Rilevazione rapida di ESBL, AMPC, MBL
ESβL Le ESβL sono enzimi derivanti da mutazioni delle β- lattamasi Sono prodotte da codifica cromosomiale a localizzazione e diffusione plasmidica Il cambiamento di configurazione nei pressi del sito attivo aumenta l affinità e la capacità idrolitica dell anello lattamico nei confronti di ciclosporine a largo spettro L azione delle β- lattamasi è contrastata dagli inibitori delle β- lattamasi: acido clavulanico Sono state isolate in E.coli, Klebsiella e enterobacter
ESβL Distruggono le cefalosporine (farmaci di prima linea) Aumentata mortalità per il tardivo riconoscimento e inappropriato trattamento con cefalosporine di gravi infezioni causate da microrganismi produttori di ESβL La resistenza ESβL-mediata non è sempre evidente in vitro per tutte le cefalosporine Molti microrganismi produttori di ESβL sono multiresistenti (MDR) agli antibiotici non β-lattamici (chinoloni, aminoglicosidi e trimethoprim) Epidemia
AmpC Cefalosporinasi è una β- lattamasi inducibile espressa dopo esposizione ad alcuni antibiotici ß-lattamici (cefoxitina o imipenem), ma non da cefalosporine di III e/o IV G Distinte dalle ESβL Inizialmente sono state isolate a livello cromosomico, sono state ritrovate in plasmidi o espresse in maniera costitutiva Analogamente alle ESβL, il meccanismo di resistenza conferito dalle AmpC consiste nell idrolisi dell anello β-lattamico delle cefalosporine di II e II generazione Le AmpC sono state riscontrate in Enterobacter (cromosomiche iperprodotte), Serratia, Aeromonas, Klebsiella (rara e plasmide mediata), P. aeruginosa, Proteus (indolo positivo) Citrobacter Non è attivo l acido clavulanico
AmpC Gli enzimi AmpC possono essere INDOTTI dal clavulanato (un inibitore degli enzimi β-lattamasi) che li inibisce scarsamente, e possono quindi attaccare la cefalosporina, mascherando la sinergia risultante dall inibizione delle ESβL Difficili da diagnosticare La simultanea presenza di AmpC e di una ESβL può indurre l errore di un test per ESβL falsamente negativo L acido clavulanico può agire da induttore di AmpC ed aumentare la resistenza ai farmaci di screening (falsi pos) Cefepime: antibiotico di screening (stabile alle AmpC)
MßL Le Metallo β-lattamasi sono β-lattamasi che richiedono cationi bivalenti (solitamente Zinco) per essere attivate Le MβL possono essere espresse a livello cromosomiale o tramite plasmidi e la loro espressione conferisce resistenza a diversi antibiotici ad ampio spettro (Penicilline, Azlocilline, Ticarcilline) Sono state riscontrate in : - Stenotrophomonas maltophilia - P. aeruginosa - Bacillus cereus - Acinetobacter spp. Resistenti all acido clavulanico, le MβL vengono trattate utilizzando EDTA in combinazione con Imipenem o Meropenem o con acido mercaptopropionico in combinazione con Ceftazidime
EsβL, MβL e AmpC RIEPILOGO Conferiscono resistenza agli antibiotici di primo impiego Sono espresse dai principali microrganismi patogeni (Enterobatteriacee, Pseudomonas ) Si diffondono rapidamente mediante trasferimenti intra-specie e inter-specie Rappresentano un concreto rischio di epidemie ed endemie nella popolazione
EsβL, MβL e AmpC È necessaria una rilevazione rapida e sistematica di questi enzimi!
METODOLOGIA Metodi tradizionali di conferma in agar diffusione Doppio disco Combination Disk E-test ESBL, MBL
METODOLOGIA Doppio disco (o approssimazione del disco) su una stessa piastra sono posizionati 1 disco di cefotaxime e 1 di ceftazidime 30 µg (o cefpodoxime 10 µg) a 20-30 mm di distanza da un disco di amoxiclavul. (20-10 µg): si ha ESβL quando l alone di entrambe le cefalosporine viene dilatato per effetto dell acido clavulanico
METODOLOGIA Combination disk confronto tra gli aloni prodotti da una cefalosporina e dalla stessa cefalosporina + Ac. Clavulanico (test positivo se il diametro è 5 mm) o al 50% Cod MST-D52C = Ceftazidime, cefotaxime e cefpodoxime Per AmpC: cefepime (MST-D63C e cefpirome MST-D65C)
Test enzimatico rapido su striscia per la rilevazione di: ESβL MβL AmpC Test rapido: risultati in 15 minuti Facile da utilizzare: risultato indicato dal viraggio di colore
Cica Beta Test 1 Cica Beta Test MBL Cica Beta Test CVA Cica Beta Test C Mini
È preferibile effettuare un test di nitrocefin in caso di blood agar o nutrient agar
Isolare il microrganismo utilizzando un terreno non selettivo (Mueller Hinton Agar) Aggiungere una goccia di reagente subito prima di effettuare il test (HMRZ-86) Effetto Inibitore RED Effetto Inibitore YELLOW 2-15 min NON OLTRE TEMPERATURA AMBIENTE
ESBL MBL Amp C Sequenza test Cica-Beta Test I Cica-Beta Test MBL Red Red Red Red Yellow Red Cica-Beta Test CVA Yellow Red Red Cica-Beta Test C Red Red Yellow
Per ottenere i migliori risultati Prelevare le colonie dal margine dell alone di inibizione prodotto da una cefalosporina di terza G (cefpodoxime) su terreno MH o BHI Strisciare bene le colonie sulla strip (3 coloni per AmpC) Per i ceppi di Klebsiella che iperproducono K1 fare test dell indolo Associare i risultati di Cica Beta test con i risultati dell antibiogramma Utilizzare solo colonie di recente isolamento Effettuare l analisi entro 30 minuti dall estrazione della piastra dal termostato Fare attenzione ai ceppi di collezione o stock perché potrebbero aver perso la capacità di produrre gli enzimi Iniziare sempre dal test Cica Beta Test 1 Utilizzare sempre tutta la serie perché alcuni ceppi potrebbero esprimere meccanismi di resistenza multipli Leggere entro 15 minuti Aggiungere il substrato immediatamente prima di fare il test
Rileva e differenzia i produttori di ESβL, MβL e AmpC Rapido: risultati in soli 15 minuti Conveniente: nessun reagente addizionale Facile da usare: il viraggio indica il risultato
Cica-Beta Test 1-40 test MST-717562 717562-1 Cica-Beta Test MβL M - 40 test MST-717562 717562-2 Cica-Beta Test CVA - 40 test MST-717562 717562-3 Cica-Beta Test C mini - 40 test MST-717562 717562-8