LE BIOTECNOLOGIE DELLA RIPRODUZIONE NEGLI ANIMALI DA ALLEVAMENTO: RISULTATI E PROSPETTIVE

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1 LE BIOTECNOLOGIE DELLA RIPRODUZIONE NEGLI ANIMALI DA ALLEVAMENTO: RISULTATI E PROSPETTIVE CESARE GALLI Laboratorio di Tecnologie della Riproduzione LTR-CIZ, Ist. Sper. Ital. Lazzaro Spallanzani Via Porcellasco 7/F Cremona Dip. Clinico Veterinario Università di Bologna

2 Biotecnologie della riproduzione situazione attuale (presente) Inseminazione artificiale Superovulazione ed ET Produzione in vitro ed ET Sessaggio embrioni

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4 Attività mondiale degli embrioni prodotti in vivo nel 2004 Thibier,, IETS Newsletter, December 2005

5 Numero di embrioni prodotti in vitro e trasferiti nel 2004 Thibier,, IETS Newsletter, December 2005

6 Produzione di embrioni bovini nei principali paesi europei ( 04) PAESE IN VIVO IN VITRO Francia Germania Olanda Inghilterra Irlanda Italia Europa Dati European Embryo Transfer Society

7 Tecnologia in vitro maturazione ovaio raccolto al macello fecondazione coltura congelamento embrione congelato seme congelato capacitazione

8 Tecniche di recupero degli ovociti per produrre embrioni Produzione di massa (dopo macellazione in gruppi di donatrici) Salvataggio genetico (dopo macellazione, individualmente) Ovum pick up (dall animale vivo per via ecografica)

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16 Tipo di donatrice e previsione di produzione Donatrice trattamento prelievo frequenza n. embrioni ormonale per prelievo Vitella 2-3 mesi + chirurgico 1 volta 3 Vitella 6-12 mesi +/- transvaginale 1/2volte sett. 0,5-1 Manza fino al 3 - transvaginale bisettimanale 1-2 mese di gravid. Vacca al primo cal. - transvaginale bisettimanale 2-3 dopo il parto Vacca problema - transvaginale bisettimanale 2-3 Vacca fino al 4 - transvaginale bisettimanale 2-3 Mese di grav.

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18 Sessaggio embrioni Procedura Biopsia di alcune cellule dell embrione Ricerca del DNA specifico del cromosoma Y Entro 4 h è possibile avere il risultato Vantaggi Miglior utilizzo delle riceventi Riduzione dei costi di trapianto Solo vitelli del sesso desiderato

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21 PCR MULTIPLA PER LA DETERMINAZIONE DEL SESSO NELL EMBRIONE BOVINO CAMPIONI ctr-f ctr-m bianco 301 bp 216 bp F M F M F F Primers: Sequenze ripetitive specifiche del genoma bovino e del cromosoma Y bovino

22 Biotecnologie della riproduzione prospettive Sessaggio del seme Clonazione Transgenesi Cellule staminali Test di tossicità alternativi

23 Sessaggio del seme Sfrutta il diverso contenuto di DNA tra X e Y Riduzione della motilità durante le operazioni di sessaggio Quantitativi molto limitati Embrioni a sesso predeterminato Altre possibili tecniche

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25 CLONAZIONE Tecniche di clonazione Bisezione embrionale (splitting) Separazione dei blastomeri (4-8 cellule) Trasferimento nucleare 1. Cellule dell embrione precoce 2. Cellule somatiche fetali 3. Cellule somatiche adulte

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28 Tecnica di clonazione somatica ovaio linfociti ovocita maturo trasferimento di nucleo enucleazione attivazione riclonazione incubazione trasferimento ricevente vitello clonato

29 Storia recente della clonazione somatica Fetal cells Sheep (Wilmut et al 97, Snieke et al 97, Wells et al 98) Cattle (Cibelli et al, 98, Vignon et al 98, Zakhartchenko et al 98) Goat (Baguisi et al, 99) Mouse (Wakayama et al 99 Pig (Onishi et al 00) Mule (Woods et al 03) Rat (Zhou et al 03) Adult cells Sheep (Wilmut et al 97) Cattle (Wells et al 99, Galli et al 99) Mouse (Wakayama et al 98) Pig (Polejava et al 00) Cat (Shin et al 02) Rabbit (Chesné et al 02) Horse (Galli et al 03) Dog (Hwang et al 05)

30 Galileo 1999

31 Utilizzo della clonazione a scopi Bovini e bufali zootecnici Tori provati a seguito di decesso o per la monta naturale Vacche di straordinario valore genetico e produttivo Emergenze sanitarie Produzione di animali geneticamente modificati

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33 TRANSGENESI (animali geneticamente modificati) Modificazione genetica di cellule somatiche in laboratorio Trasferimento di nucleo (clonazione) per ottenere l animale dalla cellula correttamente modificata

34 Prospettiva della transgenesi nei grossi animali (1) Nella ricerca Genomica funzionale Creazione di modelli animali di malattie genetiche In campo zootecnico Resistenza alle malattie ( PrPs, mastiti) Aumento delle rese produttive (livelli di caseina elevati, inattivazione della miostatina)

35 Prospettiva della transgenesi nei grossi animali (2) In campo biomedico Produzione di tessuti o organi sicuri e compatibili con l uomo (xenorapianto) Produzione di farmaci complessi non ottenibili in batteri (fattori di crescita, anticorpi, albumina) Prodotti di origine animali destinati a particolari categorie di pazienti (nutriceutici)

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37 XENOME Engineering of the porcine genome for xenotransplantation studies in primates: a step towards clinical application Integrated Project 22 partners, granted 9,8 M 5 years project Coordinator: Università di Padova SIXTH FRAMEWORK PROGRAMME PRIORITY 6 Life Sciences, Genomics and Biotechnology for Health

38 Clonazione e cellule staminali Grossi animali (maiale, pecora) Terapia cellulare Modelli preclinici

39 Da: N.I.H. website

40 Fonti di cellule staminali embrionali Da: N.I.H.

41 Cellule staminali embrionali autologhe: : da dove derivano Da: N.I.H. website

42 Cellule del miocardio Cellule della cute Cellule nervose Cellule del fegato cellule del pancreas Cellule del sangue Coltura di cellule embrionali staminali Cellule muscolari Cellule della cartilagine Cellule dell osso

43 Le promesse delle cellule embrionali staminali Sviluppo di farmaci E di test di tossicità Cellule embrionali staminali Studio dello Sviluppo embrionale Cellule e tessuti per lo sviluppo di terapie Midollo osseo Cellula nervosa Cellula Cardiaca Cellula pancreatica

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45 Reproductive Toxicology Integrated Project 26 partners (9 states), granted 9 M kick-off: 7 04 Coordinators: Univ. Tübingen / ECVAM

46 Stima del numero di animali richiesti secondo la nuova regolamentazione Europea (REACH) (regulation, evaluation and authorisation of chemicals) Tossicità dello sviluppo altro Accumulo Carcinogenicità Sensibilizzazione cutanea Dosi ripetute a lungo termine Dosi ripetute a breve termine Tossicità subcronica Tossicità cellulare Mutagenicità Tossicita riproduttiva (due generazioni) Circa 21.7 milioni di animali saranno necessari per la tossicità dello sviluppo e riproduttiva se non vengono considerati test alternativi Test sugli animali e approcci alternativi per la valutazione del rischio nell ambito della nuova regolamentazione europea sulle sostanze chimiche Thomas Hoefer et al. Arch Tox.78; pp ; 2004

47 Conclusioni Le biotecnologie della riproduzione sono sempre più utilizzate e diffuse in tutto il mondo Oltre al campo agroindustriale ci sono prospettive nella ricerca e nel campo biomedico Lo sviluppo delle biotecnologie nel settore agroalimetare dipenderà da un cambio sostanziale di percezione negativa