il seme (allo scongelamento spesso i parametri seminali decadono) Globozoospermia, astenospermia grave Basso numero di ovociti da inseminare (?)

10 Le Tecniche di PMA: ICSI La tecnica prevede l uso di un micromanipolatore ad iniezione/aspirazione idraulica montato su un invertoscopio con contrasto di Hoffman e con diversi obiettivi. Il micromanipolatore comprende due zone, speculari l una rispetto l altra, dove sono montati: i joy-stick per i movimenti secondo gli assi x,y,z delle micropipette; gli iniettori, vere e proprie siringhe di precisione di cui: una serve al posizionamento dell ovocita tramite suzione, l altra all iniezione vera e propria dello spermatozoo all interno dell ovocita.

11 Le Tecniche di PMA: ICSI La tecnica prevede l uso di un micromanipolatore ad iniezione/aspirazione idraulica montato su un invertoscopio con contrasto di Hoffman e con diversi obiettivi. Il micromanipolatore comprende due zone, speculari l una rispetto l altra, dove sono montati: i joy-stick per i movimenti secondo gli assi x,y,z delle micropipette; gli iniettori, vere e proprie siringhe di precisione di cui: una serve al posizionamento dell ovocita tramite suzione, l altra all iniezione vera e propria dello spermatozoo all interno dell ovocita.

12 Le Tecniche di PMA: ICSI Holder per Micropipetta Holding Holder per Micropipetta ICSI Iniettori dx e sn Joystick x,y,z

13 Le Tecniche di PMA: ICSI Holding Ø est. 110 micron Ø int. 15 micron ICSI Ø est. 7 micron Ø int. 5 micron

14 CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania La PMA in Laboratorio, il lavoro dell embriologo: ICSI e FIVET Dott.ssa Raffaella Cavallaro Dott.ssa Giovanna Tomasi Selezione del gamete femminile per ICSI

15 Acquisizione della maturità Attivazione Fertilizzazione Ovocita competente Incremento della concentrazione di calcio intracellulare Produzione del glutatione Acquisizione della competenza per l esocitosi dei granuli corticali Ripresa della meiosi

16 Il gamete femminile Per definizione un ovocita di ottima qualità in grado di produrre un embrione a massima potenzialità di impianto ha le seguenti caratteristiche: Citoplasma incolore e uniforme nell aspetto Granulosità assente o moderata, comunque uniforme Nessuna inclusione Polarbody di dimensioni normali

17 Markers morfologici della qualità ovocitaria T. Ebner,2000 sc1 Score 1: ovoidal, smooth surface sc2 Score 2: ovoidal, rough surface sc3 Score 3: fragmented sc4 Score 4: Larger than normal First polar body morphology È un indicatore dell età post ovulatoria dell ovocita La morfologia del primo corpuscolo polare non correla con l assetto cromosomico dell ovocita Solo dimensioni del Polar Body

18 Markers morfologici della qualità ovocitaria Citoplasma Aspetto Consistenza Influenzano negativamnte lo sviluppo embrionale Developmental delay Impairment of implantation T. Ebner 2006

19 Markers morfologici della qualità ovocitaria Più alta percentuale di aneuploidie Granulosità del citoplasma Correla negativamente con pregnancy rate e implantation rate T. Ebner 2006

20 Markers morfologici della qualità ovocitaria Vacuoli Sono vescicole delimitate da membrana contenenti fluido praticamente identico al liquido contenuto nello spazio perivitellino. Possono comparire spontaneamente attorno al sito di estrusione del primo polar body Van Blerkom, 1990 Possono derivare da vescicole preesistenti derivanti dal reticolo endoplasmatico o dall apparato di Golgi El.Shafie et al., 2000 La presenza di vacuoli correla negativamente con la percentuale di fertilizzazione se il diametro è 14 μm La loro presenza negli ovociti MII varia dal 6% al 12% T. Ebner 2006 Ridotta probabilità che si sviluppi una blastocisti

21 Markers morfologici della qualità ovocitaria Aggregati di reticolo endoplasmatico liscio ser clustering Il meccanismo di formazione è ancora sconosciuto Ebner, 2006 Sono facilmente distinguibili dai vacuoli (B) perché non sono separati dal resto del citoplasma da una membrana Ebner, 2006 Aumentata sensibilità dei recettori per IP3 al Ca2+ Aumento dei depositi di calcio intracellulare Cambiamento conformazionale del ser Otsuki J et al. Hum. Reprod. 2004;19:

22 Markers morfologici della qualità ovocitaria Otsuki J et al. Hum. Reprod. 2004;19:

23 Markers morfologici della qualità ovocitaria Pregnancy rate Implantation rate Otsuki J et al. Hum. Reprod. 2004;19:

24 Markers morfologici della qualità ovocitaria Aggregati di reticolo endoplasmatico liscio ser clustering sindrome di Beckwith- Wiedemann La sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) è una malattia genetica rara (circa 1:17 000) alla cui base risiedono diversi tipi di alterazioni genetiche. Causa più frequente della sindrome è l'alterazione dell'imprinting di alcuni geni che risiedono sul braccio corto del cromosoma 11 (11p15.5), sebbene siano possibili altre cause come la disomia uniparentale o delezioni/inversioni del cromosoma 11. Il quadro clinico della BWS è caratterizzato da diversi sintomi quali macroglossia, macrosomia, ernia ombelicale, indentature del padiglione auricolare, ipoglicemia neonatale ed aumentato rischio di sviluppare neoplasie. Otsuki J et al. Hum. Reprod. 2004;19: Scartare ovociti con ser clustering Istanbul Consensus 2011

25 Markers morfologici della qualità ovocitaria Perivitelline space granularity La presenza di detriti nello spazio perivitelline influenza negativamente la fertilizzazione, il clivaggio embrionale e le percentuali di gravidanza. Esiste una correlazione tra la loro presenza e la somministrazione di elevate dosi di gonadotropine Possono essere residui di cellule follicolari (a) o provenire dalla matrice extra-cellulare (b). T. Ebner 2006 a b

26 Markers morfologici della qualità ovocitaria Fertilization Danneggiamento o assenza dello spindle Presenza di vacuoli Embryo Cleavage Danneggiamento o assenza dello spindle Primo Polar Body Frammentato Formazione della blastocisti Primo Polar Body Frammentato Presenza di vacuoli Consistenza del citoplasma Impianto ser Clustering Difetti della Zona Pellucida

27 Markers morfologici della qualità ovocitaria Abnormalities or perturbations in cytoplasmic structure or organizations I. Dark cytoplasm, when examined under a dissecting microscope. This is highly associated with aneuploidy II. III. IV. Extensive vesciculation, indicated by the presence of highly irregular and coarse appearing cytoplasm. Organelle and/or vesicle clustering, identified by the presence of a single dark mass, usually centrally located. This is often associated with fragmented, pyknotic and scattered chromosomes Organelle-free cytoplasm or partial cortical depletion of organelles: very few of these were aneuploid V. Intracellular necrosis, indicated by small membrane-limited vesicles containing dense inclusions VI. VII. A single massive accumulations of saccules of the smooth endoplasmic reticulum (ser), identified by the presence of a smooth, elliptical body of pronuclear dimensions. This associated with aneuploidy Vacuoles presumed to be of endocytotic origin. This is not associated with aneuploidy VIII. Zona Pellucida bilayered or excessively pigmented and thick. IX. Perivitelline debris X. Binovular oocyte XI. Refractile body XII. Fragmented PBI, overly large PB, overly small PB XIII. Severely misshapen oocyte L. Veeck, Cornell University NY (personal comunication to ML Papale 2008)

28 Markers morfologici della qualità ovocitaria ABNORMAL CYTOPLASM/ATRESIC PERIVITELLINE SPACE DEBRIS ABNORMAL CYTOPLASM/ATRESIC OVERLY LARGE PB REFRACTILE BODY ZONA PELLUCIDA

29 CRA Case Report Corona cells residual

30 MISSHAPEN OOCYTE

31 Octax ICSI Guard e OCTAX Eyeware L analisi della birifrangenza della zona pellucida prevede l utilizzo di un software che analizza l immagine polarizzata prodotta da un invertoscopio e la elabora al fine di valutare la composizione della zona pellucida. L immagine è ottenuta combinando luce verde e luce rossa high zona birefringence (HZB) low zona birefringence (LZB) M. Montag, 2008

32 Octax ICSI Guard e OCTAX Eyeware Gli embrioni derivati da ovociti HZB mostrano una migliore morfologia al DAY 3 Migliori condizioni di crescita follicolare e ottimale maturazione L integrità strutturale della ZP riflette un ottimale potenziale del citoplasma HZB LZB M. Montag, 2008

33 CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania La PMA in Laboratorio, il lavoro dell embriologo: ICSI e FIVET Dott.ssa Raffaella Cavallaro Dott.ssa Giovanna Tomasi Selezione del gamete maschile per ICSI

34 Il contributo paterno alla formazione dello zigote Spermatozoo Vettore di DNA Centriolo di origine paterna Attivazione dell ovocita Spermatozoi anormali possono drasticamente influenzare fertilizzazione, sviluppo embrionale, impianto e sviluppo fetale. Nuclear Cytoskeletal Organelle an abnormal nucleus in the spermatozoa influence embryo development Barroso G Sakkas D. 2008

35 Do spermatozoa and oocyte contribute equally to reproductive success? Proteine di segnale Fosfolipasi C per la ripresa della meiosi Rho Guanosina Trifosfatasi determina la polarità embrionale Spermatozoo Informazioni epigenetiche per il nuovo embrione portate da proteine, DNA e RNA dello spermatozoo Wu TF. 2007

36 Selezione dello spermatozoo per ICSI Selezione Morfologica Valutazione dell integrità del DNA

37 Sperm DNA damage Abnormal DNA packaging Apoptosi Stress ossidativo Difetti nella spermatogenesi Enzimi della riparazione del DNA non funzionanti Carrell DT.,2007

38 Sperm DNA damage Integrità del DNA Elevated age Smoking Environmental exposures Repeated IVF failure.

39 NUCLEAR VACUOLES IN HUMAN SPERM LNV Large Nuclear Vacuoles DNA Fragmentation Denatured DNA a) Normal nuclear shape + large nuclear vacuoles b) Normal nuclear shape and content c) Normal nuclear shape + small nuclear vacuoles Franco Jr J., 2008 Berkovitz A., 2006

40 CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania Dott.ssa Raffaella Cavallaro Dott.ssa Giovanna Tomasi Grazie per l attenzione