Neuroscience Institute of the Cavalieri Ottolenghi Foundation Regione Gonzole 10, Orbassano (Torino)

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1 Neuroscience Institute of the Cavalieri Ottolenghi Foundation Regione Gonzole 10, Orbassano (Torino) per applicazioni in Life Science 10 Febbraio 2011 Immagini & Computer S.n.c. Via Don Carlo Riva Bareggio (Mi)

2 L analisi quantitativa delle immagini rappresenta l arte di trasformare una sensazione visiva nella sua forma schematica e discreta consentendone la descrizione, la classificazione e l interpretazione matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.

3 Quando e perché? Quando serve una rappresentazione oggettiva del risultato. Quando dobbiamo condividere i risultati con altri. Quando ci è richiesta una ripetibilità nei risultati ottenuti. Quando Perché risulta più professionale fornire numeri piuttosto che impressioni. Perché ci consente di discutere e difendere i nostri dati. Perché possiamo rivedere e ripetere passo-passo il processo che ci ha portato al risultato. Perché.

4 Un significativo contributo alla diffusione di questa disciplina è stato fornito dalla enorme disponibilità di strumenti digitali in grado di produrre informazioni in grande quantità. Microscopia widefield Microscopia confocale Microscopia spettrale Microscopia confocale 2 fotoni Sistemi HCS Investigazione contemporanea in più dimensioni. Elevata risoluzione spaziale Esplorazione temporale Complessità

5 Il percorso per arrivare alle misure

6 Il percorso ideale Risultati Misura Trattamento dell immagine Raccolta delle immagini Marcatura adeguata delle strutture Preparazione del campione

7 Risulta quindi basilare 1. Fissare gli obiettivi che ci proponiamo 2. Studiare e definire i metodi di preparazione del campione 3. Studiare e definire i metodi ed i processi di acquisizione, trattamento ed analisi da utilizzare (Protocolli di acquisizione ed analisi). 4. Ottimizzare e valutare i risultati Assicurare per quanto possibile l indipendenza dei risultati dalla piattaforma utilizzata.

8 Gli ostacoli sul percorso

9 Errore, precisione ed accuratezza Qualsiasi misurazione quantitativa è influenzata da potenziali errori. Gli errori possono derivare dal campione, dal sistema ottico (microscopio), dal sistema digitale di acquisizione o dall operatore. Gli errori diminuiscono il livello di precisione della misura. L accuratezza della misura influisce sulla affidabilità della singola quantificazione. Campioni biologici che possiedono un livello intrinseco di variabilità Necessità di effettuare una sola misurazione Errori Sistematici Capacità di identificazione e riduzione delle sorgenti di errore delle nostre misurazioni Errori Casuali Errore umano

10 Principali sorgenti di errore Marcatura adeguata delle strutture Preparazione del campione Rumore Background Sistema Ottico e di acquisizione Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Il segnale deve risultare significativamente più elevato del rumore. Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Deve essere sottratto al valore del segnale. Degrado delle caratteristiche dell immagine originale. Introduzione di aberrazioni ottiche e di fenomeni di diffrazione. Rumore Poisson (campione) Rumore ottico Rumore digitale (detector) Autofluorescenza. Fuori fuoco. Luce estranea PSF (funzione di diffusione luce) Aberrazioni sferiche e cromatiche Disallineamento (Chroma shift) Artefatti SNR Rapporto segnale rumore Errori sistematici Errori casuali

11 Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Rappresenta il rapporto tra i disturbi presente nell immagine e l effettivo segnale.

12 In un sistema di acquisizione basato su telecamera CCD il Rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come: SNR = PQet / [PQet + Dt + Nr 2 ] 1/2 Dove P rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Qe l efficienza quantica del sensore, t il tempo di integrazione (Secondi), D la Dark Noise (Elettroni/pixel/Secondo) e Nr il Read Out Noise. Il segnale proveniente dal Background (Scatter o Riflessione) influisce sulla qualità del valore di SNR e deve di conseguenza essere tenuto in considerazione nel calcolo. SNR = PQet / [(P+B)Qet + Dt + Nr 2 ] 1/2 In un sistema confocale il rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come: Dove N rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Q il noise generato dal laser, S il Noise secondario generato dalla moltiplicazione degli elettroni e D la dark current del PMT.

13 Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Il valore SNR può essere migliorato agendo su : Tecniche di riduzione del rumore Aumentando l intensità di illuminazione del campione Adeguata gestione del range dinamico Effettuando medie sulle immagini Tecniche di Image Restoration Utilizzando tempi di esposizione adeguati (CCD) Utilizzando le funzioni di binning (CCD)

14 Raccolta delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini. Rimozione del rumore Rilocazione della luce fuori fuoco Correzione degli artefatti Decadimento (Photobleaching,ect) Correzione disomogeneità fondo Instabilità di illuminazione Registrazione Mosaicatura Identificazione delle strutture Segmentazione Distinzione da altre strutture Codifica dei confini e misura Classificazione Pubblicazione Evoluzione e comportamento delle strutture Tracking Cinetica RatioImaging Data Mining Simulazione evento Creazione modello Analisi dei dati

15 La raccolta delle immagini

16 La raccolta delle immagini richiede una serie di accorgimenti quali : Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell evento) Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione) Qualità della ripresa Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini Standardizzazione del processo [Protocollo di acquisizione]

17 Come archiviare le immagini. Importante considerare la finalità per la quale si vuole archiviare l immagine. 1. Documentazione Soddisfatta la qualità visiva, le dimensioni del file rappresentano il principale obiettivo. I formati compressi con perdita di informazioni (Jpeg, Jpeg2000, ect) sono ampiamente giustificati. 2. Analisi successiva Necessità di preservare le informazioni originali contenute nell immagine. In questo caso sono da preferire i formati lineari non compressi o con compressioni di tipo lostless (Tiff, Bmp, ect) oppure i formati proprietari degli strumenti. No a formati ibridi (quali il Tiff - Palette)

18 I danni introdotti dai sistemi di compressione ad alta efficienza (Jpeg, Jpeg2000, ect) non sono immediatamente percettibili. Essi si manifestano sotto forma di pixellatura artificiale dell immagine.

19 I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante (5% - 10%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato. TIFF JPEG Differenza assoluta

20 Dinamica del segnale Il range dinamico descrive l escursione relativa della intensità del segnale (fluorescente) in osservazione Espresso come Flusso di Fotoni (fotoni / unità di sup. / Sec.) La dinamica dell immagine digitale è determinata dalle caratteristiche del dispositivo di acquisizione utilizzato. (PMT o CCD) Essa rappresenta il numero di valori discreti che compongono la scala numerica utilizzata per descrivere il segnale analogico nella sua forma digitale (Livelli di Grigio). Continuo Discreto

21 Dinamica del segnale La scala numerica (scala dei grigi) ha dimensioni standardizzate (256 GL, 4096 GL, GL, GL) Per i sensori CCD la scala numerica è determinata dal rapporto tra la capacità di immagazzinamento dei fotoni (FWC) propria delle singole celle ed il contributo dei rumori intrinseci da esso generati. (Read Noise, Termal noise, ect) Consideriamo un CCD con FWC pari a e con un Noise di 12 e. Il relativo RDD risulta : GrayLevels = / 12 = > [12 bit (4.096 GrayLevels)] FWC inversamente proporzionale alle dimensioni della singola cella CCD. L efficienza di conversione definisce il numero di fotoni descritto dal singolo livello di grigio. EC = FWC / GL (- Offset) EC = / 4096 = f

22 Dinamica del segnale Ottimizziamo la dinamica digitale dell immagine durante l acquisizione Segnale sovraesposto Aumentando l intensità di illuminazione del campione 80 %o Bilanciando adeguatamente guadagno PMT e potenza del laser 20 %o Utilizzando tempi di esposizione adeguati (CCD) Segnale sottoesposto Utilizzando le funzioni di binning (CCD) Isolare le zone sovraesposte

23 Campionamento La densità di campionamento stabilisce il numero di unità digitali di base (pixel o voxel) chedevono essere acquisite per unità di superfice / volume. In pratica definisce le dimensioni ideali del pixel / voxel nelle specifiche condizioni operative allo scopo di salvaguardare il contenuto informativo del campione. Z Y X

24 Campionamento La dimensione ideale del pixel / voxel, al di fuori del quale il processo di acquisizione può produrre artefatti, viene calcolata secondo il teorema di Nyquist-Shannon. La frequenza di campionamento di un segnale (Analogico ->Digitale) deve risultare più grande del doppio della bandapassante del segnale originale in modo da garantirne la perfetta ricostruzione digitale. Voxel Struttura La massima dimensione del pixel / voxel deve risultare inferiore alla metà del più piccolo oggetto o struttura presente nell immagine.

25 La dimensione del più piccolo oggetto o struttura presente nell immagine è equivalente al limite risolutivo del sistema ottico (e digitale) in uso. Calcolo Z secondo Nyquist Δ z = λ em / (2 N (1- cos α)) Λ em = emission wavelenght N = medium index α = ½ angolo apertura obiettivo Calcolo XY secondo Nyquist Δ xy = λ em / (4 N sen α) In pratica Λ em = 520nm N = NA = 1.3 α = αrcsen(na/n) Δ z = 520 /(2*1.515*(1-cos α)) Δ z = 353 nm Calcolatore Nyquist Un densità di campionamento inferiore al valore calcolato non è accettabile. Un minimo sovracampionamento non influisce sulla qualità delle informazioni. Un eccessivo sovracampionamento è inutile e spesso deleterio.

26 Risoluzione

27 Le molteplici risoluzioni di un sistema A. Risoluzione Ottica : limite di discriminazione tra due oggetti adiacenti. Determinato dalla apertura numerica dell obiettivo e dalla lunghezza d onda di emissione della luce. B. Risoluzione spaziale : limite di discriminazione del sensore CCD. Determinato dalle dimensioni della singola cella del sensore e dall ingrandimento dell obiettivo utilizzato. C. Risoluzione Immagine : caratteristica dell immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l immagine.

28 La risoluzione Ottica. La risoluzione ottica del microscopio è funzione della : lunghezza d onda della luce utilizzata. apertura numerica (N.A.) dell obiettivo. La risoluzione ottica del microscopio NON dipende dall ingrandimento dell obiettivo. La seguente formula, descritta per la prima volta da Ernest Abbe e Carl Zeiss, calcola il limite di risoluzione assoluto. R laterale = 0,61 λ em / N.A. (N.A.= n sen a ) R assiale = 2 λ em * n / N.A. 2 Si consideri che: Maggiore e l angolo (N.A.) con cui l obiettivo è in grado di raccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione Maggiore è N.A. minore è la distanza di lavoro Per obiettivi in aria a è sempre minore di 90

29 Risoluzione spaziale & Risoluzione discriminante La risoluzione spaziale rappresenta la dimensione, espressa in unità metriche, del più piccolo oggetto, proiettato sul piano di fuoco, identificabile come tale dal sistema di acquisizione. La risoluzione discriminante rappresenta la distanza minima, espressa in unità metriche, che deve intercorrere tra due oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben contrastati tra loro, per poter essere identificati come tali dal sistema di acquisizione.

30 Risoluzione spaziale In presenza di un dispositivo CCD, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni della singola cella del sensore (pixel size) e del ingrandimento dell obiettivo utilizzato secondo la formula:rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo) 4.6 um In presenza di un dispositivo PMT confocale, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni Pin Hole utilizzato (Airy unit), dal fattore di ingrandimento (zoom) e dal numero di pixels utilizzati per la matrice di acquisizione. L impostazione di questi parametri è strettamente dipendenti dai valori di densità di campionamento calcolati utilizzando la formula di Nyquist.

31 Risoluzione discriminante A causa delle caratteristiche fisiche del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra loro per poter essere discriminati come tali. Rd = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3) Esempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 100x Risoluzione spaziale = (6.4 / 100) = um ->(Pixel size / Ingrandimento) Risoluzione Discriminante = ((6.4 / 100) * 2.3) = um ->(Pixel size / Ingrandimento) * 2.3

32 Risoluzione Immagine Caratteristica dell immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l immagine. Da non confondere con i DPI x 768 pixel 2048 x 1536 pixel

33 Artefatti & affini

34 Principali sorgenti di errore Artefatti Rumore Campione Background Sistema Ottico e di acquisizione Fattore Umano Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Decadimento delle caratteristiche del segnale. Spessore del campione Errata marcatura Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Degrado delle caratteristiche dell immagine originale. Alterazione del contenuto informativo Rumore Poisson (campione) Rumore ottico Rumore digitale (detector) Photobleaching Quencing etc. Autofluorescenza. Fuori fuoco. Luce estranea Disomogeneità di illuminazione Acquisizione Valutazione PSF Aberrazioni sferiche e cromatiche Disallineamento Artefatti Errata scelta dei processi di manipolazione delle immagini Errori sistematici Errori casuali

35 Background Si aggiunge come costante al segnale Disomogeneità di illuminazione Regolando l offset del sistema si acquisizione Valutando il valore del background con immagini di riferimento Tipica dei sistemi Widefield Si risolve calibrando il sistema di illuminazione (centratura lampada e regolazione del Koeler). Correggendo attraverso immagine del background.

36 Decadimento caratteristiche del segnale Quencing : generato da processi che producono il passaggio degli elettroni dallo stato di eccitazione a quello di riposo senza emissione di luce. Questi processi competono con i classici processi fluorescenti riducendone il LIFETIME e la QY (emissione quantica) del fluoroforo utilizzato. Il processo di Quencing è reversibile. Photobleaching : Perdita permanente della capacità di emettere elettroni da parte del fluoroforo a causa di un danno chimico indotto. Una delle cause principali del Photobleaching è l interazione del fluoroforo con luce ed ossigeno (distruzione molecole fluorescenti con creazione di radicali liberi che interagiscono con altre molecole presenti nelle cellule). Tale effetto può essere contenuto riducendo la quantità di luce utilizzata per l eccitazione ed aggiungendo al media di montaggio appositi preparati Antifading. Il processo di Photobleaching non è reversibile. Fluoroforo : FITC Sorgente di eccitazione : HBO 100W Esposizione : 30sec Perdita del 50% del segnale

37 Disallineamento cromatico Errore sistematico caratteristico dei sistemi ottici (obiettivi). La luce monocromatica viene focalizzata su piani diversi in funzione della sua lunghezza d onda. Errore più consistente lungo asse Z. Risente delle condizioni meccaniche ed ambientali (temperatura) Utilizzo di obiettivi corretti cromaticamente. Misura sperimentale del disallineamento attraverso sfere fluorescenti. Correzione con ricalcolo dello stack

38 Degrado delle caratteristiche originali delle immagini La convoluzione è il processo ottico di creazione dell immagine. Esso introduce artefatti di vario genere con la conseguente degradazione dell immagine. 1. Rumore 2. Aberrazioni (sferiche e cromatiche) 3. Errata localizzazione della luce (sfocatura) A causa della profondità di campo dell obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell immagine. La profondità di campo identifica la porzione (o spessore) del campione i cui estremi rimangono simultaneamente a fuoco all interno della stessa immagine.

39 Degrado delle caratteristiche originali delle immagini La profondità di campo è funzione principalmente della apertura numerica della lente e della lunghezza d onda di emissione della luce utilizzata. La profondità di campo può essere espressa come : DoF= λn/na2 + (n/m NA)e Bkg Segnale S/N Prima conseguenza evidente è rappresentata dalla riduzione della risoluzione e del rapporto segnale / rumore all interno dell immagine.

40 Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini Image Restoration insieme di procedure e funzioni atte al recupero di un segnale (immagine) nella sua forma originale. Deconvoluzione 3D operazione matematica utilizzata per recuperare un segnale degradato da un processo fisico. Filtri spaziali lineari e non Filtri in domini di frequenza (FFT) Nessuna alterazione dell immagine (analisi quantitativa)

41 Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini Per ridistribuire correttamente la luce attraverso la deconvoluzione è necessario conoscere a priori il modello fisico che regola la diffusione della stessa nel sistema ottico in uso (descrittore della funzione di convoluzione). Tale modello fisico è conosciuto come PSF o Point Spread Function.

42 Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini (Fattore Umano) Filtri spaziali lineari e non Filtri in dominio di frequenza (FFT) I filtri operano trasformazioni (semplici o complesse) che modificano il contenuto informativo dei singoli pixel/voxel. I filtri lineari rimpiazzano il valore di ogni pixel con un valore ottenuto dalla valutazione dei pixel adiacenti (es. valore medio). Il filtro Gaussiano rappresenta il filtro lineare più utilizzato. Esso migliora l immagine riducendo il rumore casuale senza modificare il contenuto informativo. I parametri operativi dei filtri sono spesso richiesti in unità reali (micrometri) -> PSF

43 Semplificazione delle informazioni

44 Quale è la nostra base di partenza? Circa 1/3 del cervello umano elabora informazioni visive Percezione visiva dipende dal modo in cui vengono elaborate le informazioni luminose prodotte da fotoni che colpiscono la retina Elaborazioni diverse permettono di percepire aspetti diversi della visione: forme, colore, movimento, profondità. Elaborazione molto veloce e complessa : percezione simultanea di dettagli e di aspetti globali dell immagine. Visione Conoscenza Valutazione Comprensione della scena Informazioni Le principali prerogative del sistema visivo umano sono la rapidità di interpretazione, la capacità di adattamento alle variazioni presenti nella scena rispetto al modello noto e la possibilità di incrementare la conoscenza.

45 Quale è la nostra base di partenza? Immagine Ottica campione Sensore (CCD, PMT) Matrice bidimensionale di pixel ognuno dei quali rappresenta una specifica area del campione Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati. I livelli di grigio espressi dai singoli pixel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente area / volume del campione

46 Semplificare per identificare Proprietàdei pixel : Intensità (luminosità) Coordinate spaziali X,Y Identità ed iterazione con pixel adiacenti E evidente la difficoltà nell assegnare, sulla sola base delle proprietà sopra indicate, i singoli pixel ad una specifica classe di appartenenza (filamento, nucleo, membrana, fondo ect)

47 Identificazione delle strutture Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare Preservare il contenuto informativo Manipolazione dell immagine Segmentazione RegionGrowing Riconoscimento contorni (Edge detection) Binarizzazione

48 Riconoscimento dei contorni Si definisce contorno (edge) una forte variazione locale dei livelli di grigio tipicamente associata al bordo di una regione od al confine di separazione tra due regioni adiacenti. Per rilevare i contorni si ricorre al calcolo del gradiente di intensità, ovvero alla valutazione delle variazione dei livelli di grigio, ed al suo orientamento nell intorno del bordo da definire. Uno degli algoritmi più conosciuti è il LoG (Laplace ofgaussian) che determina il gradiente attraverso il calcolo della derivata seconda dei livelli di grigio. L area racchiusa dal contorno è riempita con un solo valore di grigio e considerata struttura (oggetto).

49 Riconoscimento dei contorni Il contorno può risultare chiuso ed identificare una specifica regione dell immagine (oggetto) oppure aperto e definirne solo una parte del confine. Uno dei principali motivi della mancata chiusura dei bordi è da ricondurre al basso contrasto esistente tra regioni dell immagine (es fondo ed oggetto). Anche la presenza di rumore sull'immagine (basso SNR) è causa di difficoltà nella rilevazione dei contorni (generazione di falsi bordi). Immagine Edge detection & linking Binarizzazione Ogni area racchiusa dal un contorno è riempita con un solo valore di grigio e considerata struttura (oggetto).

50 Segmentazione Tipicamente si tende a distinguere il fondo (background) dalle strutture di interesse. All interno dell intervallo di grigi si trova l oggetto, all esterno il fondo. Le tecniche di segmentazione sono sensibili ai vari artefatti presenti nell immagine (rumore, disomogeneità, ect). In presenza di strutture caratterizzate da intensità di fluorescenza differenti un unico intervallo di grigi non consente una perfetta identificazione delle stesse.

51 Segmentazione Adattiva Le tecniche di segmentazione adattiva permettono di calcolare l intervallo di grigio adeguato ad una zona specifica dell immagine in funzione delle caratteristiche locali del segnale (valutazione statistica). E possibile dividere l immagine in aree irregolari in base alle caratteristiche di omogeneità espresse localmente dal segnale.

52 Segmentazione Adattiva

53 Segmentazione Automatica Default Huang Intermodes IsoData Li MaxEntropy Mean MinError Minimum Moments Otsu Percentile RenyiEntropy Shanbhag Triangle Yen Basata su metodi di valutazione statistica del contenuto informativo

54 Segmentazione Automatica Huang Intermodes IsoData Li MaxEntropy Mean MinError Minimum Moments Otsu Percentile RenyiEntropy Shanbhag Triangle Yen

55 Segmentazione Tutti i pixel compresi nell intervallo di grigi definito e confinanti tra loro vengono assegnati alla stessa struttura. In questo caso le strutture vengono create accorpando tutte le aree tra loro confinanti secondo criteri impostati dall operatore. Tali criteri sono basati su caratteristiche morfologiche, statistiche, di tessitura della superficie o di omogeneità di segnale.

56 Crescita delle regioni (Region Growing) Proposto da Haralick, fa uso di descrittori statistici. Si basa sulla progressiva aggregazione di pixel in regioni connesse. Tale aggregazione avviene sulla base di uno o più criteri di similarità. Originale Massimo locale Crescita delle regioni Definizione strutture Partendo da un punto qualsiasi dell immagine (massimo o minimo locale) vengono aggregati tutti i pixel del suo vicinato che soddisfano i parametri statistici assegnati (es. media e varianza). La regione viene considerata completa (e non cresce più) quando tutti i pixel sono stati classificati (come aggiunta si possono valutare alcuni criteri ad essa associati (forma, dimensione, ect) oppure incontra un altra regione in crescita. La procedura è ripetuta per ogni punto aggiunto e le statistiche della regione vengono aggiornate ciclicamente.

57 Estrazione delle informazioni

58 Estrazione delle informazioni Possiamo ottenere qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente : Dimensioni Forma Posizione Area Perimetro Diametri Roundness Aspectratio Centroide XY

59 Estrazione delle informazioni Possiamo ottenere grandezze fisiche che descrivono il segnale presente : Intensità del segnale Variazione di segnale Distribuzione di segnale

60 Le misure di fluorescenza. Corretto il confronto tra strutture appartenenti allo stesso campo Incorretto il confronto diretto tra strutture appartenenti a campi / campioni differenti a causa delle: Impostazioni del sistema di acquisizione. (esposizione, eccitazione, ect) Stato del campione.(photobleaching, quencing, ect) Rumore, disomogeneità nella distribuzione del segnale, fuorifuoco, ect Condizioni ambientali

61 Le misure di fluorescenza e la calibrazione. Una delle possibili soluzioni consiste nel legare la misura di interesse con un riferimento che possa esprimere le eventuali variazioni dovute alle condizioni esterne al campione. Livello del fondo Auto fluorescenza die tessuti circostanti Segnali provenienti da strutture non influenzate dalle condizioni sperimentali Linea cellulare nota inserita nel processo di analisi Misure raziometriche (Ca 2+ ) Cellule non caricate e caricate a saturazione Caso reale Intensità dei telomeri normalizzata con intensità centromero prima del loro confronto. Entrambi marcati utilizzando lo stesso dye.

62 Le misure di fluorescenza e la calibrazione. La calibrazione del sistema di acquisizione garantisce la ripetibilità delle misure 100% Intensità relativa 33% Intensità relativa 10% Intensità relativa 3% Intensità relativa 0.667% Intensità relativa

63 3D: il mondo reale

64 Quale è la nostra base di partenza? 3 Dimensioni Immagine Ottica campione Sensore (CCD, PMT) Matrice tridimensionale di voxel ognuno dei quali rappresenta uno specifico volume del campione. Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati. I livelli di grigio espressi dai singoli voxel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente volume del campione.

65 Semplificare per identificare Proprietà dei voxel : Intensità (luminosità) Coordinate spaziali X,Y e Z Identità ed iterazione con voxel adiacenti E evidente la difficoltà nell assegnare, sulla sola base delle proprietà sopra indicate, i singoli voxel ad una specifica classe di appartenenza (filamento, nucleo, membrana, fondo ect) Iso Superficie

66 Costruzione delle Iso Superfici Le iso superfici rappresentano l equivalente 3D degli iso contorni. Entrambe descrivono una parte di volume, o di una area bidimensionale, all interno del quale tutti i punti (voxel) presenti possiedono un valore eguale tra loro o compreso in un intervallo definito Iso Superficie Iso Contorno Le iso superfici non hanno solo una valenza estetica ma risultano essenziali per la quantificazione del volume. Esse costituiscono il guscio che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini precisi.

67 Identificazione delle strutture Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare Preservare il contenuto informativo Manipolazione dell immagine Segmentazione RegionGrowing Iso Superficie

68 Costruzione delle Iso Superfici 1. Selezione dell intervallo di intensità del segnale (livelli di grigio) da descrivere attraverso la Iso Superficie. 2. Creazione matematica di una struttura complessa di forme geometriche (triangoli) che descrivono la superficie esterna del volume. 3. Trasformazione visiva della struttura complessa attraverso il loro riempimento.

69 Costruzione delle Iso Superfici Il livello di precisione nella ricostruzione della superficie è gestito attraverso il grado di interpolazione matematica con la quale vengono create le forme geometriche. Tanto più piccoli sono i triangoli tanto più dettagliata è la superficie. Di contro un grado di interpolazione troppo elevato tende, in presenza di interconnessione spaziale dei voxels bassa, a frammentare il volume più del necessario.

70 Quali informazioni di base possiamo estrarre? Qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente : Dimensioni Forma Segnale Posizione Volume Superficie Diametri Sfericità Intensità Baricentro X Y Z Spostamento Distanze tra comparti Distanze tra strutture Altro..

71 Le misure di intensità di segnale. Le iso superfici costituiscono il guscio che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini precisi. Struttura su canale n 3 Segnale canale n 1 Segnale canale n 2

72 Misure interattive Volume ricostruito Sezioni ortogonali Misure di distanza lineari e non tra punti nello spazio reale appartenenti al volume. Ausilio di metodi di visualizzazione 3D e determinazione automatica del punto di interesse (massima intensità) nella struttura. Le ISOSUPERFICI possono facilitare il compito.

73 Misure dimensionali, di forma e di intensità

74 Conteggio e misure dimensionali, di forma e di intensità Definizione delle Iso Superfici Divisione degli oggetti Selezione degli oggetti di interesse Classificazione delle strutture

75 Studio della interazione tra comparti cellulari Distanza vescicole Nuclei Colocalizzazione delle Vescicole (Intensità di un canale all interno del volume vescicolare) Distanza Vescicole Membrana Numero di Vescicole per nucleo Densità delle vescicole per nucleo Numero di vescicole per cellula Densità delle vescicole per cellule Volume delle vescicole per cellula Nuclei per Cellula Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma Distanza media vescicole Nuclei e vescicole vs Membrana Intensità delle vescicole per cellula

76 Studio Sinapsi posizionate sulla membrana cellulare Trasformazione delle cellule in Isosurface Trasformazione delle sinapsi in Isosurface sferiche (Spot) Selezione delle sinapsi (Spot) in contatto con membrana (Isosurface).

77 Colocalizzazione di oggetti Iterazione proteina proteina. Associazione spaziale di segnali Oggetti che risultano parzialmente in contatto o totalmente inseriti in altri oggetti.

78 Iterazione proteina proteina Definizione della intensità del segnale utilizzata per costruire le Iso Superfici. Divisione degli oggetti tramite region growing

79 Iterazione proteina proteina Estrazione dei dati di intensità di fluorescenza della proteina B (canale giallo) localizzata dentro i siti relativi alla proteina A (canale rosso). Classificazione per livello di intensità espresso.

80 Colocalizzazione di segnale Valutazione del livello di sovrapposizione spaziale di due segnali fluorescenti aventi caratteristiche spettrali (lunghezze d onda) di emissione differenti. L analisi della colocalizzazione richiede: 1. Basso livello di rumore 2. Segnali non saturati 3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleed through) 4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore) 5. Registrazione XYZ perfetta tra i due fluorocromi (shifting ottico) 6. Rimozione del fuori fuoco

81 Colocalizzazione di segnale Obiettivo : calcolo di coefficienti statistici atti a valutare il grado di sovrapposizione dei segnali Tra i più utilizzati : Coefficiente di Pearson - Misura la sovrapposizione tra i pixel Coefficienti di Manders - Misura il contributo di sovrapposizione di un canale rispetto all altro Coefficiente di correlazione -Misura il grado di correlazione tra i due canali si considerano inoltre : Numero di voxelcolocalizzati, volume sopra soglia colocalizzato, materiale sopra soglia materializzato..

82 Colocalizzazione di segnale Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale 17 pixel su40 presenti sono colocalizzati. Dato significativo o casuale? La risposta attarverso il calcolo del coefficiente di probalibità

83 Colocalizzazione di segnale Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale Il coefficiente di correlazione di Pearson viene calcolato su uno dei due canali (PCC 1). Il secondo canale viene sottoposto ad un processo di smoothing (PSF size). P = 0.97% P = 0.55% Successivamente i pixel che compongono il secondo canale vengono riposizionati nella matrice in tutte le combinazioni possibili ed i rispettivi coefficienti di Pearson calcolati. Il coefficiente di Pearson del primo canale viene confrontato con la distribuzione dei coefficientidi Pearson calcolati sul secondo canale. Se il coefficiente di Pearson del primo canale non è superiore al 95% della distribuzione ottenuta sul secondo canale la probabilità che la colocalizzazione sia casuale è reale. L immagine deve essere scartata.

84 Colocalizzazione di segnale Punto critico : definizione della soglia di colocalizzazione dei singoli canali Canale A Interpolazionelinear edeivalori Coefficientedi Pearson = 0 per valoridisogliainferiori a quelliimpostati CanaleB L algoritmo proposto da Costes e Lockett (NCI/NIH) si basa sulla esclusione delle coppie di intensitàche non mostrano correlazione (coefficientedi Pearson =< 0). Partendo dalla coppia di valori di intensità più alti, l algoritmo procede verso il basso della scala di intensità lungo la linea di interpolazione calcolata. Il coefficiente di Pearson viene calcolato per tutti i valori al di sotto della soglia corrente. L algoritmo procede fino a quando il coefficiente di Pearson raggiunge il valore 0 (o diventa negativo).

85 Colocalizzazione di segnale Canale A Interpolazione lineare dei valori Coefficiente di Pearson = 0 per valori di soglia inferiori a quelli impostati CanaleB

86 Informazioni in movimento Valutazione del movimento delle strutture (variazione della posizione) rispetto al tempo ed allo spazio. Determinazione della direzione, velocità, accelerazione e tipologia del moto di ogni singolo oggetto. Quantificazione delle modifiche strutturali (Dimensioni) e chimiche (intensità del segnale) in relazione al tempo.

87 Informazioni in movimento Browniano Connesso Autoregressivo r t a t b t a r r t c t d t b t e t e t c r E importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l algoritmo adeguato alla loro identificazione.

88 Informazioni in movimento Selezione (filtro) Statistica Rappresentazione

89 Analisi di filamenti Misurazione dell albero dendritico Identificazione delle spine e calcolo delle loro caratteristiche strutturali (volume, ect) Diametro dei filamenti. Statistica distribuzione spine Orientamento dendriti Analisi dei livelli dei branches (generazioni) Classificazione spine Stack 3D Definizione punto inizio Definizione punti massima intensità locale

90 Analisi di filamenti Soglia intensità di fluorescenza Calcolo diametro filamenti (proporzionale al segnale) Identificazione spine

91 Analisi di filamenti Estrazione misure Classificazione morfologica spine

92 Analisi di filamenti

93 Apertura al mondo esterno Programma IMARIS Piattaforme di analisi e calcolo

94 Alcuni lavori scientifici e testi interessanti La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D IMARIS

95 Immagini & Computer Snc Via Don Carlo Riva 4 Bareggio (Mi) GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE!