TIRF-M: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

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1 TIRF-M: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Tecnica di Microscopia a fluorescenza Consente di eccitare molecole fluorescenti che si trovano in ambiente acquoso (cellula) vicine ad una superficie solida (vetro) e ad una distanza molto piccola (meno di 100 nm) L eccitazione della fluorescenza in questa regione (campo di evanescenza) consente di ottenere: Immagini con basso rumore di fondo Fluorescenza ben focalizzata Minima esposizione alla luce in altri piani della cellula (cellule vive)

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3 Teoria della TIRF Esaminiamo il caso in cui la luce attraversa un materiale trasparente (per esempio vetro) dopo aver attraversato il vuoto o l'aria. Il percorso subisce una rottura come mostra il disegno sottostante. θ(1) θ(2) Questo fenomeno è noto come rifrazione. n1.senθ(1)=n2.senθ(2) La legge di Snell è una formula che descrive le modalità di rifrazione di un raggio luminoso nella transizione tra due mezzi con indice di rifrazione diverso Un altro fenomeno molto noto è quello della riflessione della luce da parte di specchi piani.

4 acqua n=1.33 θ(2) θ(2) θ(2) vetro =1.52 θ(1) θ(1) θ(c) > θ(c) se: n(1)> n(2) θ(1) = θ(c) n(1). sen θ(c) =n(2) sen -1 θ(c) = n(2) / n(1) (c)= sen-1 n(2) / n(1) θ

5 Quando θ > θcrit non appare alcun raggio rifratto: la luce incidente subisce una riflessione interna totale ad opera dell'interfaccia. Esso è dato dalla relazione:, dove θ c è l'angolo critico, n 2 èl'indice di rifrazione del mezzo meno denso ed n 1 è l'indice di rifrazione del mezzo più denso. Nota: la riflessione interna totale si ottiene solamente se il raggio luminoso incidente si trova nel mezzo più denso. Se il raggio incidente è esattamente all'angolo critico, il raggio rifratto è tangente all'interfaccia nel punto di incidenza. considerando un raggio di luce che si propaga dal vetro al vuoto si ottiene un angolo critico di circa 41.

6 TIRF: cavi a fibre ottiche Le fibre ottiche sono costituite da un filo di vetro circondato da un altro vetro con indice di rifrazione poco diverso dal primo Un raggio luminoso che entra nella fibra entro un certo angolo caratteristico della fibra viene fatto rimbalzare per riflessione totale lungo tutta la lunghezza del cavo e così facendo arriva alla estremità opposta della fibra da dove esce

7 Indici di rifrazione Materiale n a λ=589,3 nm elio1, aria in condizioni normali1, anidride carbonica1, ghiaccio1,31 acqua (20 C)1,333 etanolo1,36 glicerina1,472 9 sale1,516 bromo1,661 vetro (tipico)da 1,5 a 1,9 diamante2,419 silicio3,4 fosfuro di gallio3,5 n è funzione della lunghezza d'onda della radiazione elettromagnetica e della natura del materiale attraversato, la sua misura in condizioni controllate può essere usata per identificare il materiale stesso

8 In TIRF si genera un'onda di superficie, o onda evanescente (evanescent wave), che decade esponenzialmente all'interno del mezzo con indice di rifrazione n2.

9 Intensità del campo di evanescenza all interfacie (z=0)

10 Profondità di penetrazione e angolo d incidenza La penetrazione è molto più alta ad angoli appena superiori a quello critico

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13 TIRF con obiettivi ad alta NA Numerical Aperture (NA) = n sin a/2 a= apertura angolare dell obiettivo Cellule con n=1.38 NA= 1.38

14 Applicazioni della TIRF Visualizzazione delle regioni contatto cellula substrato Visualizzazione di singole molecole fluorescenti vicine alla membrana (movimenti molecolari) Analisi cinetica dei granuli di secrezione (granuli dispersi di 2nm) Cinetica delle interazioni tra proteine extracellulari con recettori di superficie Turnover delle proteine Cinetica di variazione del volume cellulare( trasporto di acqua e soluti)

15 Imaging of single molecules

16 (a) Selective visualization of cell/substrate contact regions Protein interactions at the cell membrane surface Vinculin-GFP

17 Rac-GFP

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19 Texas red GFP-actin

20 EPI TIRF Tubulin

21 Cinetica di variazione del volume cellulare mediante TIRF Calcein-AM labs\lem--(calcein) = 494/517 nm (ph 8).

22 Cinetica di variazione del volume cellulare mediante TIRF

23 HELA cells at 10 C Henrietta Lacks Rat astro at 10 C 0 10 s

24 TIRF su fibre muscolari

25 Solute transport