Nuove acquisizioni sull uso degli induttori di resistenza per una produzione sostenibile delle colture

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1 Nuove acquisizioni sull uso degli induttori di resistenza per una produzione sostenibile delle colture Rita Milvia De Miccolis Angelini Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti, sezione di Patologia Vegetale Università degli Studi di Bari ALDO MORO Approcci sostenibili e nuove tecnologie a supporto del consulente do campo Bari 25 ottobre 218

2 Induzione di resistenza delle piante alle malattie Meccanismi molecolari alla base del fenomeno Induttori di resistenza: alcuni esempi Principali fattori che possono influenzarne l efficacia Casi studio: applicazione dell analisi trascrittomica per lo studio di alcuni induttori di resistenza

3 Beneficial Microrganismi microorganisms benefici Rizosfera Rizosfera Endosfera Fillosfera Stress abiotici Ambientali, non biologici Temperature (elevate/basse) Acqua (eccesso/carenza) Salinità Radiazioni Contaminanti chimici Resistenza indotta Stress biotici Patogeni Insetti Altre piante/competizione Funghi Virus Batteri Nematodi

4 Chester K.S. (1933). The problem of acquired physiological immunity in plants. Quarterly Rev. Biol. 8: , Ross A.F. (1961). Systemic acquired resistance induced by localized virus infection in plants. Virology 14: Elliston J.E., Kuc J., Williams E.B. (1971). Induced resistance to bean anthracnose at a distance from the of the inducing interaction. Phytopathology 61: Hammerschmidt R., Acres S. and Kuc J. (1976). Protection of cucumber against Colletotrichum lagenarium and Cladosporium cucumerinum. Phytopathology 66: Kuc J. (1982). Induced immunity to plat disease. Bioscience 32: Hammerschmidt R. (1999). Induced disease resistance: How do induced plants stop pathogens? Physiol. Mol. Plant Pathol. 55:77-84.

5 [Signal transduction pathways] MAMP/PAMP Triggered Immunity (MTI/PTI) Effector Triggered Immunity (ETI) Systemic Acquired Resistance (SAR) Elicitori: MAMPs (Microbe-Associated Molecular Patterns ) PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) DAMPs (Damage-Associated Molecular Patterns) Sostanze chimiche naturali o di sintesi

6 Segnale Risposta di ipersensibilità via di trasduzione del segnale via di trasduzione del segnale Resistenza acquisita Patogeno Proteina R Effettore

7 Resistenza sistemica acquisita (SAR) Resistenza sistemica indotta (ISR) Acido jasmonico (JA) Acido salicilico (SA) Etilene (ET) PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) Biotrofi Necrotrofi/ Simbionti Pieterse et al. 29. Networking by smallmolecule hormones in plant immunity. Nat Chem Biol. 29 May;5(5):38-16

8 Systemic Acquired Resistance (SAR) Rhizobacteria-mediated Induced Systemic Resistance (ISR) Beta-Amino-Butyric Acid-Induced Resistance (BABA-IR) Volatile Organic Compound-Induced Resistance (VOC-IR)

9 I segnali di allerta sono amplificati e trasmessi all intera pianta grazie a acido salicilico (SA), acido jasmonico (JA), etilene (ET) e acido abscissico (ABA), oltre che fosfoinositide (PI), acido dicarbossilico diazelaico (AzA), glicerolo-3-fosfato e alcuni diterpeni. I tessuti indotti sono in uno stato di allerta (priming) che permette risposte più pronte e potenziate a stress biotici o abiotici. Le cellule indotte accumulano proteine segnale di difesa, come protein-chinasi.

10 Effettori Effettori Accumulo di proteine segnale inattive (Mitogen-activated Protein Kinase, MPK) Stimoli che inducono PRIMING Modificazioni nella struttura della cromatina (metilazione e acetilazione degli istoni) Stress MAMPs/PAMPs/DAMPs Stress MAMPs/PAMPs/DAMPs Facilitano l espressione di geni di difesa (WRKY) a seguito dell esposizione a un fattore di stress Conrath U Molecular aspects of defence priming. Trends Plant Sci. 16(1):

11 Llorens et al Advances in induced resistance by natural compounds: towards new options for woody crop protection. Sci. Agric. 74:9-1.

12 Sostanza Data di approvazione Elicitori Chitosano cloridrato 1/7/214 Fruttosio 1/1/215 Eptamalossiglucano 1/6/21 Laminarina 1/3/218 Mild Pepino Mosaic Virus isolato VC 1 29/3/217 Mild Pepino Mosaic Virus isolato VX 1 29/3/217 Pepino Mosaic Virus ceppo CH2 isolato 196 7/8/215 Saccarosio 1/1/215 Zucchini Yellow Mosaik Virus, ceppo debole 1/6/213 Attivatori vegetali Benzothiadiazolo 1/4/216 Cerevisane 23/4/215

13 Assenza di attività antimicrobica diretta; assenza di metaboliti con attività antimicrobica Le piante trattate sono resistenti ad un ampia gamma di malattie come nell induzione biologica Induzione degli stessi processi biochimici preinfezionali attivati sistemicamente da induttori biologici

14 Plant resistance induction in olive

15 Flussi ionici dovuti alla depolarizzazione del plasmalemma (Ca2+) Produzione di specie reattive dell ossigeno (ROS), di ossido nitrico (NO) Attivazione di protein chinasi Modulano l attività di fattori di trascrizione che determinano una profonda riprogrammazione della trascrizione genica

16 Accumulo di vari enzimi e metaboliti stress-specifici, quali: Pathogenesis-related (PR) proteine che includono enzimi litici (β-1,3-glucanasi e chitinasi), perossidasi, proteinasi; produzione di ROS con ruolo di segnale e attività antimicrobica composti antimicrobici, come le fitoalessine; lignina e callosio che rinforzano le pareti cellulari chiusura degli stomi

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18 Induttore di resistenza Pianta Approccio trascrittomico Riferimenti bibliografci Laminarina Vite Analisi Northern blot e saggi qpcr Aziz et al. 23; Mol Plant Microbe Inter. 16:1118 Acido β-aminobutirrico (BABA) Vite Saggi qpcr Dubreuil-Maurizi et al. 21; Mol Plant Microbe Interact. 23:112 Proteina PemG1 di Magnaporthe grisea Arabidopsis Saggi qpcr Peng et al. 211; Mol Plant Microbe Interact. 24:1239 Trichoderma harzianum T39 Vite Analisi RNA-Seq (sequenziamento Illumina) Perazzolli et al. 212; BMC Genomics. 13:66 Trichoderma harzianum T39 e benzothiadiazole Vite Saggi qpcr Banani et al. 213; Plant Pathol. 63:334 Benzothiadiazole e Chitosano Fragola Analisi RNA-Seq (sequenziamento Illumina) Landi et al. 217; Front Plant Sci. 8:235 Chitosano and acido salicilico Arancio dolce Analisi RNA-Seq (sequenziamento Illumina) Coqueiro et al. 215; BMC Genomics 16:288 Cryptogein Tabacco cdna-aflp e qpcr Hoeberichts et al. 213; Plant Physiol. 163:263 Acido β-aminobutirrico (BABA) Patata Analisi microarray dei trascritti su scala genomica Bengtsson et al. 214; BMC Genomics. 15:315 Phosphiti Patata Analisi microarray e qpcr Burra et al. 214; BMC Plant Biol. 14:254

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20 L approccio su larga scala dell espressione genica può essere cruciale per comprendere gli effetti degli elicitori sul metabolismo della pianta ed i meccanismi attivati da specifici induttori di resistenza Metodiche: Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Sequenziamento di Expressed Sequence Tags (ESTs) Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Microarrays RNA-Sequencing (RNA-Seq)

21 Esperimento RNA-Seq 1. Raccolta dei campioni: A ciascun tempo da piante trattate e non trattate N. 5 foglie/frutti per pianta Purificazione dell mrna Frammentazione dell mrna Sintesi della prima elica di cdna 2. Estrazione di RNA totale Sintesi della seconda elica di cdna Riparazione estremità e adenilazione 3 Legame degli adattatori St N T St 3. Preparazione di librerie di cdna Arricchimento in PCR Validazione della libreria 5 3 1

22 4. Sequenziamento NGS e analisi dei dati Sequenziamento (Illumina, Single Reads, 5 cicli) Analisi bioinformatica

23 5. Analisi RNA-Seq Fragaria vesca genome Allineamento sul genoma di riferimento Quantificazione dei livelli di espressione genica (RPKM) Vitis vinifera (12x) PN424 genome: bp annotated genes (V1): Analisi di espressione differenziale (FC 2)

24 6. Analisi funzionale Analisi di arricchimento per i termini di Gene Ontology (GO): per rilevare categorie di processi biologici, funzioni molecolari e componenti cellulari significativamente sovra-rappresentati (FDR.5) in set di geni differenzialmente espressi con l utilizzo di Blast2GO v.2.8 ( Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG): per identificare processi metabolici significativamente arricchiti con l utilizzo di KOBAS ( PAGEMAN in MapMan 3.5.1R2: per esplorare classi funzionali di geni della pianta (

25 Metodi: biosaggio di induzione di resistenza B. cinerea Piante di vite (Vitis vinifera, cv Italia) allevate in condizioni controllate di serra sono state trattate con Cerevisane o acqua (controllo non trattato) [No. 3 trattamenti con intervalli di 7 giorni]. Inoculazioni con patogeni fungini 24 h dopo il terzo o il secondo trattamento. P. viticola E. necator Campioni di foglie sono state raccolte a 1, 3 e 7 giorni dopo il primo e il terzo trattamento. Per ciascun tempo di campionamento e trattamento, tre campioni di foglie replicate sono state raccolte sia dalle piante trattate che dalle piante controllo.

26 4 I sintomi della malattia sono stati rilevati a 4, 7 e 19 giorni dopo l inoculazione (DAI) Classe Superficie infetta Superficie sana Macchie Macchie Macchie 4 fino al 25% % % %

27 Diffusione e gravità della malattia Plasmopara viticola Trattamento Diffusione(%) 7 DAI MKI (%) 7 DAI Diffusione(%) 11 DAI MKI (%) 11 DAI Controllo non trattato 23.3 a 1.7 a 38.5 a 14.9 a Cerevisane 3.7 b.8 b 9.4 b 2.6 b Botrytis cinerea Trattamento Diffusione(%) 7 DAI MKI (%) 7 DAI Diffusione(%) 13 DAI MKI (%) 13 DAI Controllo non trattato 91.8 a 2.6 a 91.8 a 22.1 a Cerevisane 96.6 a 25.1 a 96.6 a 26.9 a Erysiphe necator Trattamento Diffusione(%) 21 DAI MKI (%) 21 DAI Diffusione(%) 28 DAI MKI (%) 28 DAI Controllo non trattato 32.9 a 5.8 a 33.6 a 7.3 a Cerevisane 37.2 a 7. a 37.2 a 9.3 a Data followed by the same letters are not statistically different according to Duncan s Multiple Range test at probability levels P=.5.

28 % Risultati: dati RNA-Seq e allineamento su genoma di vite Sequenze totali (Reads) 344 M (17.2 Gb) Reads per campione 27-3 M Coverage 12x Geni 31,845 Transcritti 55,564 Unmapped reads 4% Intergenic regions 5% Intronic regions 3% Exon-exon junctions 14% EXP1 Exonic regions 74% Intergenic regions 3% Unmapped reads Intronic regions 3% Exon-exon junctions 14% 5% EXP2 Exonic regions 75% Mapped Unique Multimatch

29 Geni differenzialmente espressi (DEGs) (FC 2 FDR.5) 59 Up Primo trattamento 3185 Terzo trattamento giorni Primo trattamento Terzo 622 trattamento Down

30 Geni differenzialmente espressi (DEGs) (FC 2 FDR.5) Up Patogeno Pv Bc En Down

31 Piante trattate vs non trattate Primo trattamento Geni sovra-espressi Geni sottoespressi 1,99 1,276 1 day (T1) days (T2) days (T3) ,

32 Attivazione di processi biologici Piante Trattate vs Non Trattate Geni sovra-espressi

33 Risposte di difesa via di segnale mediata da acido jasmonico via di segnale mediata da acido salicilico

34 Trasporto

35 Morfogenesi e sviluppo

36 Fotosintesi

37 Livello di di espressione (RPKM) Chlorophyll A/B (CAB)-binding proteins L Controllo non Trattato trattato Controllo Trattato Piante trattate Primo trattamento Terzo trattamento Indotti anche da trattamenti con SA Crosstalk tra difesa e altri pathway di segnale Light-harvesting chlorophyll protein complex Geni che codificano CAB-binding proteins sono indotti in modo specifico in genotipi di vite resistenti a peronospora

38 Respirazione

39 Processi metabolici

40 Piante Trattate vs Non Trattate Geni sotto-espressi

41 Livello Expression di espressione level (RPKM) (RPKM) Livello Livello Class IV chitinase (PR3) Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Controllo Trattato up Primo trattamento Terzo trattamento Tempo di campionamento Sampling time (Days (giorni after dopo treatment) il trattamento) down Piante inoculate 2.6 down Pv Bc En Patogeno Pathogen Glicosil idrolasi che catalizzano la degradazione della chitina, polimero della parete cellulare dei funghi. Le chitinasi sono sintetizzate in risposta a stress biotici e abiotici.

42 Livello Expression level (RPKM) Livello di espressione (RPKM) Livello Pathogenesis-Related protein 1 (PR1) Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Controllo Trattato Primo trattamento Terzo trattamento 9.1 down up up Tempo di campionamento Sampling time (Days (giorni after dopo treatment) il trattamento) Piante inoculate 2.3 down 3.9 down Pv Bc En Patogeno Pathogen L espressione del gene PR1 è regolata da acido salicilico durante le risposte di difesa della pianta

43 Livello Expression level (RPKM) Livello di espressione (RPKM) Livello Glucan endo-1,3-beta-glucosidase-like (PR2) Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Controllo Trattato up down Primo trattamento Terzo trattamento 5 4 Piante inoculate Tempo di campionamento Sampling time (Days (giorni after treatment) dopo il trattamento) Pv Bc En Pathogen Patogeno Idrolizzano i legami ß 1-3 D glucosidici della parete cellulare dei funghi e conferisce resistenza nelle piante. Gene marker della via dell acido salicilico.

44 Livello Livello Expression di espressione level (RPKM) (RPKM) Livello Pathogenesis-Related protein 4 (PR4) Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Controllo Trattato up Primo trattamento 3.5 up Terzo trattamento down Piante inoculate Tempo di campionamento Sampling time (Days (giorni after dopo treatment) il trattamento). Pv Bc En Patogeno Pathogen Associato a resistenza sistemica acquisita, a risposte di difesa nei confronti di batteri, funghi, virus, erbivori ed etilene. Gene marker della via dell acido jasmonico.

45 Livello Livello Expression level (RPKM) Livello di espressione (RPKM) Salicylate O-methyltransferase Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Controllo Trattato up Primo trattamento Terzo trattamento 3.2 up 3.5 up down Piante inoculate Tempo di campionamento Sampling time (Days (giorni after treatment) dopo il trattamento). Pv Bc En Pathogen Patogeno Coinvolto nella sintesi di methyl salicylate (MeSA), un composto organico volatile (VOC), sintetizzato a partir da acido salicilico (SA), componente chiave del segnale a cascata che attiva le risposte sistemiche di difesa delle piante.

46 Livello Livello Livello di espressione (RPKM) Nonspecific 1 3 lipid 7 transfer 1 protein 3 (nsltp) 7 (PR-14) Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Controllo Trattato up 2.5 up 15 1 Primo trattamento Terzo trattamento Piante inoculate Pv BBc OEn Tempo di campionamento (giorni dopo il trattamento) Patogeno In Vitis vinifera nsltps sono fortemente e rapidamente indotte da molecole segnale correlate alla difesa, quali ergosterolo e elicitori purificati da Botrytis cinerea, acido jasmonico, colesterolo e sitosterolo. Sono indotte anche a seguito di infezione di patogeni. Promuovono la permeabilizzazione delle membrane delle cellule dei patogeni ma non della pianta ospite manifestando tossicità nei confronti di batteri e funghi patogeni.

47 Livello di espressione (RPKM) Livello d 5 Livello d 5 8-hydroxyquercetin 8-O-methyltransferase Controllo Trattato Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Primo trattamento Terzo trattamento 3. up 4. up 52.1 up Piante inoculate 21.3 up 9. up 14. up Pv P BBc En O Tempo di campionamento (giorni dopo il trattamento) Patogeno Catalizza la biosintesi di pterostilbene da resveratrolo. Gli pterostilbeni hanno proprietà sia antifungine che farmacologiche

48 Expression level (RPKM) Livello di espressione (RPKM) Livello d 5 Livello d 5 LRR receptor-like serine threonine-protein kinase GSO Controllo Trattato Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane up 2.6 up Primo trattamento Terzo trattamento up Piante inoculate Tempo di campionamento Sampling time (Days (giorni after dopo treatment) il trattamento) Pv Bc En Patogeno Pathogen Variazioni nell espressione del gene GSO1 in piante di Citrus aurantifolia infette da Candidatus Phytoplasma aurantifolia

49 Livello di espressione (RPKM) Livello di espressione (RPKM) Livello di espress Cytochrome P45 Primo trattamento Terzo trattamento 7.5 up 16.6 up 9.5 up 1 up 1 Livello di espress down Piante inoculate 7.6 up 9.5 up Controllo Controllo Controllo non trattato Trattato Trattato Piante trattate con Cerevisane Tempo di campionamento (giorni dopo il trattamento) Patogeno Superoxide dismutase 2.5 up 2.3 up Primo trattamento Terzo trattamento Tempo di campionamento (giorni dopo il trattamento) Piante inoculate Pv Bc En Patogeno Pathogen

50 Livello di espressione (RPKM) Livello d 5 Livello d 5 Polyphenol oxidase Controllo Trattato Controllo non trattato TrattatoPiante trattate con Cerevisane Primo trattamento Terzo trattamento 2. up 3.5 up 2.8 down Tempo di campionamento (giorni dopo il trattamento) down Piante inoculate Pv Bc En Patogeno Pathogen Tali enzimi sono coinvolti in processi di ossido-riduzione e di biosintesi di cumarina, lignina, alcaloidi, pigmenti, oltre che nel metabolismo di tirosina e riboflavina.

51 Genotipo dell ospite Precedente esposizione ad agenti inducenti Stato nutrizionale Stadio fenologico ed età delle piante Fattori ambientali Integrazione nei programmi di protezione con altri mezzi di controllo Tempi, frequenza e modalità dei trattamenti

52 Valutare l efficacia di cerevisane nei confronti di Plasmopara viticola ed i cambiamenti trascrizionali in diverse cultivar di Vitis vinifera Cabernet Sauvignon Merlot Red Globe Chardonnay Italia Pinot bianco

53 TRATTAMENTO con Cerevisane (.5 g/l) (3 ml/pianta) APPLICAZIONE di ACQUA DISTILLATA (CONTROLLO NON TRATTATO) (3 ml/pianta) 2 trattamenti ad intervallo di 7 giorni (14 e 21 luglio 216)

54 INOCULAZIONI ARTIFICIALI DI P. VITICOLA 24 ore dopo il secondo trattamento 6x1 4 sporangi/ml 1 ml/pianta

55 Indice di Abbott (%) EFFICACIA DEL TRATTAMENTO 1 4 giorni dopo l inoculazione (DAI) 7 DAI 1 DAI Controllo Cerevisane Cabernet Sauvignon Merlot Red Red Globe Italia Pinot bianco Chardonnay Cultivar

56 GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI (DEGs) (FC 2 ; FDR.5) DEGs totali Analisi di espressione genica differenziale Sovraespressi Sottoespressi up down CS CS Me CS Me CS Me Rg Rg Me Rg It ItRg Pi It PiIt Ch Pi ChPi Ch Ch CS ME RG IT up down PB CH up down Rg CS It Me Pi Rg Ch CS It Me Pi Rg Ch It Pi CS Ch Me Rg CS It Me Pi Rg Ch It Pi Ch up down up downup 14 up down down 69 up down 153 up down

57 Fold Change Fold Change Fold Change -6 Fold Change CS ME RG IT PB CH CS Me Rg It Pi Ch Set PROFILI DI ESPRESSIONE GENICA CS Me Rg It Pi Ch Set CS Me Rg It Pi Ch Set A A B B C A C D E F G H I L M N B D E F G H I L M N O P Q R C O P Q R

58 Processi metabolici FC Cabernet Sauvignon Merlot Red Globe Italia Pinot blanc Chardonnay

59 FC Risposte a stress Cabernet Sauvignon

60 Acido Salicilico Acido Jasmonico Etilene Segnale ormonale Categorie funzionali 4 FC 3,7 PR-1 (VIT_23s88g81) Salicilato O-metiltransferasi FC 4,6 (VIT_24s23g223) via di segnale dell JA Metabolismo secondario FC 4,5 Metabolismo della fenilalanina Biosintesi dei fenilpropanoindi FC 3,4 Biosintesi degli stilbeni PR-4 (VIT_214s81g3) Biosintesi dei flavonoidi Biosintesi dei flavoni CS Me RG It Pi Ch ethylene-responsive transcription via di segnale dell SA e SAR Proteine di resistenza alle malattie -3 FC 3-4 Stress ossidativo Cellulosa sintasi -1 CS 3,1 factor (VIT_29s2g675) Me RG It Pi Ch PR-2 (VIT_27s5g93) 7 2 Laccasi -2 via di segnale dell SA Tioredossina (TRX) 3 6 FC 6 Proteine RPP Glutaredossina (GRX) Proteine RGA Glutatione-S-transferasi (GST) 1 Proteine RPS 4 Galactinolo sintasi (GOLS) CS Me RG It Proteine 2 Perossidasi Pi (Biosintesi Ch 3 della lignina) -1 Proteine 26-1 CS Me RG It Pi Ch Processi Fotosintetici Fattori trascrizionali associati allo stress 1-3 Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding WRKY -4-1 CS Me RG It Pi protein) Ch NAC -5-2 Fotosistema I AP2/ERF -6 FC -5,3 Fotosistema II

61 Segnalazione ormonale Acido Salicilico Acido Jasmonico Etilene Proteine di resistenza alle malattie Cellulosa sintasi Laccasi Proteine RPP Proteine RGA Proteine RPS Proteine 2 Proteine 26 Fattori trascrizionali associati allo stress WRKY NAC AP2/ERF Categorie funzionali FC 6,9 PR-5 (VIT_22s25g423) Metabolismo secondario Metabolismo FC 3,7 della fenilalanina Biosintesi dei FC fenilpropanoindi 3,4 Biosintesi degli stilbeni Biosintesi dei flavonoidi Biosintesi dei flavoni CS Me RG It Pi Ch Stress ossidativo Tioredossina (TRX) PR-1 (VIT_25s77g157) Glutaredossina (GRX) FC 3,6 Glutatione-S-transferasi (GST) Galactinolo sintasi (GOLS) Perossidasi (Biosintesi della lignina) Processi Fotosintetici TAUMATINE Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding protein) Fotosistema I Fotosistema II CS Me RG It Pi Ch

62 Categorie funzionali Segnalazione ormonale Acido Salicilico Acido Jasmonico Etilene Proteine di resistenza alle malattie Cellulosa sintasi Laccasi Proteine RPP Proteine RGA Proteine RPS Proteine 2 Proteine 26 Fattori trascrizionali associati allo stress WRKY NAC AP2/ERF Metabolismo secondario Metabolismo della fenilalanina Biosintesi dei fenilpropanoindi Biosintesi degli stilbeni Biosintesi dei flavonoidi Biosintesi dei flavoni Stress ossidativo Tioredossina (TRX) Glutaredossina (GRX) Glutatione-S-transferasi (GST) Galactinolo sintasi (GOLS) Perossidasi (Biosintesi della lignina) Processi Fotosintetici Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding protein) Fotosistema I Fotosistema II

63 fenilalanina ammonio-liasi (VIT_216s39g136) FC 4,9 FC 5,5 CS Me RG It Pi Ch stilben sintasi 4 (VIT_216s1g86) FC 7 FC 5,2 CS Me RG It Pi Ch

64 BIOSINTESI DEI FLAVONOIDI 5 4 FC 4,1 Flavonoide 3 -idrolasi 2 flavonoide 3 -idrolasi 2(VIT_26s9g281) CS Me RG It Pi Ch -2

65 Segnalazione ormonale Acido Salicilico 3 Acido Jasmonico 2 Etilene CS Me RG It Pi Ch Proteine di resistenza alle malattie Cellulosa sintasi -4 Laccasi -5 Proteine RPP Proteine RGA Proteine RPS Proteine 2 5 FC 4 Proteine 264 Fattori trascrizionali associati allo stress WRKY NAC AP2/ERF glutathione S-transferase (VIT_28s4g92) Categorie funzionali FC 2,9 lignin biosynthetic peroxidase (VIT_212s28g184) FC 3,2 FC -3,9 CS Me RG It Pi Ch Metabolismo secondario Metabolismo della fenilalanina Biosintesi dei fenilpropanoindi Biosintesi degli stilbeni Biosintesi dei flavonoidi Biosintesi dei flavoni Stress ossidativo Tioredossina (TRX) Glutaredossina (GRX) Glutatione-S-transferasi (GST) Galactinolo sintasi (GOLS) Perossidasi (Biosintesi della lignina) Processi Fotosintetici Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding protein) Fotosistema I Fotosistema II

66 Categorie funzionali Segnalazione ormonale Acido Salicilico Acido Jasmonico Etilene Proteine di resistenza alle malattie Cellulosa sintasi Laccasi Proteine RPP Proteine RGA Proteine RPS Proteine 2 Proteine 26 Fattori trascrizionali associati allo stress WRKY NAC AP2/ERF Metabolismo secondario Metabolismo della fenilalanina Biosintesi dei fenilpropanoindi Biosintesi degli stilbeni Biosintesi dei flavonoidi Biosintesi dei flavoni Stress ossidativo Tioredossina (TRX) Glutaredossina (GRX) Glutatione-S-transferasi (GST) Galactinolo sintasi (GOLS) Perossidasi (Biosintesi della lignina) Processi Fotosintetici Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding protein) Fotosistema I Fotosistema II

67 Segnalazione ormonale Acido Salicilico Acido Jasmonico Etilene FC 16,9 complesso di raccolta della luce II proteina LHCB1 (VIT_21s3g289) CS Me RG It Pi Ch FC -3,8 fotosistema II proteina D1 (VIT_213s19g263) FC 1 FC 4,3 FC 4,4 CS Me RG It Pi Ch FC 3,1 FC -3 FC -5,5

68 Genotipo dell ospite Precedente esposizione ad agenti inducenti Stato nutrizionale Stadio fenologico ed età delle piante Fattori ambientali Integrazione nei programmi di protezione con altri mezzi di controllo Tempi, frequenza e modalità dei trattamenti

69 Giorni dopo l inoculazione Inoculazione di P. viticola Giorni dopo il trattamento

70 Le prove svolte in serra hanno evidenziato l efficacia di Cerevisane nei confronti di peronospora ma non verso oidio e muffa grigia. Biosaggio non idoneo? Cerevisane induce in vite la sovra-espressione di geni coinvolti nelle risposte di difesa a stress biotici e abiotici e riduce l espressione di geni coinvolti nei fenomeni di crescita e sviluppo delle piante. Cerevisane attiva vie metaboliche dipendenti da segnali dovuti sia a SA che a JA/ET. E evidente una comunicazione bidirezionale fra via metaboliche attivate da diversi segnali ormonali e relative a meccanismi di difesa.

71 I meccanismi di difesa attivati da Cerevisane variano nelle cultivar di vite. Alcuni dei processi di difesa indotti da Cerevisane sono gli stessi che sono noti essere responsabili della resistenza in genotipi di vite resistenti a Peronospora. Valutazioni sui tempi di attivazione delle risposte di difesa nella pianta e dell efficacia a seguito dei trattamenti può aiutare ad ottimizzare l utilizzo degli induttori di resistenza.

72 Prima della raccolta, BTH (benzothiadiazole), chitosano e acqua (controllo) sono stati applicati alla parte aerea di piante di fragola (Fragaria ananassa, cv Alba; 2n=8 =56) durante la maturazione dei frutti I frutti sono stati raccolti a 6, 12 e 24 h dopo il trattamento. Per ciascun campionamento, tre campioni replicati di 2 frutti uniformi sono stati raccolti sia dalle piante trattate che dal controllo

73 6h Sovra-espressi 12h Sotto-espressi 6h 12h Complessivamente, 562 e 521 geni sono stati identificati come differenzialmente espresso (DEGs) [fold change (FC), 2] in frutti di fregola trattati con BTH e chitosano rispettivamente. 6h 24h 12h 6h 24h 12h Circa l 8% di questi geni era modulato da entrambi gli elicitori. I DEGs più altamente regolati dagli elicitori aumentano nel tempo FC 8: 6 hpt 12 hpt 24 hpt 24h 24h BTH 4.6% 3.6% 5.1% 1.5% 8.9% 6.5% chitosan 2.5% 3.% 4.7% 4.9% 8.8% 6.9%

74 Fotosintesi Metabolismo ormonale - etilene Stress abiotici e abiotici Metabolismo delle proteine Segnale/trasporto

75 Elicitori

76 L uso degli induttori di resistenza è una strategia innovative che elicita il naturale sistema di difesa della piante e protegge le colture dai patogeni. Lo studio dei meccanismi indotti dagli elicitori su colture di interesse è ancora poco studiato. C è la necessità di comprendere questo processo a livello molecolare per ottimizzare l efficacia dei trattamenti. Le metodiche di analisi più innovative possono essere di ausilio per queste indagini. Scopo a medio-lungo termine: ottimizzazione dell uso di Cerevisane, BTH, chitosano e di altri induttori di resistenza in strategie di protezione integrata mirate a migliorarne la sostenibilità.