Il microscopio: metodi per esaltare il contrasto

Transcript

1 Il microscopio: metodi per esaltare il contrasto La materia vivente è composta principalmente da acqua! Al microscopio risulta TRASPARENTE, se ha uno spessore tale da essere attraversata dalla luce. Altrimenti risulta opaca... Per questa ragione, quando è possibile, i campioni vengono sezionati e/o colorati. In molti casi, però, questo non è possibile o non è desiderabile. Si utilizzano, allora, metodi fisici per aumentare il pochissimo contrasto naturale dei campioni. Questo è possibile applicando delle combinazioni speciali di lenti, illuminazione, filtri ed altro al microscopio a luce trasmessa. Vedremo: Il microscopio in Campo Oscuro (o ultramiscroscopio) Il microscopio in Contrasto di Fase Il microscopio in Contrasto in Luce Polarizzata Il microscopio in Contrasto per Interferenza Differenziale

2 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro

3 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro Diaframma anulare

4 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro

5 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro Nel microscopio a campo oscuro si utilizza un condensatore speciale, o una speciale posizione del condensatore multifunzione, se presente. È possibile, anche, utilizzare uno speciale obiettivo, contenente un diaframma anulare. Illuminazione diretta Raggi rifratti Diaframma Anulare Diaframma Anulare nell'obiettivo

6 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro

7 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro

8 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro Bacillo dentale Cellule del sangue

9 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro Cellula epiteliale

10 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro Cellula epiteliale

11 Il microscopio: Microscopia in Campo Oscuro

12 Il microscopio: Microscopia in Contrasto di Fase Medium Citoplasma Nucleo

13 Il microscopio: Microscopia in Contrasto di Fase Diaframma anulare

14 Il microscopio: Microscopia in Contrasto di Fase

15 Il microscopio: Microscopia in Contrasto di Fase Allineamento del sistema diaframma/anello di fase

16 Il microscopio: Microscopia in Contrasto di Fase

17 Il microscopio: Microscopia in Contrasto di Fase Cellule epiteliali della mucosa boccale

18 Il microscopio: Microscopia in Contrasto di Fase Coltura di cellue HeLa La donna da cui origina la linea cellulare HeLa si chiamava Henrietta Lacks. Era sposata e madre di cinque figli quando morì nell'ospedale della John Hopkins University all'età di trentuno anni. Un campione delle sue cellule tumorali fu inviato a George e Maragret Gey che cercavano per motivi di studio una linea cellulare umana in grado di sopravvivere indefinitamente in coltura. Le cellule che ricevettero si mostrarono in grado di moltiplicarsi in maniera sorprendentemente efficiente e quindi, denominate HeLa dalle iniziali della donatrice, furono inviate a laboratori di tutto il mondo. Sono così diventate uno standard di laboratorio come cellule modello per esperimenti in vitro, arrivando ad esser coltivate anche nello spazio.

19 Il microscopio: Microscopia in Luce Polarizzata Il polarizzatore (1) si trova nel barilotto del condensatore presso il diaframma di apertura e la luce che lo attraversa diviene polarizzata linearmente, andando poi ad illuminare il preparato (3) attraversando le lenti del condensatore. L'analizzatore (5) è disposto dietro l'obiettivo - non troppo lontano dalla sua pupilla d'uscita ed ha un'angolazione di 90 rispetto al polarizzatore (1). La lente (6) forma, come di consueto, l'immagine intermedia (7). Se sul tavolino del microscopio non c'è un preparato - o c'è solo un vetrino portaoggetti vuoto e pulito - l'immagine sarà completamente scura, dato che l'analizzatore non consente il passaggio della luce che ha una polarizzazione ortogonale al proprio asse. Molte sostanze, però, quando vengono illuminate causano la rotazione della direzione di oscillazione della luce polarizzata, ruotando il piano determinato dal polarizzatore. In queste sostanze, dette "birifrangenti", l'indice di rifrazione dipende dalla direzione di oscillazione della luce incidente.

20 Il microscopio: Microscopia in Luce Polarizzata

21 Il microscopio: Microscopia in Luce Polarizzata

22 Il microscopio: Microscopia in Luce Polarizzata Sezione di osso di dinosauro

23 Il microscopio: Microscopia in Luce Polarizzata Cristalli di acido citrico fusi in via di solidificazione

24 Il microscopio: Microscopia in Luce Polarizzata

25 Il microscopio: Contrasto da Interferenza Differenziale (DIC) Prisma di Wollaston Si tratta di un dispositivo ottico, realizzato da William Hyde Wollaston, che è in grado di manipolare la luce, polarizzata o non polarizzata, producendo due raggi divergenti con polarizzazione ortogonale lineare. E' formato da due prismi di calcite orientati ortogonalmente fra loro e cementati (in genere con Balsamo del Canadà). I raggi emergenti divergono fra loro con angoli variabili in relazione agli angoli di costruzione dei prismi ed alla lunghezza d'onda della luce. Sono disponibili commercialmente con angoli di divergenza fra i 15 ed i 45.

26 Il microscopio: Contrasto da Interferenza Differenziale (DIC) Il percorso del raggio inizialmente è identico a quello del M.O. in luce trasmessa polarizzata. In aggiunta, due prismi birifrangenti (Wollaston) vengono inseriti nel condensatore e vicino alla pupilla dell obiettivo. Lente del tubo Analizzatore Lamina Prisma Wollaston Obiettivo Oggetto Condensatore Prisma Wollaston Polarizzatore Il prisma nel condensatore genera una decomposizione vettoriale della luce primaria polarizzata linearmente in due direzioni che sono perpendicolari l una all altra e muove lateralmente questi due raggi parziali tanto da causare uno spostamento laterale δx = k nel campione. è la lunghezza d onda della luce e k è una costante normalmente inferiore a 1. Se i due raggi parziali vedono condizioni minimamente differenti, entrambi esibiranno una differenza di percorso che si ripercuoterà fino all immagine intermedia. Il secondo prisma cancella il processo di scissione dietro l obiettivo, mentre l analizzatore seleziona quelle componenti che si trovano nella sua direzione di vibrazione.

27 Il microscopio: Contrasto da Interferenza Differenziale (DIC) d x x x

28 Il microscopio: Contrasto da Interferenza Differenziale (DIC)

29 Il microscopio: Contrasto da Interferenza Differenziale (DIC) DIC Contrasto di Fase

30 Il microscopio: Contrasto da Interferenza Differenziale (DIC) DIC Contrasto di Fase

31