Le bovine hanno un potenziale riproduttivo largamente in eccesso di quello normalmente realizzato con i normali accoppiamenti.

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2 Le bovine hanno un potenziale riproduttivo largamente in eccesso di quello normalmente realizzato con i normali accoppiamenti. Due particolarità degli ovari: presenza di relativamente alto numero di follicoli primordiali crescita follicolare inizia subito dopo la nascita e permette di recuperare gameti fertili (oociti) da femmine prima della pubertà

3 Onde follicolari Aspirazione follicoli Oocyte pick up IVF

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7 Università degli Studi di Firenze EMBRYO - TRANSFER

8 Università degli Studi di Firenze ET nei bovini 1. Selezione della donatrice 2. Selezione delle riceventi 3. Superovulazione della donatrice 4. Sincronizzazione delle riceventi 5. Inseminazione della donatrice 6. Lavaggio dell utero 7. Valutazione degli embrioni 8. Trapianto degli embrioni nelle riceventi 9. Congelamento degli embrioni

9 Università degli Studi di Firenze 3. Superovulazione della donatrice Farmaci in grado di stimolare le ovaie della donatrice. 1. Individuazione inizio ciclo estrale 2. Al 12 giorno somministrazione intramuscolare o sottocutanea di FSH 3. Dal 3-4 giorno si somministrano anche analoghi sintetici di PGF2α 4. Dopo 48 ore compare il calore 5. Inseminazione

10 Università degli Studi di Firenze 4. Sincronizzazione delle riceventi Embrioni freschi : riceventi e donatrice allo stesso stadio del ciclo estrale al momento del prelievo degli embrioni Trattamento con prostaglandine Embrioni congelati : non necessario sincronizzare

11 Università degli Studi di Firenze 5. Inseminazione della donatrice Elevato numero di ovuli maturi 2-3 Inseminazioni Artificiali a distanza di 12 ore dalla comparsa del calore

12 Università degli Studi di Firenze 6. Lavaggio dell utero - Flushing Al 6-7 giorno dall IA, recupero degli embrioni (morule-blastocisti) presenti all interno delle corna uterine

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14 Università degli Studi di Firenze 1. Anestesia epidurale a livello del sacro 2. Inserimento del catetere a tre vie nel corno uterino 3. Gonfiaggio del palloncino per bloccare la fuoriuscita del liquido di lavaggio 4. Immissione del liquido di lavaggio 5. Via trans rettale si valuta il riempimento del corno uterino 6. Deflusso del liquido 7. Raccolta con filtraggio

15 Università degli Studi di Firenze 7. Valutazione degli embrioni Il contenuto del filtro viene trasferito in una capsula Petri La qualità è valutata in base alla rifrangenza della Membrana Pellucida ECCELLENTE BUONA MODESTA SCARSA PESSIMA Embrione perfetto Lievi imperfezioni Senza problemi gravi (es. taglia piccola) Parzialmente degenerato, variabilità dimensioni Fortemente degenerato, non fertilizzato

16 Università degli Studi di Firenze 8. Trapianto degli embrioni FRESCO CONGELATO Conservazione in paillettes da 0.25ml, in un liquido di coltura e imprigionato in due bolle d aria Sistema analogo alla IA L embrione viene depositato nel corno che presenta il CL Dopo 30 gg diagnosi di gravidanza

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18 Università degli Studi di Firenze 9. Congelamento degli embrioni Congelamento: aggiunta di glicerolo con formazione di cristalli molto piccoli che non rompono le membrane. Discesa lenta della T fino a -35 C e poi a -196 C (Azono liquido) per sempre RAPID FREEZING ULTRARAPID FREEZING Scongelamento: analogo al materiale seminale per la IA

19 Università degli Studi di Firenze Vantaggi 1. Più vitelli all anno da vacche geneticamente superiori 2. Selezione linea femminile, più rapido progresso genetico 3. Rapido scambio di materiale genetico tra Paesi 4. Conservazione di razze in via d estinzione Svantaggi 1. Costo elevato dei vitelli ottenuti 2. Variabilità individuale nella risposta ai trattamenti ormonali

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25 Sessaggio seme ed embrioni Idealmente la selezione del sesso dovrebbe essere effettuate prima della fecondazione Si deve quindi riuscire a differenziare spermatozoi portanti il cromosoma Y da quelli con X Solitamente il cromosoma Y è di dimensioni ridotte rispetto all X meno DNA

26 Sessaggio seme Metodo deve essere: capace di processare rapidamente un elevato numero di spermatozoi non compromettere le capacità fertilizzanti del seme cost-effective

27 Si lega alle regioni ricche in AT

28 Lo sperma viene diluito ( milioni di spermi in 2 ml) in un tampone appropriato per le diverse specie e incubato con il prodotto. Propidio di iodio si lega al fluoroforo penetra spermatozoi morti permette di rilevarli Dopo la marcatura gli spermatozoi sono immessi in pressione Si creano delle microgocce Il 5-10% di queste contiene un singolo gamete e sono quelle impiegate nel processo di selezione

29 Il tutto passa attraverso una luce laser che rileva la fluorescenza Le gocce contenenti i gameti X e Y sono marcati con una carica positiva o negativa, rispettivamente. Si hanno quindi due flussi separati quando passano tra due piatti ad alto voltaggio I gameti sono quindi conservati in un medium apposito (egg yolk-based extender)

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31 Un problema è l orientamento dei gameti rispetto al laser e al rilevatore Per questo motivo si usano due rilevatori di fluorescenza Il segnale della testa del gamete è registrato dal rilevatore a 90 C Il segnale dalla superficie piatta del gamete è registrato dal rilevatore a 0 C

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33 Si è raggiunto una resa del 70% con l impiego di un nuovo sistema di iniezione dei gameti nel rilevatore

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