Fasi dell analisi di dati da microarray (2)

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1 Fasi dell analisi di dati da microarray (). Image Processing: le immagini sono analizzate per determinare una misura dell intensità di ogni spot, insieme ad una valutazione della sua affidabilità. Data preprocessing and normalization: ha lo scopo di evidenziare le caratteristiche significative dei dati, oltre a consentire un corretto confronto tra le misure ottenute con diversi esperimenti.. Data mining: le misure di espressione genica ottenute sono confrontate al fine di individuare i geni differentemente espressi nei tessuti in esame. Tutte queste tre fasi richiedono l impiego di metodi statistici o di tecniche di machine learning. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Le immagini ottenute dallo scanner a luce laser consistono di una matrice di spot, che può risultare confusa o parzialmente rovinata. Un metodo di image processing deve anzitutto scegliere la risoluzione e la profondità di colore con cui effettuare la lettura. Image processing () Marco Muselli ioinformatica Funzionale

2 Image processing () Poiché ogni pixel offre una misura dell intensità dello spot nell area occupata, un valore troppo basso della risoluzione conduce ad una misura distorta. In genere, si richiede che il diametro di uno spot sia almeno pixel. La profondità di colore consente di apprezzare le differenze tra le intensità dei vari pixel. Una scelta accettabile normalmente usata consiste nell impiegare bits/pixel, pari a livelli di grigio. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Image processing () La fase di image processing consiste dei seguenti quattro passi: Spot finding: localizza gli spot all interno dell array Image segmentation: separa i pixel dello spot in tre gruppi, segnale, background, altro. Quantification: calcola un valore rappresentativo per il livello del segnale e per quello del background di ogni spot. Spot quality assessment: genera una misura dell affidabilità dei valori ottenuti per ciascuno spot. Nell analizzare i vari passi ci soffermeremo principalmente sui punti che richiedono l impiego di tecniche di tipo statistico. Marco Muselli 0 ioinformatica Funzionale

3 Spot finding () Sebbene a livello teorico la posizione degli spot dovrebbe essere fissata a priori, numerosi problemi di ordine tecnico contribuiscono a creare imperfezioni e distorsioni. Occorre pertanto identificare gli spot ponendo un cerchio attorno ad ognuno di essi. Sono usati i seguenti tre modi:. Manuale: attraverso un programma CD l utente identifica al meglio gli spot (occorre un tempo proibitivo con molti geni);. Semi automatico: l utente impone una griglia sull immagine e un programma trova le posizioni corrette degli spot (possibilità di correzione manuale in caso di errore);. utomatico: impiega algoritmi di computer vision per individuare gli spot nell array. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Spot finding () Marco Muselli ioinformatica Funzionale

4 Image segmentation () Una volta individuati gli spot, occorre decidere quali pixel formano lo spot (segnale da rilevare), quali fanno parte del background e quali sono da considerarsi derivati da rumore. tale scopo sono impiegati i seguenti metodi:. Pure spatial based signal segmentation: non esegue alcuna analisi statistica. Intensity based segmentation: sceglie i pixel del segnale in base alla loro intensità (nessuna statistica). Mann Whitney segmentation: applica il test di Mann Whitney per individuare il segnale. Combined intensity spatial segmentation: applica un approccio statistico sia per il segnale che per il background Marco Muselli ioinformatica Funzionale Image segmentation () Spot Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale

5 Image segmentation () Spot Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale Image segmentation () Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale

6 Image segmentation () Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale Pure spatial based signal segmentation () Il metodo più semplice per eseguire l image segmentation (pure spatial based signal segmentation) consiste nel posizionare due cerchi attorno ad ogni spot. I pixel che cadono all interno del cerchio più interno sono da considerarsi parte del segnale, mentre quelli al di fuori del cerchio più esterno sono inclusi nel background. I pixel inclusi tra i due cerchi fanno parte della zona di transizione e sono scartati per aumentare la qualità del risultato. Pro: semplicità. Contro: difetti (ad es. polvere) e distorsioni (spot non circolari) provocano errori non riparabili. Marco Muselli ioinformatica Funzionale

7 Pure spatial based signal segmentation () Spot Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale Pure spatial based signal segmentation () Spot Marco Muselli 0 ioinformatica Funzionale

8 Pure spatial based signal segmentation () Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale Intensity based segmentation () Un altro approccio (intensity based segmentation) suppone che i pixel del segnale siano in media più chiari del background. Se ogni spot ha un diametro di circa 0 pixel ed è inserito in una regione di 0x0 pixel, risulta che circa il 0% dei pixel fa parte del segnale. Si possono allora ordinare i pixel secondo il valore crescente dell intensità e considerare l ultimo 0% di essi come facente parte del segnale. Pro: semplice e veloce; funziona bene se gli spot hanno intensità elevata rispetto al background. Contro: se l array è sporco o rumoroso, pixel con intensità nel 0% superiore sono considerati segnale anche se sono lontani dal centro dello spot. Marco Muselli ioinformatica Funzionale

9 Intensity based segmentation () Spot Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale Mann Whitney segmentation () Un test statistico può essere impiegato per individuare i pixel del background e del segnale. Un metodo non parametrico come il test di Mann Whitney è più adeguato in quanto i dati non sono distribuiti in modo normale. Si itera il seguente procedimento:. Prendi a caso pixel del background e gli pixel del presunto segnale con intensità minore.. Se dal valore della statistica U di Mann Whitney non risulta che i due insiemi differiscono significativamente, elimina il pixel del segnale con valore minimo. Pro: funziona bene se lo spot è correttamente individuato. Contro: non tiene conto di artefatti o rumore nel background; in tal caso, il valore di soglia può essere troppo elevato. Marco Muselli ioinformatica Funzionale

10 Mann Whitney segmentation () pplicazione all analisi dello spot : ackground Segnale Valore Rank.. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Set n = n =, N = T = (somma rank di ) = T = (somma rank di ) = <T > = n (N+)/ = <T > = n (N+)/ = σ = (n n (N+)/) / =. z = (T <T > 0.)/σ =. Per il livello di significatività 0.0 deve essere z >.. La soglia risultante è 0.. Mann Whitney segmentation () Spot Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale

11 Combined intensity spatial segmentation () I due approcci impiegati dal pure spatial based e dall intensity based segmentation possono essere fusi tra loro. In questo modo, prima viene imposto un cerchio delimitante lo spot e successivamente il % dei pixel con valore più elevato (background) o più basso (segnale) vengono eliminati. lternativamente o in cascata può essere applicato il test di Mann Whitney, sia partendo dal background che dal segnale evitando così di imporre una percentuale arbitraria. Pro: risente meno della corretta individuazione dello spot; è in grado di rimuovere vari tipi di artefatti. Contro: richiede un numero consistente di pixel per la valutazione statistica. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Combined intensity spatial segmentation () Spot Spot Marco Muselli ioinformatica Funzionale

12 Quantification () Una volta isolati i pixel del segnale e del background bisogna identificare un singolo valore che offra una misura del livello di espressione del gene associato. I valori comunemente usati sono: Intensità totale del segnale: somma dei valori dei pixel nella regione del segnale; dipende dalla quantità di DN depositata sullo spot e dal rumore per cui è raramente usata. Intensità media del segnale: media dei valori dei pixel nella regione del segnale; è una buona misura se la segmentazione è stata fatta correttamente. Non dipende dalla quantità di DN. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Quantification () Mediana dell intensità del segnale: valore che divide a metà la densità dei pixel nel segnale; a differenza della media, la mediana è resistente agli outliers. Moda dell intensità del segnale: valore più probabile nella densità dei pixel del segnale; è robusta come la mediana se la densità è unimodale. Differenza tra segnale e background: i valori suddetti possono anche essere calcolati guardando alla differenza tra segnale e background; in questo modo di eliminano errori sistematici legati allo spot. Rapporto tra le intensità dei due canali: non dipende dall esatta quantità di DN depositato. Marco Muselli 0 ioinformatica Funzionale 0

13 Quantification () Spot Pure spatial Intensity Mann Whitney Combined ackgr. ackgr. ackgr. ackgr. Totale Media Mediana Moda Diff. medie Diff. mediane Diff. mode 0. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Quantification () Spot Pure spatial Intensity Mann Whitney Combined ackgr. ackgr. ackgr. ackgr. Totale Media Mediana Moda 0. Diff. medie Diff. mediane Diff. mode Marco Muselli ioinformatica Funzionale

14 Spot quality assessment () Oltre alla misura del livello di espressione genica è importante conoscere la sua affidabilità. tale scopo occorre derivare un valore che indichi la qualità dello spot prodotto. Possibili scelte sono le seguenti: Rapporto tra area del segnale e area dello spot: l area dello spot è data dai pixel del segnale (area del segnale) e da quelli ignorati (dovuti ad artefatti o rumore); minore è tale valore, minore è la qualità dello spot. uona misura di affidabilità. Regolarità della forma: rapporto tra il numero di pixel del segnale e il numero totale dei pixel all interno del cerchio. Misura quanto è deformata la regione del segnale rispetto all attesa forma circolare. Marco Muselli ioinformatica Funzionale Spot quality assessment () Rapporto tra area e perimetro del segnale: è massimo per il cerchio; misura quanto è deformato lo spot rispetto alla forma circolare attesa. Simile al valore precedente. Spostamento (displacement): misura la distanza del centro dello spot dalla posizione attesa, (spostamento sulla griglia). Uniformità dello spot: dato da (rapporto varianza/media dell intensità del segnale); è necessario dividere per la media perché in tal caso la varianza può essere più elevata. Tutte le misure suddette sono normalizzate tra 0 e ; un valore minore indica una peggiore qualità della misura. Si può anche usare una somma pesata delle quantità suddette che rifletta l importanza data dall utente alle varie misure. Marco Muselli ioinformatica Funzionale