LA FECONDAZIONE ARTIFICIALE NEL BUFALO Aspetti pratico-applicativi

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1 RegioneLombardia Direzione Generale Agricoltura Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani LA FECONDAZIONE ARTIFICIALE NEL BUFALO Aspetti pratico-applicativi QUADERNI DELLA RICERCA Marzo 2001

2 Progetto Regione Lombardia sulla Valorizzazione della inseminazione strumentale nella bufala in Lombardia Testo a cura di Andrea Galli (con la collaborazione di Donatella Balduzzi e Valeria Bornaghi)

3 Presentazione Può sembrare curioso che la Regione Lombardia si occupi anche dell allevamento bufalino, considerata la scarsa incidenza sul comparto zootecnico lombardo. Eppure tra gli allevamenti ubicati in Lombardia vi sono quelli di punta su base nazionale; i nostri allevatori incarnano una managerialità di alto livello, maturata dall esperienza con la bovina da latte. La Regione Lombardia ha condiviso l interesse espresso dai suoi allevatori di mettere a punto il know-how per lo sviluppo e la diffusione della pratica dell inseminazione strumentale che, consentendo la valutazione genetica dei tori, è la premessa indispensabile per l avvio di una selezione che consenta il miglioramento genetico della popolazione bufalina lombarda, e italiana in genere, nonché per introdurre il comparto nel mercato mondiale della genetica bufalina. E proprio da queste considerazioni di tipo strategico che la Regione Lombardia ha affidato all Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani, punto di eccellenza della ricerca nazionale nel campo della riproduzione animale, la realizzazione di un progetto di ricerca finalizzato alla definizione di una metodologia atta a sviluppare e diffondere l uso della inseminazione strumentale nell allevamento bufalino. Tale lavoro ha raggiunto l obiettivo di superare in buona parte le attuali difficoltà tecnico-ambientali, tipiche delle nostre latitudini, all uso della fecondazione artificiale nella bufala, quali la stagionalizzazione dei parti, la ridotta manifestazione dei calori, il lungo periodo interparto, che ne limitavano la affidabilità e che portavano la maggior parte degli allevatori ad utilizzare ancora la monta naturale. Un ulteriore risultato del lavoro svolto è questo opuscolo divulgativo, che potrà essere uno strumento di conoscenza e di lavoro per gli operatori del settore. Paolo Baccolo Direttore Generale D.G. Agricoltura, Regione Lombardia 1

4 Presentazione Premessa L'Inseminazione Strumentale rappresenta la più importante tecnologia riproduttiva attualmente adottata in zootecnia. Tramite l Inseminazione Strumentale e possibile il controllo delle patologie coitali, ma anche contribuire alla ottimizzazione della selezione genetica. Il controllo delle patologie coitali e evidente dal momento che l Inseminazione Strumentale consente di separare fisicamente il maschio dalla femmina, eliminando la possibilità di trasmissione delle patologie sessuali tramite l accoppiamento. La selezione genetica viene considerevolmente implementata in quanto l Inseminazione Strumentale consente di eseguire in un primo tempo le prove di progenie e poi di utilizzare massicciamente il seme congelato dei tori risultati miglioratori. Il bufalo (Bubalus bubalis) è fra i ruminanti allevati in Italia la specie con la minore applicazione della Inseminazione Strumentale, mentre nei paesi asiatici da almeno due decenni questa tecnica ha trovato una valida applicazione; e' anche vero tuttavia che la specie presenta delle caratteristiche riproduttive particolari che non hanno favorito la diffusione della Inseminazione Strumentale, quali: una variabile e ridotta manifestazione dei calori; una marcata stagionalità del ciclo estrale (con prevalenza per le stagioni autunnale ed invernale); un lungo periodo interparto; disordini riproduttivi femminili accentuati; una qualità del materiale seminale congelato non sempre soddisfacente. Questi aspetti sono importanti dal momento che la fecondazione può avvenire solamente se gli spermatozoi immessi in utero, tramite l Inseminazione Strumentale, raggiungono la zona di fecondazione (ampolla tubarica) al momento dell'ovulazione. Stante una adeguata qualità del materiale seminale, e' allora assolutamente essenziale che l Inseminazione Strumentale avvenga nel momento più idoneo, in modo tale da garantire che la progressione e la colonizzazione degli spermatozoi nell'apparato genitale femminile preceda l ovulazione. 2

5 I presupposti aziendali per l Inseminazione Strumentale Ènecessario precisare che le aziende impegnate ad usare l Inseminazione Strumentale devono organizzarsi in modo tale da ridurre al minimo i problemi specie-specifici sopra esposti, impegnandosi in una gestione della mandria bufalina che consenta il corretto rilievo dei calori e/o la loro sincronizzazione ed induzione. In particolare è necessario: alimentare giovani animali in modo tale da permettere il raggiungimento della pubertà nel più breve tempo possibile (incrementi giornalieri di circa 600 gr); organizzare almeno due turni al giorno (mattino presto e sera) di osservazione della mandria, al fine di individuare precocemente gli animali in calore; verificare, tramite l ausilio di un veterinario esperto, lo stato di salute degli animali, soprattutto per quanto concerne l apparato riproduttore; registrare accuratamente gli eventi aziendali in modo da disporre della storia di ogni animale. 3

6 La produzione di seme congelato L Inseminazione Strumentale si basa sull utilizzo di seme congelato ottenuto a seguito di un processo che prevede una serie di fasi (prelievo, diluizione, confezionamento, congelamento, conservazione). Il prelievo del materiale seminale dal toro bufalino viene effettuato impiegando la vagina artificiale che, semplificando, è costituita da una sorta di tubo di gomma rigida contenente una guaina che forma con il tubo di gomma un intercapedine contenente acqua calda (temperatura appena superiore a quella fisiologica) e che nella sua parte terminale è raccordata ad una provetta. Vagina artificiale pronta per l uso: è composta da un tubo esterno rigido e da una camicia interna in gomma morbida che viene inserita all interno della struttura rigida e rivoltata alle due estremità della stessa. Ad una estremità dello strumento si collega un raccordo in gomma collegato ad una provetta graduata in cui si raccoglierà l eiaculato. Il momento del prelievo. Utilizzando come supporto un altro animale si fa saltare il bufalo e tramite la vagina artificiale si effettua la raccolta del seme. Solitamente il bufalo viene fatto saltare due volte di seguito. Gli eiaculati, se di buona qualità, verranno entrambi utilizzati. 4

7 Il seme viene successivamente diluito, con appositi mestrui diluitori che lo preservano durante l abbassamento di temperatura, e confezionato in paillettes. Queste sono delle cannuccie di materiale plastico che contengono un quarto (paillette mini) o la metà (paillette media) di un centimetro cubo di seme diluito. Le paillettes quindi vengono congelate utilizzando possibilmente dei congelatori automatici programmabili che consentono di limitare i danni agli spermatozoi. Durante il congelamento, infatti, si possono verificare danni dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio all interno degli stessi spermatozoi o alla disidratazione delle cellule per perdita di acqua, per l aumentata concentrazione dei soluti dovuta al congelamento del mestruo diluitore. La conservazione delle paillettes congelate avviene in azoto liquido (alla temperatura di -196 C) in appositi contenitori criobiologici. La paillette è costituita da una cannuccia di materiale plastico che contiene un quarto (paillette mini) o la metà (paillette media) di un centimetro cubo di seme diluito. Essa presenta una lunghezza di 13,5 cm ed un diametro di 2 o 3mm. 5

8 La qualità del seme congelato e la fertilità La fertilità ottenibile dall uso del seme congelato dipende dal numero di spermatozoi progressivamente mobili dopo scongelamento (NSPM), fino al raggiungimento di un valore massimo oltre il quale non aumenta. Il numero (prudenziale) di spermi progressivamente mobili dopo scongelamento che consente di ottenere la massima fertilità nel bufalo è di circa otto milioni: poichè esistono però differenze di fertilità fra i bufali, anche il numero degli spermi progressivamente mobili da utilizzare nella Inseminazione Strumentale potrà variare in più o in meno. Fra il punto A e il punto B la correlazione fra qualità seminale (espressa come NSPM) e fertilità è massima; dal punto C invece questa correlazione si perde: anche aumentando il NSPM non aumenta la fertilità (da AMMAN, J. Andrology, 10, 89) NSPM in milioni Per determinare il numero di spermi progressivamente mobili dopo scongelamento è necessario determinare la concentrazione (numero di spermatozoi per paillette) e la motilità (percentuale di spermi che si muovono con determinate caratteristiche). Per misurare correttamente questi parametri qualitativi è necessario disporre di idonei strumenti (contatore elettronico di particelle per la determinazione della concentrazione ed analizzatore automatico d immagini per la motilità) e di personale qualificato. 6

9 Il contatore elettronico di particelle conta il numero di spermatozoi contenuti in un dato volume di seme aspirato del campione in esame. L analizzatore automatico di immagini vede gli spermi come oggetti digitalizzati dal computer collegato ad un microscopio. Una volta visti gli spermi, ne determina la traiettoria e la velocità, misurando in tal modo quanti si muovono con le caratteristiche predeterminate (tramite settaggio dello strumento). 7

10 Il contenitore criobiologico Il contenitore criobiologico usato per la conservazione delle paillettes in azoto liquido è composto da due involucri di alluminio, separati da una intercapedine sotto vuoto, contenente del materiale termoisolante. All'interno, in cestelli metallici, sono sistemati i bicchieri di plastica contenenti le paillettes. Sezione di un contenitore criobiologico: A = vuoto; B = vapori di azoto; C = azoto liquido; D = struttura per il fissaggio sul fondo dei cestelli metallici; E = cestello metallico (da LAING, Fertility and infertility in domestic animals, Bailliere Tindall, Londra). 8 Le due principali caratteristiche tecniche dei contenitori criobiologici sono l'autonomia operativa e il diametro dell'imboccatura del collo. La prima caratteristica (che dipende dal volume del contenitore e dal diametro dell imboccatura) è in relazione al tasso di evaporazione dell'azoto liquido in condizioni di operatività e determina il tempo che deve intercorrere fra due successivi rifornimenti di azoto liquido. La seconda caratteristica impone scelte di tipo gestionale, poiché con un diametro del collo più stretto ci sarà, a parità di altre condizioni, una più lunga autonomia operativa (diminuisce l'evaporazione di azoto), mentre con un diametro più grande risulta più comoda la manipolazione delle paillettes, con conseguente diminuzione dei pericoli derivanti da una prolungata permanenza delle paillettes a livello del collo del contenitore. Quest'ultimo aspetto è molto importante, infatti il seme congelato non deve essere stoccato a temperature superiori a -120 C, altrimenti incomincia a deteriorarsi. Pertanto le paillettes andranno tenute a livello del collo del contenitore il tempo strettamente necessario alla loro

11 manipolazione, poiché in questo punto la temperatura raggiunge -75 C. Inoltre le paillettes non dovranno essere esposte alla temperatura ambiente (durante gli spostamenti da un contenitore all'altro) per più di 10 secondi. Temperature rilevate nel collo del contenitore criobiologico (da SPELTA e CORBELLA, Tecniche di fecondazione artificiale, CLESAV, Milano). Nel caso in cui un operatore si accorgesse che il contenitore è rimasto senza azoto liquido, ma con presenza di vapori all'interno, dovrà immediatamente riempirlo di azoto liquido e dovrà fare analizzare alcune paillettes da un laboratorio specializzato, prima del loro utilizzo. Nel caso invece il contenitore risulti vuoto e privo di vapori al suo interno, il seme ivi contenuto andrà assolutamente eliminato. Risulta pertanto della massima importanza una precisa gestione, con tanto di cartelli promemoria bene in vista, dei rifornimenti di azoto liquido. Il contenitore è uno strumento delicato che deve essere maneggiato con cura evitando la vicinanza di fonti di calore. Va inoltre costantemente tenuto sotto controllo per evidenziare precocemente eventuali perdite di azoto che si manifestano con la formazione di ghiaccio o brina a livello del collo o della base dello stesso. 9

12 Le paillettes di seme congelato Come già menzionato esistono due differenti formati di paillettes: da 0,5 ml (paillettes medie) e da 0,25 ml (paillettes mini). Il numero di spermi contenuti dalle paillettes medie e mini sono identici (cambia solo il tasso di diluizione), pertanto, se correttamente conservate ed usate, la fertilità ottenibile dal loro uso in Inseminazione Strumentale è assolutamente identica. Le paillettes mini presentano il notevole vantaggio che, occupando un minor volume, consentono un loro più agevole stoccaggio nel contenitore criobiologico; di contro presentano una maggiore suscettibilità agli sbalzi termici. Sulle paillettes sono segnate varie indicazioni che è opportuno sapere interpretare; le principali sono: il nome del toro, la sua matricola, la partita di seme (espressa come data o come numero del giorno dall'inizio dell'anno) e il centro di produzione del seme. È molto importante che l'operatore di Inseminazione Strumentale registri questi dati dopo l'intervento, in modo tale da possedere tutte le indicazioni per risalire alle possibili cause degli eventuali insuccessi fecondativi ottenuti con una data partita di materiale seminale. 10

13 L'estro ed il momento dell inseminazione Il ciclo ovarico di una bufala è rappresentato nel seguente schema: In sintesi i follicoli ovarici maturano sotto la stimolazione dell ormone ipofisario FSH, aumentando la produzione degli ormoni ovarici Estrogeni. A maturazione il follicolo scoppia, stimolato dal picco dell ormone ipofisario LH, e rilascia un oocita che, a livello delle ampolle tubariche, potrà essere fecondato. Il follicolo dopo lo scoppio si trasforma in corpo luteo che produce l ormone Progesterone che consente, se fosse avvenuta la fecondazione, l eventuale mantenimento della gravidanza. Se l oocita non è stato fecondato, l utero produce l ormone Prostaglandina F 2α che determina la regressione del Corpo luteo, e la successiva caduta dei livelli di Progesterone consente la ripresa della maturazione follicolare con il completamento del ciclo. Si è spesso nominata la parola ormoni: questi non sono altro che sostanze prodotte da una ghiandola (come l ipofisi e le ovaie) che, immessi nel circolo sanguigno, presentano attività sugli organi bersaglio. L estro è quella particolare fase del ciclo estrale associata al completamento della maturazione dell oocita ed alla successiva ovulazione. Durante questo periodo si innalza il livello degli Estrogeni (determinato dalla maturazione del follicolo contenente l oocita), seguito dal picco dell LH (che determina la rottura del follicolo con la successiva espul- 11

14 sione dell oocita). In questa fase i ruminanti presentano solitamente una serie di sintomi clinici che consentono, tramite una accurata osservazione, di individuare le femmine in estro. La bufala presenta un estro non sempre clinicamente ben evidente, con durata molto variabile (da 15 a 25 ore). L ovulazione avviene circa ore dall'inizio dell'estro. I calori con durata di circa 30 ore si presentano simili a quelli della bovina. Schema delle manifestazioni estrali con calori di durata media (circa 30 ore). Studiando la progressione degli spermatozoi nell'apparato genitale femminile è stata evidenziata la necessità della presenza, di una popolazione di spermatozoi capacitati nell'ampolla tubarica, al momento dell'arrivo dell'oocita. Gli spermatozoi capacitati sono semplicemente degli spermatozoi che hanno subito, all interno dell apparato genitale femminile, una serie di modifiche che li rende fecondanti (gli spermatozoi appena eiaculati non sono ancora fecondanti!). Queste modifiche riguardano essenzialmente la membrana cellulare, ovvero quella membrana che riveste tutta la superficie degli spermatozoi e regola gli interscambi chimici con l ambiente circostante. Dopo la capacitazione, gli spermatozoi giunti in prossimità dell oocita ovulato (nell ampolla tubarica) effettueranno la reazione acrosomale perdendo il rivestimento anteriore della testa (con eliminazione degli enzimi necessari per la penetrazione dell uovo) ed uno di essi attraverserà il rivestimento esterno dell uovo (zona pellucida) e lo feconderà. 12

15 Gli spermatozoi hanno una vitalità complessiva nell'apparato genitale femminile che non supera probabilmente le 24 ore con il seme congelato; pertanto, al fine di assicurare un adeguato numero di cellule potenzialmente feconde, l'inseminazione Strumentale deve avvenire in tempi corretti. Un buon compromesso è quello di inseminare le bufale nella seconda metà del calore ma, per fare questo, bisogna sapere quando il calore è incominciato, ovvero bisogna saper rilevare (o indurre) l estro. Una corretta gestione della mandria è essenziale per agevolare l identificazione degli animali in calore. Tale identificazione avviene nel corso di almeno due osservazioni da effettuarsi al mattino presto ed alla sera. Possono essere di aiuto la presenza di un toro vasectomizzato esploratore o meglio l uso dei podometri. 13

16 Il rilievo dell estro Un allevatore dovrebbe dedicare almeno due momenti della giornata (meglio tre: primo mattino, pomeriggio e sera) a osservare le bufale che mostrano i segni del calore, di cui i più tangibili sono: perdita di muco filante dalla vulva; scavalcamento prima e accettazione dello scavalcamento da parte di altre femmine poi. Il primo segno estrale sarà maggiormente indicativo per bufale in stabulazione fissa, mentre il secondo per bufale in stabulazione libera. Bisogna però precisare che a volte la situazione non è chiara, dal momento che lo scavalcare le altre compagne non è sempre un comportamento caratteristico del periodo estrale, mentre perdite di muco vaginale con striature di sangue sono la conseguenza di piccole emorragie uterine avvenute dopo la fine del calore e pertanto non indicano un animale in calore bensì uno che il calore lo ha finito! Il classico segno clinico dell estro è rappresentato dalla fuoriuscita dalla rima vulvare di muco chiaro e filante, come quello rappresentato nella fotografia. Altra manifestazione estrale da considerare è la maggiore motilità dell'animale, registrabile però solo utilizzando il podometro, uno strumento che, applicato ad una zampa dell animale stesso, ne registra tutti i movimenti. 14

17 Podometro applicato ad un arto di una bufala. Con questo strumento è possibile registrare i movimenti dell animale ed identificare gli animali in calore, poichè questi presentano un aumento della loro motilità. Le manifestazioni comportamentali dell estro sono determinate dagli estrogeni (ormoni steroidei di origine ovarica) che, come già detto, aumentano marcatamente durante questa fase del ciclo estrale. 15

18 La sincronizzazione e l induzione dei calori Dal momento che l individuazione degli animali in calore non sempre è agevole, sono stati sviluppati vari sistemi per sincronizzare l attività ovarica fra differenti bufale ed indurne il calore. In questo modo è possibile disporre di una serie di animali in calore contemporaneamente, con notevoli vantaggi per la gestione della mandria. I due metodi principali per sincronizzare ed indurre il calore sono quelli che prevedono l uso della Prostaglandina F 2α e del PRID. La Prostaglandina F 2α (PGF 2α ) è l ormone naturalmente prodotto dall utero che determina la regressione del corpo luteo (CL). Pertanto, somministrando questo ormone due volte a distanza di 11 giorni, è possibile stimolare artificialmente l involuzione del corpo luteo in tutte le bufale trattate, determinandone pertanto la successiva sincrona entrata in calore. I due trattamenti sono necessari poichè le bufale che al primo trattamento non avevano un corpo luteo (la PGF 2α in questi casi non ha effetti) lo avranno necessariamente dopo 11 giorni, insieme alle bufale che invece lo presentavano già al primo trattamento. Bufala A Bufala B 1 trattamento 2 trattamento (giorno 0) (dopo 11 giorni) Corpo luteo Regressione CL, Estro, Ovulazione Corpo luteo Assenza Corpo luteo (Estro/Ovulazione) Corpo luteo È naturalmente possibile non effettuare i due interventi su tutte le bufale ed inseminare quelle che presentano sintomi di calore e trattare la seconda volta le altre! Il trattamento di sincronizzazione ed induzione dei calori che ha ultimamente riscosso i maggiori favori, dati gli ottimi risultati ottenuti, prevede l utilizzo del PRID (spirale composta da Progesterone ed Estradiolo benzoato che consente, durante la sua permanenza in vagina, di simulare l attività di un corpo luteo) e del PMSG (ormone ad azione follicolo stimolante). Tale trattamento è così definito: inserimento in vagina del PRID (che simula la presenza del corpo luteo); estrazione dello stesso dopo 12 giorni (che simula la degenerazione del corpo luteo); iniezione di 1000 UI di PMSG (che stimola l ovulazione); doppia inseminazione dopo 48 e 72 ore dall estrazione del PRID usando ogni volta una paillette (media o mini) del toro bufalino d interesse. Si rammenta che l inserimento e l estrazione del PRID, nonchè la somministrazione di PMSG, come ogni altro trattamento farmacologico, sono attività di specifica competenza veterinaria. 16

19 La sincronizzazione e l induzione dei calori funzionano molto bene con bufale adulte, mentre nelle manze i risultati non sono sempre adeguati. Ciò è spiegabile dal fatto che, durante il periodo puberale, l attività ovarica non è sempre normale in quanto, dai primi follicoli ovarici, possono formarsi corpi lutei non completamente funzionanti. Di conseguenza, in caso di calore naturale, si presentano calori anovulatori o con ridotta fertilità mentre, in caso di calore indotto, la risposta delle ovaie al trattamento farmacologico risulta imprevedibile. Un sistema per superare i problemi di rilievo dei calori è rappresentato dalla sincronizzazione e dall induzione dell estro. Il PRID è attualmente il sistema più utilizzato a tale scopo. Il PRID è costituito da una spirale impregnata di Progesterone con abbinata una capsula di Estradiolo benzoato. La cordicina attaccata al PRID può essere utilizzata per la sua estrazione dopo dodici giorni (poiché spesso viene persa, alcuni preferiscono rimuoverla prima dell inserimento del PRID). 17

20 Lo strumentario per introdurre il PRID è rappresentato dallo speculum (cilindro esterno metallico) da inserire in vagina, nel quale viene inserito il PRID. Il cilindro in plastica viene usato come stantuffo per spingere il PRID dal cilindro metallico in vagina. In azienda deve essere sempre disponibile una soluzione disinfettante per assicurare la corretta igiene dello strumentario. Gli animali devono essere gestiti in modo tale da facilitare le operazioni del veterinario e nel contempo salvaguardarne la incolumità. 18

21 Prima dell uso lo speculum viene accuratamente lubrificato. Il PRID viene inserito nello speculum. Il PRID, inserito nello speculum, è pronto per l inserimento in vagina. 19

22 Dopo aver pulito i genitali esterni della femmina ed aver verificato che trattasi di un animale non gravido, si dilata la rima vulvare per favorire l inserimento dello speculum in vagina. Una volta inserito lo speculum in vagina, tramite lo stantuffo in plastica, si inserisce il PRID in vagina. Dopo l uso lo strumentario viene accuratamente disinfettato. 20

23 La rimozione del PRID dopo 12 giorni avviene tramite esplorazione vaginale con ausilio dell altra mano introdotta in retto. Il PRID viene estratto (si simula la degenerazione del corpo luteo). In questo modo gli animali interessati all operazione presentano un ciclo ovarico sincronizzato. Per indurre il calore viene effettuata, dopo l estrazione del PRID, una iniezione di PMSG (ormone ad azione follicolo stimolante). La differenza sostanziale fra i due tipi di trattamenti di sincronizzazione ed induzione dell estro è che con la PGF 2α è necessario avere un animale che presenta cicli estrali (e questo può essere un problema in alcune zone d Italia dove si presenta un anestro stagionale) mentre con il PRID si simula artificialmente l attività del corpo luteo. 21

24 L Inseminazione Strumentale L Inseminazione Strumentale è l operazione che comporta la deposizione del seme congelato nella porzione craniale della cervice o direttamente in utero. Questa operazione può essere effettuata dai veterinari o dagli allevatori e dai tecnici che abbiano seguito un apposito corso e siano registrati presso gli appositi elenchi regionali. La prima operazione da fare è quella di individuare chiaramente il seme da usare e la sua localizzazione all interno del contenitore, in modo tale da non rischiare di danneggiare il seme congelato esponendolo all aria nel tentativo di cercare la dose da utilizzare. Ecco perchè è importante predisporre una mappa del contenitore criobiologico con la precisa localizzazione delle dosi ed il loro numero! Subito dopo l individuazione delle dosi da usare bisogna predisporre un contenitore con acqua a +37 C che servirà per scongelare le dosi. Questa operazione in inverno dovrebbe essere eseguita in un locale riparato, mentre se viene eseguita all aperto, la temperatura dell acqua andrà aumentata di 2-3 gradi. Una volta individuata la bufala da inseminare e scelto il seme da utilizzare, si estrae la paillette dall'azoto liquido, la si scongela in acqua a +37 C per almeno 30 secondi e la si utilizza entro 10 minuti dallo scongelamento (in tal caso conservarla nell acqua!). La paillette viene quindi asciugata e tagliata con forbici pulite e asciutte, dalla parte in cui è presente la bolla d'aria (a metà della bolla stessa) e viene infilata nella siringa metallica (pistolet) per inseminazione. La pistolet è una sorta di siringa in acciaio composta da un lungo e sottile cilindro e da un pistoncino che scorre al suo interno. Sopra la pistolet viene montata la guaina monouso. Bisogna prestare attenzione che l'estremità anteriore della guaina combaci perfettamente con l'estremità tagliata della paillettes, in modo tale che durante l'inseminazione non avvenga un reflusso di materiale seminale fra la guaina e la paillette, con conseguente perdita di seme. 22

25 Corretto posizionamento della paillette e della guaina, rispetto alla pistolet (da SPELTA e COR- BELLA, Tecniche di fecondazione artificiale, CLESAV, Milano).. PISTONE CORPO TUBOLARE RONDELLA Paillette Guaina La pistolet dovrebbe essere conservata sempre pulita e d'inverno andrebbe scaldata (appoggiandola su di un calorifero o strofinandola energicamente contro un indumento pulito) prima di inserirvi la paillette, per evitare il raffreddamento del seme con conseguente possibile perdita di vitalità nemaspermatica. L inseminazione viene effettuata con la tecnica retto-vaginale. Si infila un braccio nel retto, con una mano si afferra la cervice e con l'altra si infila la pistolet, attraverso la vagina, nel canale cervicale (in questa operazione ci si aiuta con l altra mano che fissa e stende la cervice) e si deposita il seme nella porzione craniale della cervice e/o in quella caudale dell'utero. Non risulta vantaggiosa la deposizione del seme lungo il canale cervicale poiché aumenta la perdita di spermatozoi con il reflusso vaginale, mentre la deposizione del seme nei corni uterini non aumenta significativamente la fertilità, aumentando inoltre la probabilità di traumatizzare la mucosa uterina. Corretto inserimento in vagina della pistolet (da SPELTA e CORBELLA, Tecniche di fecondazione artificiale, CLE- SAV, Milano). 23

26 Verifica del corretto posizionamento in vagina della pistolet per la deposizione del seme (da SPELTA e CORBELLA, Tecniche di fecondazione artificiale, CLESAV, Milano).. Deposizione del seme premendo lo stantuffo della pistolet (da SPELTA e CORBELLA, Tecniche di fecondazione artificiale, CLESAV, Milano). Il contenitore criobiologico deve essere accuratamente conservato (in luogo chiuso e protetto), rifornito regolarmente di azoto, monitorato (affinchè non si verifichino perdite di azoto liquido identificabili con la formazione di ghiaccio o brina nella parte superiore del contenitore) ed ordinato (nella disposizione interna delle paillettes). Una mappa con la collocazione interna delle paillettes deve essere sempre disponibile ed aggiornata. 24

27 Una volta individuata la paillette, tramite la mappa della dislocazione delle paillettes all interno del contenitore, questa va rapidamente estratta e......collocata in acqua alla temperatura di C per almeno 30 secondi. Il contenitore dell acqua per lo scongelamento delle paillettes deve essere predisposto prima di ogni altra operazione. La paillette scongelata ed asciugata viene posta nella parte iniziale della pistolet. La paillette viene inserita dalla parte contenente lo stantuffo in cotone (chiaramente identificabile contro luce). 25

28 La parte terminale della paillette viene quindi tagliata. La guaina viene posta sopra la pistolet facendo attenzione che la sua estremità anteriore combaci con quella della paillette. L estremità posteriore della guaina viene fissata, tramite un anello di plastica, alla estremità inferiore della pistolet... 26

29 ...in modo tale che la guaina risulti ben salda. La pistolet è pronta per l Inseminazione Strumentale. L Inseminazione Strumentale viene eseguita utilizzando il normale metodo retto-cervicale in uso nei bovini. 27

30 Dilatando leggermente la rima vaginale si inserisce la pistolet in vagina. La mano inserita nel retto afferra la parte craniale della cervice e la tende in avanti facilitando l inserimento in essa della pistolet. Una volta raggiunta la porzione craniale della cervice, viene ivi deposto il seme premendo lo stantuffo della pistolet. 28

31 Quando fecondare Usando la PGF2α l animale dovrà essere fecondato ore dopo la seconda iniezione (possibilmente previa osservazione dei sintomi del calore). Dopo la sincronizzazione e l induzione dell estro con il PRID, si procede con una doppia inseminazione a 48 ed a 72 ore dopo la sua estrazione. Nel caso la bufala non presentasse segni di calore il giorno dopo la prima inseminazione non è necessario procedere con la seconda inseminazione. È fondamentale procedere alle registrazioni di quanto rilevato ed eseguito. Tali registrazioni potranno essere poi riportate in un apposito software per la gestione e l analisi dei dati. La diagnosi di gravidanza La diagnosi di gravidanza consente di accertare se l animale fecondato è gravido oppure no. Tale attività, di tipo clinico, è di stretta competenza del veterinario aziendale, che può operare essenzialmente in due differenti modi: tramite palpazione rettale (metodo usato routinariamente) o tramite ecografia (ancora raramente usata). La prima prevede la palpazione dell utero tramite la parete del retto. Si deve pertanto procedere all inserimento della mano guantata nel retto dell animale e, attraverso la sua parete, si esaminano i segni clinici della gravidanza che riguardano essenzialmente la verifica della presenza della membrana corion-allantoidea e delle modifiche della parete dell utero gravido. Il corretto rilievo dei sintomi richiede una buona esperienza da parte del clinico, soprattutto quando eseguito precocemente (dopo trenta giorni dall inseminazione). Per i casi dubbi, oppure di routine, la palpazione rettale può essere eseguita a distanza di 2-4 settimane dalla prima. Il metodo ecografico prevede l utilizzo di un ecografo, che consente di evidenziare la presenza del sacco amniotico e del feto in utero. Anche questo approccio, se eseguito precocemente, richiede una buona preparazione da parte del veterinario nel saper correttamente interpretare le immagini ecografiche. 29

32 Quali risultati dall Inseminazione Strumentale? L aspetto concernente i risultati ottenibili da una tecnica di uso strettamente applicativo è molto importante, definendo in sostanza il successo della tecnica stessa. Questo vale anche, e soprattutto, per l Inseminazione Strumentale. Il progetto sulla Valorizzazione della Inseminazione Strumentale nella bufala in Lombardia, affidato dalla Regione Lombardia all Istituto Spallanzani, ha consentito di verificare l affidabilità dell Inseminazione Strumentale in una serie di aziende lombarde con un buon livello di managerialità. In queste aziende erano infatti applicati tutti i presupposti all uso dell Inseminazione Strumentale esposti in questo opuscolo ed in una di esse venivano utilizzati i podometri per il rilievo dell estro. In tutte le aziende veniva effettuata l Inseminazione Strumentale dopo calore naturale o dopo la sincronizzazione e l induzione dell estro tramite il PRID o con un preparato a base di PGF 2α. I risultati ottenuti, suddivisi per tipo di approccio (inseminazioni dopo calore naturale, dopo uso del PRID o di PGF 2α ) sono riportati nella seguente tabella. Trattamento Non Gravida Gravida Totale Calore Naturale 206 (51%) 202 (49%) 409 PRID 240 (51%) 230 (49%) 470 PGF 2α 53 (49%) 55 (51%) 108 (*) Totale 499 (51%) 487 (49%) 986 (*) I dati disponibili con questo trattamento non sono numericamente paragonabili a quelli degli altri trattamenti. La variabilità in termini di fertilità fra le aziende viene riportata nella sottostante tabella. Azienda Non Gravida Gravida Totale (52%) 164 (48%) (56%) 169 (44%) (50%) 37 (50%) (35%) 104 (65%) (50%) 13 (50%) 26 Totale 499 (51%) 487 (49%) 986 La variabilità è stata grande (dal 44% al 65% di gravidanze) consentendo, in quelle aziende in cui il successo è stato più significativo, l eliminazione del toro aziendale. 30

33 Ringraziamenti Si ringrazia l azienda Caproni, nelle persone della titolare Sig.ra Ingrid Schwencke Caproni e del Veterinario aziendale Dr. Roberto Binda, per la disponibilità e l assistenza prestata per la realizzazione di questo opuscolo. 31

34 Indice Presentazione... 1 Premessa... 2 Presupposti aziendali per l Inseminazione Strumentale... 3 La produzione di seme congelato... 4 La qualità del seme congelato e la fertilità... 6 Il contenitore criobiologico... 8 Le paillettes di seme congelato L estro ed il momento dell inseminazione Il rilievo dell estro La sincronizzazione e l induzione dei calori L Inseminazione Strumentale Quando fecondare La diagnosi di gravidanza Quali risultati dall Inseminazione Strumentale? Ringraziamenti

35 RegioneLombardia Direzione Generale Agricoltura MILANO - Piazza IV Novembre, 5