Università degli Studi di Verona Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione. Analisi quantitativa delle immagini

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1 Università degli Studi di Verona Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione Analisi quantitativa delle immagini 26 Marzo 2010 Aula Magna Gavazzi Facoltà di Medicina Verona Immagini & Computer S.n.c. Via Don Carlo Riva Bareggio (Mi)

2 L analisi quantitativa delle immagini rappresenta l arte di trasformare una sensazione visiva irrazionale nella sua forma schematica e discreta consentendone la descrizione, la classificazione e l interpretazione matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.

3 Il microscopio moderno è uno strumento di imaging multidimensionale in grado di visualizzare le strutture biologiche nel loro contesto spaziale naturale. 2D 3D Si è passati da una visione 2D fissa (dall alto perpendicolare al piano del campione) ad una visione 3D libera nello spazio dove l osservatore può posizionarsi in qualsiasi punto della scena (oppure ruotare la scena rispetto alla propria posizione).

4 Oltre alla reale rappresentazione del campione nello spazio, siamo oggi in grado di studiare altri parametri indispensabili per la comprensione dei comportamenti e dei processi biologici. Chimica (fluorescenza, lifetime) Cinetica (time-lapse) Sistemi Dinamici High Throughput Microscopio ottico Analisi quantitativa Biologia moderna Fisica (Fase, Polarizzazione) Struttura (spazio 3D) Sistemi Complessi High Contest Risultati

5 Dimensioni spaziali: Molteplici fattori quali la morfologia 3D, la localizzazione, l orientamento, le microstruttura e la connettività, influenzano il comportamento cellulare. Dimensioni chimiche: Sonde fluorescenti possono essere coniugate con elementi biochimici presenti in tessuti e cellule con una elevata specificità. Lo studio dei processi biologici a livello sub cellulare, delle interazioni proteina / proteina, e delle dinamiche intracellulari consente di monitorare attività biofisiche e biochimiche specifiche. Dimensioni temporali: Il comportamento cellulare e le dinamiche ad esso associate possono essere studiate nel tempo.

6 La visualizzazione e l esplorazione del campione. Il rendering del volume BLEND MIP SHADING PROJECTION Visualizza tutti i punti lungo l asse di osservazione (trasparenza) Visualizza punti più luminosi lungo l asse di osservazione Utilizza sorgenti di illuminazione artificiali Utilizza sorgenti di illuminazione artificiali (genera ombre) ISOSURFACE

7 La visualizzazione e l esplorazione del campione. Analisi statistica dei singoli canali (fluorocromi)

8 La visualizzazione e l esplorazione del campione. Esclusione di parte della struttura (clipping plane) Volume intero Tutte le informazioni a sinistra del piano di clipping sono nascoste Solo le informazioni relative al singolo canale a sinistra del piano di clipping sono nascoste

9 La visualizzazione e l esplorazione del campione. Creazione di sezioni arbitrarie (Slicer) Sezioni ortogonali Sezioni oblique Misura della distanza tra punti o strutture giacenti su piani ortogonali diversi Visualizzazione e valutazione di strutture ricostruite secondo un piano prospettico non originale.

10 Misure di distanza Misure di distanza lineari e non tra punti nello spazio reale.

11 Misure di distanza Distanza tra oggetti calcolata tra 2 punti localizzati sulla superfici esterne. Distanza tra oggetti calcolata tra i due centri dei volumi di interesse.

12 Il profilo di intensità Profilo di distribuzione della intensità di fluorescenza per singolo fluorocromo

13 Intensity Intensity Analisi quantitativa delle immagini Identificazione oggetti (Spot detection) D E A B C F Position Algoritmo di compensazione del background A B C D E F Position

14 Identificazione oggetti (region growing) Definizione dell intervallo di intensità che contiene gli oggetti.

15 Divisione oggetti (Spot splitting) Region Volume Il raggio del singolo spot è determinato sulla base del volume della regione a cui esso appartiene. Es. convesità o concavità della struttura, variazioni di intensità, ect. Region Border Il raggio dell oggetto è calcolato come la distanza minore dal centro verso il bordo

16 Quantificazione degli oggetti (Spot analysis) Esportazione dei risultati in Excel o su file Ascii. Calcolo del volume, della superfice, della Intensità media ed integrata e della posizione di ogni oggetto

17 Rappresentazione statistica delle misure

18 Creazione delle Isosuperfici

19 Creazione delle Isosuperfici Creazione della struttura wire frame Creazione della isosuperficie

20 Selezione e separazione degli oggetti Separazione degli oggetti che si toccano (region growing) Classificazione degli oggetti

21 Analisi cinetica Valutazione del movimento delle strutture (variazione della posizione) rispetto al tempo ed allo spazio. Determinazione della direzione, velocità, accelerazione e tipologia del moto di ogni singolo oggetto. Quantificazione delle modifiche strutturali (Dimensioni) e chimiche (intensità del segnale) in relazione al tempo. La valutazione delle variazioni di intensità del segnale in oggetti fermi non è considerata analisi cinetica.

22 Analisi cinetica tecniche di identificazione delle traccie Browniano Connesso Autoregressivo r t a t b t a r r t c t d t b t e t e t c r E importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l algoritmo adeguato alla loro identificazione e monitoraggio.

23 Analisi cinetica tecniche di identificazione delle traccie E altresi importante la capacità del programma di prevedere l evoluzione del moto degli oggetti nel tempo a venire per poter mantenere la traccia identificata.

24 Analisi cinetica analisi dei risultati Statistica Selezione (filtro) Rappresentazione

25 Analisi delle interazioni tra comparti cellulari Distanza Vescicole Nuclei Colocalizatione delle Vescicole (Intensità di un canale all interno del volume vescicolare) Distanza Vescicole Membrana (più vicina) Numero di Vescicole per Nucleo Densità delle vescicole per Nucleo Associazione Nucleo Cellula Numero di Vescicole per Cellula, Densità delle Vescicole per Cellule,, Volume delle Vescicole per Cellula Nuclei per Cellula Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma Distanza media Vescicole Nuclei and Vescicole Membrana (più vicina) Intensità delle Vescicole per Cellula

26 Analisi delle interazioni tra comparti cellulari Statistica Rappresentazione

27 Colocalizzazione Colocalizzazione di oggetti Colocalizzazione di segnale Oggetti che risultano parzialmente in contatto o totalmente inseriti in altri oggetti. Parti di strutture che mostrano una parziale o totale sovrapposizione con altre strutture differentemente marcate.

28 Colocalizzazione L analisi della colocalizzazione richiede: 1. Basso livello di rumore 2. Segnale non saturato 3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleedthrough) 4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore) 5. Registrazione perfetta tra i canali (verifica shifting ottico) Calcolo automatico della soglia di intensità per singolo canale. Channel A Fitted line along which algorithm proceeds PC=0 for voxels below thresholds Channel B

29 Analisi di filamenti Misurazione dell albero dendritico Identificazione delle spine e calcolo delle loro caratteristiche strutturali (volume, ect) Diametro dei filamenti. Statistica distribuzione spine Orientamento dendriti Analisi dei livelli dei branches (generazioni) Classificazione spine

30 Analisi di filamenti

31 Immagini & Computer Snc Via Don Carlo Riva 4 Bareggio (Mi) GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE!