Lenti con orifizi molto piccoli (skimmer o coni) devono comunque permettere passaggio di più ioni possibile per garantire sensibilità

IONIZZAZIONE A PRESSIONE ATMOSFERICA ESI Elettrospray API APCI Ionizzazione chimica a pressione atmosferica APPI Fotoionizzazione a pressione atmosferica La CI richiede P più elevata rispetto a quella delle comuni sorgenti EI e negli analizzatori di massa; molto efficiente nel produrre ioni, dato che le costanti di velocità per le reazioni ioni-molecola sono direttamente collegate alla frequenza delle collisioni dei reagenti quindi processo di CI a P atm avrà la massima efficienza. Maggiore difficoltà: trasferire gli ioni ottenuti all'interno della camera ad alto vuoto (10-5 - 10-6 Torr) dell'analizzatore. Le considerazioni appena espresse hanno indotto lo sviluppo di spettrometri di massa con una sorgente ionica operante a P atmosferica e hanno portato nel corso degli anni alla messa a punto di tre metodi di ionizzazione: APCI, ESI e ISI, più recentemente 1 anche APPI. Interfaccia a pressione atmosferica (API) Lenti con orifizi molto piccoli (skimmer o coni) devono comunque permettere passaggio di più ioni possibile per garantire sensibilità Problema nell accoppiamento della zona sorgente con la zona analizzatore sistema di pompaggio differenziale, con 2 zone intermedie 2 1

Altro problema: raffreddamento causato dall espansione adiabatica di campione e solvente che favorisce la comparsa di cluster di ioni importante la desolvatazione degli ioni, effettuata introducendo un transfer tube di metallo riscaldato (ca. 200 C) o flusso in contro-corrente di gas riscaldato (curtain gas) Desolvatazione migliorata accelerando gli ioni applicando voltaggio tra le diverse lenti 3 4 2

Ioni collidono con le molecole di gas residuo, aumentano la loro energia interna (che induce la desolvatazione finale con scomparsa dei cluster di ioni). Queste collisioni potrebbero anche fornire abbastanza energia da indurre frammentazione FRAMMENTAZIONE IN SORGENTE (in-source fragmentation) La desolvatazione è necessaria per evitare distribuzione dell analita in più specie (clusters), con riduzione sensibilità. Trasferimento di ioni da P atm a vuoto dello spettrometro di massa causa perdita di ioni, tuttavia compensata da più alta resa totale degli ioni in sorgente API dovuta a rapida stabilizzazione termica a P atm. Prime sorgenti API: geometria assiale, ora maggior parte ortogonale solo ioni e non solvente entrano dall orifizio, che può essere più largo, cosa che, insieme a riduzione del rumore, compensa la perdita di trasmissione dovuti a questa geometria. Inoltre posso usare velocità di flusso > 5 6 3

ESI CAPILLARY (3-5 kv) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - DROPLET CONTAINING IONS AS DROPLET EVAPORATES, THE ELECTRIC FIELD INCREASES AND IONS MOVE TOWARDS THE SURFACE - - IONS EVAPORATE FROM THE SURFACE Messa a punto alla fine degli anni 80. 1989 (Fenn et al.): formazione ioni multi-carica da proteine, con peso molecolare determinabile con strumenti fino a 2000 m/z All inizio solo per proteine. Attualmente copre circa l 80% delle applicazioni riguardanti l'impiego della HPLC-MS 7 Concetti della sorgente elettrospray già annunciati in studi precedenti: Dole, M.; Mack, L.L.; Hines, R.L.; Mobley, R.C.; Ferguson, L.D.; Alice, M.B. Molecular Beams of Macroions. J. Chem. Phys. 1968, 49, 2240-2249. Zeleny, J. Instability of Electrified Liquid Surfaces. Phys. Rev. 1917, 10, 1-7. Taylor, G.I. Disintegration of Water Drops in an Electric Field. Proc. Royal Soc. London A 1964, 280, 383-397 John B. Fenn Nobel prize In chemistry 2002: La spettrometria di massa è l arte di pesare atomi e molecole per misurarne la massa. Tale informazione è a volte sufficiente, frequentemente necessaria, e sempre utile per determinare l identità di una specie 8 4

Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules JB Fenn, M Mann, CK Meng, SF Wong, CM Whitehouse Science 6 October 1989: Vol. 246 no. 4926 pp. 64-71 Abstract: Electrospray ionization has recently emerged as a powerful technique for producing intact ions in vacuo from large and complex species in solution. To an extent greater than has previously been possible with the more familiar "soft" ionization methods, this technique makes the power and elegance of mass spectrometric analysis applicable to the large and fragile polar molecules that play such vital roles in biological systems. The distinguishing features of electrospray spectra for large molecules are coherent sequences of peaks whose component ions are multiply charged, the ions of each peak differing by one charge from those of adjacent neighbors in the sequence. Spectra have been obtained for biopolymers including oligonucleotides and proteins, the latter having molecular weights up to 130,000, with as yet no evidence of an upper limit. 9 10 5

5 kv 5 kv Gas di nebulizzazione Electrospray ionization (ESI) Le nebulizzazione si produce per effetto elettrostatico. Le gocce del nebulizzato contenenti prevalentemente cariche dello stesso segno si respingono e lo spray rapidamente diverge. Limitazioni: Flusso fino a 20 µl/min; volatilità e polarità del solvente. Ionspray ionization (ISI) L elettronebulizzazione è assistita da un flusso di gas coassiale all ago (assistenza pneumatica). Lo spray risulta meno divergente. Oggi tutte le sorgenti ESI hanno una qualche forma di assistenza pneumatica. L acronimo ESI si utilizza indistintamente anche per sorgenti nella quali l elettronebulizzazione è assistita pneumaticamente. 11 Dettaglio dell ugello elettrospray Sonda riscaldata ESI Guaina di N 2 ±5 kv Gas di nebulizzazione N 2 Pennacchio di ioni Ago ESI 12 6

13 La sorgente ESI è una cella elettrolitica e - e - e - Campo elettrico: 10 6 V/m 14 7

Effetto del potenziale elettrospray sulla goccia alla punta del capillare, come osservato all aumentare del voltaggio. Sinistra: a basso voltaggio, la goccia è per lo più sferica Centro: a circa 1 o 2 kv, ma al di sotto del potenziale di onset, la goccia si allunga sotto la pressione delle cariche che si accumulano sulla punta Destra: al voltaggio di onset, la pressione supera la tensione superficiale, la forma della goccia cambia completamente a cono di Taylor e vengono rilasciate piccole goccioline. Le goccioline si dividono ed esplodono, producendo lo spray [velocità di flusso: 1-10 µl/min] On-set voltage: dipende, per una data sorgente, dalla tensione superficiale del solvente, per esempio: 4 kv per acqua, 2.2 kv per metanolo, 2.5 kv per acetonitrile, 3 kv per dimetilsolfossido 15 CARICAMENTO DELLA GOCCIA Tra i due elettrodi si applica una elevata ddp (tra i 3 e i 5 kv) rispetto al piatto con foro d ingresso dello spettrometro; l elettrodo capillare può essere sia il polo positivo che quello negativo. Come conseguenza di questa differenza di potenziale si hanno due fenomeni: l ossidazione/riduzione agli elettrodi e la migrazione elettroforetica delle specie ioniche formate all elettrodo capillare verso la superficie del liquido. I processi elettrodici che normalmente avvengono sulla superficie dell elettrodo capillare sono l ossidazione (capillare positivo) o la riduzione (capillare negativo) dell acqua e, se il capillare contiene metalli ossidabili, si nota con il tempo una certa corrosione dovuta all ossidazione elettrochimica. 16 8

17 The requirement for charge balance in such a continuous electric current device, together with the fact that only electrons can flow through the metal wire supplying the electric potential to the electrodes, leads to the conclusion that the ESI process must include an electrochemical conversion of ions to electrons. the ESI device can be viewed as a special type of electrolytic cell, special because the ion transport does not occur through uninterrupted solution, as is normally the case in electrolysis. Part of the ion transport occurs through the gas phase. In the positive ion mode where positively charged droplets and later positive gas-phase ions are the charge carriers, a conventional electrochemical oxidation reaction should be occurring at the positive electrode, that is, at the liquid/metal interface of the spray capillary. This reaction supplies the extra positive ions to the solution that prevents the build-up of a charge imbalance. The other alternative for producing extra positive ions is the removal of negative ions present in the solution by an oxidation reaction. For aqueous solutions: 18 9

ESPULSIONE DELLE GOCCE Se la velocità di flusso della soluzione attraverso il capillare è sufficientemente bassa (< 5 µl/min) il menisco della gocciolina continua a caricarsi e si deforma dando luogo al cosiddetto cono di Taylor (la geometria del cono di Taylor si ottiene per portate basse, fino a 2 µl/min, oltre questa portata l ESI deve essere assistita pneumaticamente). All aumentare della densità di carica dal cono di Taylor si staccano delle microgocce cariche che, attratte dal controelettrodo, vanno a chiudere il circuito. Il rilascio delle goccioline cariche ristabilisce l equilibrio del cono di Taylor, ma altri ioni sono prodotti dal processo elettrodico, cosicché si raggiunge uno stato di equilibrio dinamico in cui le goccioline cariche sono continuamente, regolarmente emesse dal cono di Taylor. Il raggio delle goccioline sarà tanto minore quanto minore è la velocità di flusso della soluzione e quanto maggiore la sua conducibilità. Il flusso di goccioline cariche costituisce la corrente elettrica generata dal circuito e può essere misurata. 19 Vol=3.5 µm 3 Area=11 µm 2 Fission processes of the charged droplet due to the decrease in the volume by evaporation of solvent. N: number of charges; R: radius in µm; t: time required for the droplet to shrink to a size suitable for droplet fission Kebarle et al. Anal. Chem. 65 (1993) 972A Tot 2% volume, ma 15% carica rispetto a goccia d origine densità di carica >> Limite di Rayleigh: forza di repulsione di Coulomb delle cariche sulla superficie è uguale alla tensione superficiale della soluzione q 2 = 8π 2 ε 0 γd 3 in realtà la deformazione permette la rottura prima di arrivare al limite di Rayleigh 20 10

Sotto l influenza del forte campo elettrico, avviene la deformazione della goccia, che si allunga sotto la forza risultante dall accumulo di carica infine produce 21 nuovo cono di Taylor FRAMMENTAZIONE DELLE GOCCE Se le gocce avessero un cammino libero, tenderebbero a depositarsi sul controelettrodo, invece queste incontrano un flusso di gas caldo (aria o azoto) che permette l evaporazione del solvente. La densità di carica aumenta fino al limite di stabilità di Rayleigh in cui avviene l esplosione colombiana: la microgoccia si stacca e la carica si distribuisce su una superficie minore. La forma della goccia carica risulta distorta (alternativamente oblata e prolata) durante il suo percorso verso il controelettrodo. Il processo avviene più volte fino ad arrivare ad un diametro di circa 8 nm con circa 70 cariche. 22 11

FORMAZIONE DI IONI CARICHI A questo punto non avviene più l esplosione coulombiana, e gli ioni in fase gassosa si originano dalle goccioline più piccole ad elevatissima densità di carica. L esatto meccanismo con cui gli ioni sono trasferiti in fase gassosa non è stato interamente chiarito. La vecchia teoria, proposta da Dole, prevede che il fenomeno prosegue fino a generare una sola molecola di analita ed una o più cariche. L evaporazione delle ultime molecole di solvente produce una serie di ioni, tra cui quello della molecola di analita con poche molecole di solvente coordinate. Questa teoria viene chiamata charged residue model (ormai poco considerata). Il secondo meccanismo, proposto da Iribarne e Thompson prevede l emissione (desorbimento) di ioni solvatati dalla superficie delle microgocce quando queste raggiungono un certo valore del raggio. Questo processo è chiamato ion evaporation mechanism (accettata dai più come unica valida). 23 A schematic representation of the possible pathways for ion formation from a charged liquid droplet. CRM of Dole, 1968 r = 8 nm N = 70 Nguyen S, and Fenn J B PNAS 2007;104:1111-1117 IEM of Iribarne and Thomson, 1970 2007 by National Academy of Sciences 12

MECCANISMO DELLA IONIZZAZIONE ESI: da ioni in soluzione a ioni in fase vapore 1- Il processo elettrochimico che avviene all elettrodo costituito dal capillare (per ho ossidazione per fornire e - (per chiudere circuito), per ho riduzione per consumare e - ) 2- La formazione di goccioline cariche a partire dal liquido che fuoriesce dal capillare. 3- l evaporazione del solvente dalle goccioline con conseguente instabilità ed esplosione coulombiana. 4- Passaggio degli ioni in fase gassosa: Quando il campo elettrico sulla superficie della goccia diventa grande abbastanza, avviene il desorbimento degli ioni dalla superficie: da ioni in soluzione a ioni in fase gas 25 Poiché il desorbimento delle molecole cariche avviene dalla superficie, la sensibilità sarà maggiore per quei composti che hanno maggiore concentrazione sulla superficie, i lipofili effetto mascherante rispetto a composti più solubili nel bulk. Nel caso di proteine: molecole non desorbono, ma sono liberate per evaporazione del solvente. Ioni ottenuti da molecole grandi portano un numero maggiore di cariche se sono presenti diversi siti ionizzabili circa 1 carica ogni 1000 Da 26 13

ESI Ioni tipici prodotti dalla ionizzazione elettrospray: IONI MULTICARICATI Modalità Positiva: Modalità Negativa: [MH] molecola protonata [MNa], [MK], [MNH 4 ] addotti con cationi [MCH 3 CNH] molecola protonata addotto con solvente [M-H] - molecola deprotonata [MHCOO] - addotti con formiato, con acetato... 27 395.73 396.22 397.24 162.08 323.15 162.58 324.15 163.08 325.15 (M3)/3 (M2)/2 (M1)/1 m/z 28 14

[M17H] 17 1049.8=(M17*1.0079)/17 ESI spectrum of phage λ lysozyme; m/z in Th and the number of charges are indicated on each peak. The molecular mass is measured as being 17 828±2.0 Da. 29 Spettro ESI di vanillil alcol ossidasi 30 15

ESI mass spectrum of denatured protein 100 [MnH] n 21 808.3 22 771.5 20 848.6 19 893.3 18 942.7 The charge state distribution (or mass spectral envelope ): range of charge states observed most abundant charge state relative abundance of ions % 23 738.1 24 707.3 17 998.1 15 1131.1 14 1211.8 13 11 10 1305.0 1542.0 1696.1 0 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z 31 Mass determination of a protein from ESI mass spectrum Take 2 adjacent m/z peaks: eg. 1414.0 and 1542.0 M = 16951 Da (m/z) n = [M nh] / n (Eq 1) (m/z) n1 = [M (n1)h] / (n1) (Eq 2) n = [(m/z) n1 - H] / [(m/z) n - (m/z) n1 ] (Eq 3) if H ~ 1 Da, n ~ [(m/z) n1-1] / [(m/z) n - (m/z) n1 ] (Eq 4) M = n (m/z) n - nh = n [(m/z) n H] z 1 = j (m 2 m p ) / (m 2 m 1 ), z 1 = 1 x (1542-1)/(1542-1414) z 1 = 12 32 16

Spettro ESI della mioglobina equina 16951.2 Rapporto m/z Num. di cariche Massa molecolare (m) (n) (M) 1305.2 13 16954.6 1211.9 14 16952.6 1131.1 15 16951.5 1060.3 16 16948.8 998.2 17 16952.4 942.8 18 16952.4 893.1 19 16949.9 848.5 20 16950.0 808.2 21 16951.2 771.4 22 16948.8 33 Media 16951.2 ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da) 12 715.99 13 661.26 11 786.97 10 859.66 Ubiquitina Ossidata 8580.00 Ubiquitina Intatta 8563.63 Ubiquitina Carbossilata 8594.25 9 955.00 8 1073.07 Nessuna Frammentazione Formazione di Ioni Multicarica Spettro Deconvoluto 17

DISTRIBUZIONE DELLE CARICHE NEGLI IONI MULTICARICA La distribuzione delle cariche negli ioni multicarica dipende da più fattori. STRUTTURA DELL ANALITA Per ogni analita c è un determinato numero di siti che possono accettare il protone, il cui valore dipende dalla conformazione (per le proteine struttura terziaria), che influenza la disponibilità effettiva dei siti. Nel caso delle proteine solo dopo una completa denaturazione (struttura nativa) tutti i siti diventano disponibili per la ionizzazione. CONCENTRAZIONE DELL ANALITA Si devono evitare condizioni di elevata concentrazione, perché, causa il numero limitato di cariche disponibili, diminuisce il numero totale di cariche per molecola. In condizioni di nanoelectrospray si può ottenere una distribuzione di carica più uniforme. CARATTERISTICHE DELLA SOLUZIONE Caratteristiche quali: tensione superficiale, conducibilità, viscosità e polarità del solvente, influenzano in generale il fenomeno ESI e anche la distribuzione delle cariche delle macromolecole. 35 Tridimensional Structural Information 36 18

37 (A) Conformation and charge-state distribution of ubiquitin dissolved in 99:1 H 2 O:formic acid. (B) Conformation and charge-state distribution of ubiquitin dissolved in 49:50:1 H 2 O:MeOH:formic acid 38 19

CONDIZIONI STRUMENTALI La distribuzione finale delle cariche dipende: dalla configurazione della sorgente, dalla distanza tra gli elettrodi, dalla temperatura e portata dei gas, dal V tra cono di campionamento e cono di skimmer, in quanto tutti questi fattori influenzano i quattro stadi dell ESI. REAZIONE IONE MOLECOLA Al momento della ionizzazione, possono avvenire trasferimenti di carica tra il macro poli-ione e piccole molecole copresenti quali H 2 O, NH 3 ph DELLA SOLUZIONE ED EVENTUALE CAPACITA TAMPONANTE Teoricamente ad un basso ph corrispondono più protoni, quindi una maggior quantità di carica e ioni multicarica, ma in pratica non si osserva tutto ciò. A parte le situazioni che si verificano a valori estremi, l effetto del ph non è facilmente prevedibile e spesso, meno drammatico di quanto ci si potrebbe aspettare. Ciò è dovuto al fatto che in ESI si generano al capillare ioni H e in ESI - ioni H vengono neutralizzati. Risulta allora di fondamentale importanza l aggiunta di un elettrolita. 39 Mioglobina At ph 3, negative ions are observed, the most intense ions bearing from 13 to 15 charges. A calculation based on known pk values shows that in the original solution, only 1 molecule in approximately 3500 bears one negative charge 40 20

41 Sensibilità alla concentrazione A differenza di altre tecniche di ionizzazione, la risposta in ESI è proporzionale alla concentrazione e non alla quantità di analita iniettata in sorgente 42 21

Poiché ESI = cella elettrolitica, quando si ha estrazione di ioni positivi, devono essere forniti elettroni al circuito dal capillare. Questo avviene tramite ossidazione delle specie N - in soluzione alla punta del capillare. In pratica, poiché si allontanano ioni dalla soluzione (verso analizzatore), devo allontanare stesso numero di cariche - dalla soluzione. Per ESI ho ossidazione per fornire e - da parte della soluzione; per ESI - ho riduzione per consumare e - il numero totale di ioni che possono essere estratti per unità di tempo verso lo spettrometro è limitata dalla corrente elettrica prodotta dal processo di ossidazione o riduzione sulla punta del capillare. Ciò spiega dipendenza dalla concentrazione. Altre variabili: solvente, velocità di flusso, natura e misura del capillare, distanza dal controelettrodo, potenziale applicato 43 Cella elettrochimica a corrente costante I tot (circa 1 µa) costante, portata dagli ioni Se nel flusso ho troppi ioni provenienti dai sali presenti, essi stessi saranno sufficienti a produrre I M Pochi ioni del campione o nessuno! Se soluzione è troppo diluita e con flusso basso, il flusso di ioni non riuscirà a fornire I M fenomeni di ossidazione () di solvente e campione che porteranno a radicali cationi 44 22

La corrente elettrica del sistema ESI è trasportata da 3 tipi di ioni: l analita A, l elettrolita B ed eventuali altre specie ionizzabili presenti in soluzione che indichiamo con C. Avremo quindi: I tot = I A I B I C I A = K A [A], I B = K B [B], I C = K C [C] K i = costanti di desorbimento delle varie specie, dipendono sia dall affinità per la carica sia dalla costante di equilibrio tra interno e superficie della microgoccia. A noi interessa sapere la frazione di corrente trasportata dall analita, la quale determina la sensibilità con cui esso può essere misurato. I M = f p I tot f = la frazione di carica che effettivamente passa in fase vapore p = l efficienza di trasmissione degli ioni Quindi, la presenza di elettroliti e di eventuali altre sostanze, se le costanti o le concentrazioni sono elevate, influenzano negativamente l intensità del segnale dell analita. Per aumentare la sensibilità: tenere la più bassa possibile la concentrazione di eventuali elettroliti aggiunti alla fase mobile. 45 I A = K A [A] I B = K B [B] I Tot = I A I B ma è limitata f p I tot = I M Consideriamo [B] costante, ma [A] che varia. Ho quindi 2 casi limite. Il primo, per k A [A] << k B [B], Quindi intensità del segnale è proporzionale a [A], ma sensibilità è inversamente proporzionale a [B] (curva di calibrazione rettilinea) Per k A [A] >> k B [B], I A rimane costante e la quantificazione non è più possibile. Il segnale di B diminuirà all aumentare di [A] 46 23

Se però K B [B] aumenta, la retta che otterremo sarà sempre meno inclinata e la risposta sarà più bassa. Quindi una certa concentrazione di B è necessaria per avere un intervallo di linearità sufficientemente esteso. In genere si lavora con concentrazioni di elettrolita 10-2 -10-3 moli/l per raggiungere un buon compromesso tra intervallo di linearità e sensibilità, ma per specie che mostrano costanti di desorbimento basse può essere utile diminuire la concentrazione di elettrolita. Se si considera anche la specie C, si deve tener conto che la sua presenza incide sulla risposta di A. Per una corretta analisi quantitativa bisogna fare i conti con tale effetto che dipende dalla matrice che costituiva il campione iniziale da analizzare. La presenza di elettroliti e di eventuali altre sostanze influenzano negativamente l intensità del segnale dell analita, se le costanti o le concentrazioni sono elevate. Per aumentare la sensibilità devo tenere basse le concentrazioni di eventuali elettroliti volatili aggiunti alla fase mobile (generalmente HCOOH, NH 3, TFA) per renderla più adatta alle separazioni che vogliamo ottenere, o per migliorare la forma dei picchi. 47 Anche se il segnale relativo a C (ed eventualmente anche a D, E n) non viene rilevato, la ionizzazione può avvenire ugualmente. Se l affinità per la carica e/o per la superficie di C, ecc. è elevata il segnale di A viene soppresso, ma se l affinità per la carica è scarsa e l affinità per l interno della goccia è forte (molecole molto polari) il segnale può anche aumentare. Questo effetto, dovuto alla limitata quantità di cariche che si formano nel processo ESI, ne rappresenta la limitazione più importante. 48 24

In a solvent containing NH 4 and Na ions at constant concentrations, an increasing amount of morphine chlorhydrate is added. On the top: number of amperes at the capillary tip; Below: the intensity monitored at the mass of protonated morphine and the sum of the intensities for NH 4 and Na ions. At low conc. of morphine chlorhydrate, I B I M, and linearity towards morphine concentration is observed. At high concentrations, the intensity for morphine is constant, and the signal for the other ions diminishes (I A I M ). At intermediate values, the general Equation applies. 49 ESI pneumaticamente assistita: configurazione fuori asse 50 25

ESI pneumaticamente assistita: configurazione ortogonale Z-spay ionization source 26

Prestazioni Generali della Sorgente ESI Vantaggi Funziona bene con analiti volatili e non volatili, ionici e/o polari Informazioni sul peso molecolare Scarsa frammentazione Elevata sensibilità Permette la determinazione di alti pesi molecolari Interfacciamento con Cromatografia Liquida Svantaggi Scarsa frammentazione Non compatibile con l utilizzo di tamponi non volatili e solventi organici apolari. Ionizzazione inibita da alte concentrazioni saline 53 NANOSPRAY (ESI) La diminuzione del diametro del capillare e la diminuzione del flusso della soluzione sono alla base del cosiddetto NANOSPRAY E una tecnica di ionizzazione ancora piu soft dell ESI, dunque crea ioni a più alto rapporto m/z rispetto all ESI convenzionale. Si possono ottenere spettri da pg (nmol/ml) di materiale grazie al ridotto diametro interno del capillare e al potenziale più basso di quello normalmente usato in ESI Particolarmente adatto per la analisi di biomolecole Più tollerante alla presenza di sali (perché gocce hanno diametro < 200 nm, contro 1-2 µm della ESI, con volume 100-1000 volte inferiore Distanza controlettrodo ca. 1 mm, voltaggio dello spray 1-2 kv 27

ESI: configurazione nano 55 Charged water droplets produced by nanospray First droplet shown is a droplet produced at spray needle. The radius and charge of this droplet is followed in time for three evaporation and fission events. 56 28

I vantaggi della sorgente nano-esi rispetto alle tecniche ad alte velocità di flusso possono essere razionalizzati sulla base dei principi fondamentali del processo ESI : è noto che una minore velocità di flusso della soluzione riduca la dimensione delle gocce cariche inizialmente prodotte durante il processo di formazione dello spray. Le gocce iniziali più piccole richiedono un numero inferiore di eventi di fissione della goccia e minor evaporazione del solvente prima del rilascio dello ione in fase gas. Come conseguenza, una porzione maggiore delle molecole dell analita presenti nelle gocce primarie è resa disponibile per l analisi MS, e l aumento della concentrazione dei contaminanti è significativamente ridotta (inoltre gli ioni prodotti sono più vicini al cono di campionamento e riescono ad arrivare all analizzatore). Quindi, la nano-esi può essere considerata more than just a miniaturized sorgente ESI convenzionale. Tuttavia, in nano-esi l intensità assoluta dei segnali ottenuta per una certa soluzione di analita o il rapporto dell intensità dei segnali ottenuti per certe miscele può variare significativamente utilizzando diversi aghi nano-esi. 57 La differenza di potenziale applicata influenza moltissimo la forma dello spray. Si ha uno spray stabile e con un cono di diffusione ridotto solo per opportuni valori dipendenti dalla portata e dal diametro del capillare. 58 29

APCI IONIZZAZIONE CHIMICA A PRESSIONE ATMOSFERICA Precedente e complementare rispetto all'esi, ma con meno successo. Strumento LC-MS con ESI e APCI consente di affrontare qualsiasi problematica di spettrometria di massa non risolvibile con la tradizionale GC- MS con ionizzazione elettronica (EI) o ionizzazione chimica tradizionale (CI). 59 APCI Non c è spray voltage nebulizzazione è realizzata per azione solo del nebulizzatore pneumatico Trasformazione dell aerosol in vapore (solvente analita altamente diluito) avviene nel blocco riscaldante Si basa su trasferimento di specie cariche da uno ione reagente alla molecola di analita Più soft della CI classica Ioni positivi: addotti della molecola di analita con piccoli cationi come H, NH 4, Na o altri cationi provenienti dalle reazioni del gas reagente. Ioni negativi: perdita di protoni, cattura di e -, o addotti con piccoli anioni come Cl -, HCOO -, CH 3 COO - ecc. Rispetto a ESI: genera ioni da sostanze neutre (meno polari) Poco riproducibile: dipende dal solvente, dal gas nebulizzante, temperatura ecc. 60 30

SCHEMA DI UNA SORGENTE APCI 400-500 C 61 TRE FASI: 1. passaggio dell analita in fase vapore (nebulizzazione e desolvatazione); 2. ionizzazione dell analita per mezzo di reazioni scambio di carica ione-molecola in fase gassosa a pressione atmosferica; 3. introduzione degli ioni nella zona ad alto vuoto con esclusione della maggior parte del solvente e delle specie neutre La nebulizzazione avviene per effetto dell azione simultanea del calore che fa evaporare parte del solvente e di un flusso di gas ad elevata velocità. Un tipico disegno di nebulizzatore per APCI consiste in un capillare di silice fusa o altro materiale attraverso cui passa il flusso di fase mobile proveniente dalla colonna LC e da un tubo più largo, concentrico che viene riscaldato e all interno del quale passa il flusso di gas. Il tubo viene scaldato a temperature piuttosto alte, ma la maggior parte del calore è utilizzato per la vaporizzazione del solvente cosicché la temperatura massima a cui vengono a trovarsi gli analiti è molto più bassa e la decomposizione termica in genere trascurabile. 62 31

Dettaglio dell ugello APCI Sonda riscaldata APCI Guaina gassosa N 2 Ago corona ±5 kv Gas di nebulizzazione N 2 Capillare APCI (ritratto) Pennacchio ioni Plasma ioni Meccanismo di generazione degli ioni in APCI Nebulizzatore riscaldato Molecole del solvente Molecole del campione Trasferimento di carica N 2 N 2 Liquido Ago corona Aerosol Molecole del campione solvatate Solvente ionizzato Campione ionizzato Le molecole di solvente ionizzate si comportano poi da reagente per la ionizzazione chimica degli analiti, in modo analogo a quanto avviene per la ionizzazione chimica tradizionale. 64 32

Il solvente evapora dalle goccioline per effetto del calore nella zona successiva a quella dove avviene la nebulizzazione e la ionizzazione delle specie, ormai in fase vapore, è iniziata per mezzo di una scarica a corona provocata da una punta mantenuta ad un potenziale di 3-8 kv. La scarica provoca la ionizzazione primaria del gas utilizzato per sostenere la nebulizzazione (azoto o aria) dando inizio ad una serie di reazioni ione molecola che porterà infine alla ionizzazione delle molecole di analita. A differenza della CI a bassa pressione, a PA le collisioni sono molto frequenti e, a meno che la scarica a corona non sia fatta avvenire troppo vicino al foro di campionamento (dopo l espansione la pressione diventa molto più bassa e le collisioni assai meno frequenti), il processo arriva all equilibrio termodinamico, cioè si ha la formazione delle specie più stabili. Il trasferimento di protone è il meccanismo più frequente in APCI positiva e il più utile per la successiva analisi MS. Maggiore é l affinità per il protone dell analita, maggiore é l efficienza di 65 ionizzazione. Reazioni ione-molecola nella APCI...... Se c è ossigeno, si forma anche O 2 Si ha prima la formazione dello ione-radicale N 2 che, essendo instabile, reagisce trasformandosi nello ione-radicale N 4. Questo reagisce con una molecola di H 2 O (più in generale con una molecola di solvente) per dare H 2 O che a sua volta cede il protone ad una seconda molecola di H 2 O con formazione dello ione H 3 O, nella cui sfera di coordinazione possono essere presenti n molecole di H 2 O. Infine lo ione (H 2 O) n H trasferisce lo ione H ad una molecola di analita formando lo ione molecolare protonato [MH]. 33

Meccanismo Ioni Positivi L ago cattura elettroni formando ioni N 2, O 2, H 2 O (ioni primari). Gli ioni primari, aventi un tempo di vita molto breve, trasferiscono la carica al solvente, formando principalmente ioni H 3 O, NH 4, RH 2 O (ioni reagenti). Gli ioni reagenti trasferiscono la carica all analita, formando prevalentemente specie [MH]. 67 Meccanismo di formazione degli ioni positivi in APCI MH MH MH H 3 O ROH 2 N 2 O 2 e - e - e - e - NO NH 4 MH H 3 O MH H 2 O ROH 2 Alto voltaggio positivo Ioni primari (aria, tempo di vita 1 µsec) Ioni reagenti (solvente, tempo di vita 500 µsec) Ioni analita 68 34

Meccanismo Ioni Negativi L ago rilascia elettroni formando ioni O 3-, O 2-, NO 2-, CO 3- (ioni primari). Gli ioni primari, aventi un tempo di vita molto breve, trasferiscono la carica al solvente, formando principalmente ioni OH -, HCO 3-, RO - (ioni reagenti). Gli ioni reagenti trasferiscono la carica all analita formando prevalentemente specie [M-H] - 69 Meccanismo di formazione degli ioni negativi in APCI M-H - M-H - M-H - RO - O - 2 e - OH - RO - OH - O - O 3 - e - e- e - e - NO - 3 CO - 3 NO 2 - RO - OH - M-H - M-H - M-H - Alto voltaggio negativo Ioni primari ( aria, tempo di vita 1 µsec) Ioni reagenti (solvente, tempo di vita 500 µsec) Ioni analita 70 35

Meccanismo di formazione degli ioni in APCI Ioni positivi Ioni negativi Aria N 2, O 2, H 2 O N 2, O 2, H 2 O, CO 2 Scarica a corona 5-6 kv (elettroni) Ioni primari (1 µsec) Solvente (H 2 O, MeOH) N 2, O 2, H 2 O, NO O 2-, O -, O 3-, NO 2-, NO 2-, NO 3-, CO 3 - Ioni reagenti (500 µsec) (MeOH) n (H 2 O) n H MeO -, OH - analita (M) Ioni analita [MH] [M-H] - 71 Cono di skimmer lascia passare gli ioni eliminando tutto ciò che è neutro. Se in questa zona si aumenta la differenza di potenziale aumenta anche l energia cinetica degli ioni e quindi il numero di urti con le molecole di azoto; in conseguenza di ciò si ha una maggiore frammentazione dello ione primario. Quindi variando la differenza di potenziale tra 10 e 200 V è possibile controllare, entro alcuni limiti, la frammentazione dello ione della specie molecolare. Riassumendo, la sorgente APCI realizza il passaggio della sostanza in fase vapore in condizioni di temperatura non troppo elevate, in questo modo è possibile eseguire analisi di sostanze termolabili. Il limite di questa sorgente è rappresentato dal fatto che la ionizzazione deve avvenire sulle molecole in fase vapore. Quindi rientrano nel campo di utilizzo dell APCI molecole di basso peso molecolare, con polarità medio-alta e che non sono né acide e né basiche (se lo fossero non potrebbero essere portate efficacemente in fase vapore). 72 36

ESI vs APCI - Sensibilità Sensibilità relativa Flusso (µl/min) La ESI è sensibile alla concentrazione dell analita, la APCI alla sua quantità. Per questo l ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC. 73 APCI: sommario delle caratteristiche La APCI è adatta a composti anche non particolarmente polari, che possono essere in forma ionica in soluzione, ma non sono tipicamente acidi o basi forti. Il ph non ha una grossa influenza sulla risposta. La velocità di flusso utilizzabile in APCI va da 0.2 a 2 ml/min (un tipico flusso operativo è 1 ml/min). In APCI il parametro da fissare è la corrente di scarica, generalmente limitata a 2-3 µa. Questo valore induce un voltaggio sull ago paragonabile a quello normalmente impiegato per la ionizzazione elettrospray. La APCI non porta in nessun caso alla formazione di ioni multicarica. 74 37

Multimode Source ESI and APCI are very different processes and require very different conditions for optimum performance a single source with two electrically separated, optimized zones, one for ESI and one for APCI. Ionization takes place simultaneously in both zones and all ions are analyzed simultaneously by the mass spectrometer. 75 APPI Nuova interfaccia presentata nel 2000 da A. Bruins (University of Groningen, Netherlands): usa fotoni per ionizzare molecole gassose APCI modificata con lampada UV (Xe, Kr, 10 ev) al posto della corona A. Trasferimento di carica mediato da una sostanza dopante B. Trasferimento di un protone mediato dal dopante e solvente 76 38

77 APCI modificata: fotoni da lampada al posto degli elettroni da ago. Lampade UV forniscono fotoni con Energia superiore a potenziali di ionizzazione degli analiti, ma minore dei potenziali di ionizzazione dei gas atmosferici e dei solventi usati FORMAZIONE SELETTIVA DI IONI DEGLI ANALITI senza ionizzare solvente, quindi riducendo rumore di fondo. 78 39

Il meccanismo della fotoionizzazione deve avvenire in maniera tale da non ionizzare in maniera preponderante il solvente. Il meccanismo di fotoionizzazione diretto: M hν M e - è possibile, ma non dà un elevata percentuale di formazione di ioni, perciò spesso si ricorre all uso di un dopante (aumenta le prestazioni) che agisce sul meccanismo di ionizzazione. Chiaramente se non viene utilizzato il dopante il fotone colpisce direttamente l analita e ionizza o togliendo un elettrone oppure favorendo la cattura di un elettrone in caso di ionizzazione negativa. Per ionizzazione diretta si ha sempre la formazione di uno ione radicale come accade per tutte le reazioni di tipo fotochimico. Invece nel caso del dopante possiamo avere: 79 TRASFERIMENTO DI CARICA Il dopante presente in concentrazione preponderante rispetto all analita si ionizza formando uno ione dopante carico, che poi trasferisce la carica alla molecola di analita M (nel caso analita abbia Energia di ionizzazione più bassa di quella del dopante). h ν D D e- M e- D M D M e- 1. Un fotone colpisce una molecola del dopante D formando uno ione dopante carico. 2. Lo ione dopante carico interagisce con la molecola dell analita e si ha il trasferimento di carica formando uno ione radicale 80 40

h ν D TRASFERIMENTO DEL PROTONE Prevede la formazione di un cluster tra il solvente e il dopante ionizzato, il passaggio del protone avviene dal dopante alle molecole di solvente e dalle molecole di solvente alla molecola di analita (favorita per solventi con alta PA). D e- S S D S e- D-H S S H S S S H S M 1. La molecola dopante carica si mescola con il solvente LC formando una molecola di cluster carica. Il protone è poi trasferito al cluster del solvente per dare un cluster carico. 2. Il cluster del solvente carico interagisce con la molecola dell analita, trasferendo il suo protone e declusterizzando, creando una molecola protonata. MH S S S 81 IONIZZAZIONE NEGATIVA Fondamentale la presenza del dopante: tutte le reazioni di ionizzazione sono iniziate da elettroni termici prodotti dalla fotoionizzazione del dopante solventi con alta affinità elettronica positiva (es. alogenati) inibiscono ionizzazione perché catturano tutti gli e - termici in sorgente Cattura e - M e - M - per analiti con affinità elettronica positiva Trasferimento di carica O 2 e - O 2 - M O 2 - M - O 2 per analiti con affinità eletronica >0.45 ev (O 2 ) Trasferimento del protone M [S-H] - [M-H] - S per analiti con acidità in fase gas > del solvente 82 41

DOPANTE E una specie che si fotoionizza e poi cede la carica all analita. Acetone Toluene Anisolo In genere dopante viene aggiunto all uscita della colonna cromatografica utilizzando una pompa a siringa Alternativa: lavorare in cromatografia a fase normale (NP): vantaggio consiste nel poter utilizzare ad esempio il toluene (dopante) direttamente come componente della fase mobile 83 H 2 N NH 2 Cl NH 2 N pari massa pari, e - pari M massa pari, e - dispari (radicale) [M H] massa dispari, e - pari (ione) N dispari massa dispari, e - pari M massa dispari, e - dispari (radicale) [M H] massa pari, e - pari (ione) 84 42

Ambient desorption ionization techniques Consente l analisi diretta di oggetti in atmosfera aperta (laboratorio o loro ambiente naturale) 85 Desorption electrospray (DESI) A pneumatically assisted ion spray source is oriented at 45 towards a sample (deposited on holder of any material, conducting or non-conducting). The nitrogen spray is adjusted so as to have a linear speed of the droplets of about 35 m s 1 86 43

88 44

DESI utilizzato con successo per molecole piccole non polari o per molecole grandi polari (peptidi e proteine, multicarica). Applicazioni: farmaci, esplosivi, sezione di semi Anche per rilevare molecole di farmaci/droghe su superficie della pelle, es.: esposizione di un dito di un soggetto dopo somministrazione di 10 mg di antistaminico. 89 90 45

Cody et al., 2005 Determinazione diretta di composti su superfici, in liquidi e in gas senza preparazione del campione. He, N 2 Gas soggetto a fascio di e - con potenziale ad alto voltaggio fra i 2 elettrodi, con produzione di ioni, e - e specie neutre (eccitati). Plasma passa fra altri elettrodi che rimuovono tute le specie cariche e lasciando solo le specie neutre che poi interagiscono con campione e atmosfera. 91 DESI DESI: usa un solvente per generare agenti energetici che desorbono e ionizzano le molecole di analita DART DART: usa un gas per generare agenti energetici che 92 desorbono e ionizzano le molecole di analita 46

93 Il processo più semplice è la ionizzazione di Penning che comporta il trasferimento di E dal gas eccitato all analita, dando il radicale catione: G M M G e Un altro processo di ionizzazione (il principale se si usa elio) è il trasferimento del protone, che avviene quando atomi metastabili di He reagiscono con H 2 O dell atmosfera per produrre cluster di H 2 O ionizzata che possono protonare le molecole del campione dando [MH]. Ioni negativi formati per cattura di elettroni per presenza elettroni termici da ionizzazione di Penning. Ioni negativi anche prodotti da reazioni delle molecole di analita con ioni negativi da H 2 O e O 2 atmosferici [M-H] -. DART Produce [MH] o M (M-H] - o M - ), simile a DESI ma non produce ioni multicarica. 94 47

il campione è costituito da una banconota ecco il risultato! 95 DAPPI 96 48

PAPER SPRAY Fig. 5 An illustration of the paint spray ionisation process where analyte desorption is achieved by liquid extraction and a high voltage applied to the substrate creates a Taylor cone at the edge of the sample. The result is a mist of charged microdroplet... Martin R.L. Paine, Philip J. Barker, Stephen J. Blanksby Ambient ionisation mass spectrometry for the characterisation of polymers and polymer additives: A review Analytica Chimica Acta, Volume 808, 2014, 70-82 http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2013.10.001 Variants on paper-spray ionization: (a) leaf spray for the direct analysis of plant tissues and (b) tissue spray for direct spray ionization from a biopsy needle for biological tissue diagnostics. 49

Sorgenti di ionizzazione inorganiche Applicazione MS anche a composti inorganici e organometallici Ampiamente usata per caratterizzazione inorganica e analisi delle microsuperfici: EI per composti inorganici volatili, SIMS, FD, FAB, LD, ESI per non volatili Analysis of inorganic compounds by mass spectrometry. 1) EI spectrum of orthorhombic sulfur (S8). 2) ESI spectrum of Cr(CO)2(dpe)2. 99 Sorgenti di ionizzazione inorganiche Per analisi elementare: atomizzazione del campione (= trasformazione della materia solida in vapore atomico) e ionizzazione degli atomi avvengono in sorgente. Atomi sono poi ordinati e contati con l aiuto della MS. Decomposizione completa del campione nella sorgente nei suoi atomi costituenti necessaria, perché se incompleta avrei spettri troppo complessi, e distribuzione di ciascun elemento in differenti specie porta a diminuzione sensibilità. Quattro tecniche MS sono utilizzate per analisi in tracce multi-elementari di composti inorganici in diverse tipologie di campioni, con atomizzazione e ionizzazione del campione realizzate in diversi modi: 1. thermal ionization (TI) volatilizzazione da una superficie riscaldata 2. spark source (SS) attacco con scarica elettrica 3. glow discharge (GD) sputtering di ioni di gas rari 4. inductively coupled plasma (ICP) mass spectrometry vaporizzazione in una fiamma calda 100 50