Qualità del frutto: strategie molecolari per il monitoraggio dei geni coinvolti. Gaetano Perrotta
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- Ippolito Marchi
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1 Qualità del frutto: strategie molecolari per il monitoraggio dei geni coinvolti Gaetano Perrotta
2 Principali Caratteristiche del Frutto Elevata variabilità Forma Pigmentazione Consistenza Sapore/Aroma Elementi nutrizionali Durante la maturazione: Modificazione dell ultrastruttura della parete cellulare Conversione dell amido in zuccheri Aumenta la suscettibilità a patogeni Biosintesi e accumulo di pigmenti Aumentano i livelli dei composti volatili
3 Mappa Genetica Clonaggio Posizionale Gene tagging transposoni T-DNA Caratterizzazione Molecolare Interazioni proteinaproteina Sistema del doppio ibrido Genomica/bioinformatica Sequenziamento Analisi di Espressione Manipolare l assetto genetico per il migloramento delle specie coltivate
4 Dogma Centrale L espressione dell informazione genetica raccolta nelle molecole di DNA, avviene in due stadi: (i) trascrizione, durante la quale il DNA è trascritto in mrna (ii) traduzione, durante la quale l mrna è tradotto per produrre la proteina associata DNA mrna protein
5 Materiale Vegetale X MISS USB35 Tratti evidenziati + MAYA Produzione incrementata Gusto eccellente Frutto rosso, brillante e luminoso Periodo di conservazione più lungo Queen Resistente agli stress ONDA
6 Caratteri quali-quantitativi Genotipo Consistenza del frutto (g)* SSC** TA***Produttività**** Queen Miss USB Maya Onda Fonte: Monografia di cultivar di fragola Faedi et al. (2003) *: test penetrometrico (diametro 6mm) **: contenuto solidi solubili ( Brix) ***: acidità titolabile (meq (100 g-1)) ****: produttività totale (g/pianta)
7 DNA Chip I DNA chip o microarrays sono costituiti da centinaia (o migliaia) di microgocce di DNA depositati su un supporto generalmente costituito da un vetrino da microscopio (ogni spot rappresenta un gene). La miniaturizzazione che ne deriva, consente di fare analisi su scala genomica o subgenomica. Il DNA immobilizzato sul vetrino puo essere utilizzato in reazioni di ibridazione o in altre reazioni enzimatiche. I DNA microarrays sono si solito utilizzati per il monitoraggio dell attività trascrizionale su scala genomica o sub-genomica.
8 Microarray di Fragaria ESTs selezionate Geni candidati Geni controllo 10 Spot triplicati 3 x 1870 = 5610 spots
9 cdna Microarrays mrna AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA Fluorescent probe Hybridize
10 Schema sperimentale Comparative Profiling Analisi dei dati Miss / USB35/Maya /Onda (Test) Estrazione RNA totale Queen (controllo) Scanning Laser 1 Laser 2 Emissione Cy5 Cy3 Sintesi cdna fluorescente Immagine rossa + Immagine verde Test/Controllo > 2 Test/Controllo = 1 Ibridazione Test/Controllo < 0.5
11 Espressione differenziale dei geni Miss,USB35, Maya e Onda vs. Queen Miss vs Queen USB35 vs Queen Maya vs Queen Onda vs Queen snrna exp4 UKN3 UKN4 1-aminociclopropano Cel1 UKN5 UKN6 Apx bhlh tubulina EST00001 F1 ATPase UKN1 UKN2 Hsp2 ethylene dioxygenase peptidilprolil isomerasi aux-r caseina CAD Hsp Geni CCR SAAT Log 2 Ratio
12 I geni CCR e CAD sono rispettivamente sovra- e sotto espressi nei frutti molli p-coumaroyl-coa CCR Cinnamoyl-CoA reduttasi Aldehydes CAD Cinnamyl alcohol deidrogenasi Monolignol alcohols Flavonoids Stilbenes Lignin
13 Il gene Alcohol Acyl Transferase (AAT) è sottoespresso nella cv Queen
14 Profiling del frutto in maturazione in pomodoro Microarray con geni di pomodoro Frutto immaturo / Foglia Frutto Breaker / Foglia Frutto rosso / Foglia
15 Profiling Trascrizionale di Pomodoro in Maturazione fotosintesi ripening parete cellulare proteine DNA/RNA difesa funzione sconosciuta stress metabolismo primario regolazione
16 Considerazioni conclusive Questi risultati dimostrano che il profiling trascrizionale in cultivar dalle caratteristiche differenti permette di identificare geni o famiglie geniche potenzialmente coinvolti nell espressione di caratteri qualitativi del frutto. L efficacia di questo approccio è proporzionale alla rappresentatività del microarray.
17 Genomica Bioinformatica Trascrittomica Proteomica Metabolomica Identificazione dei fattori genetici coinvolti nell espressione di caratteri qualitativi
18 Partecipanti: F. Carbone - Tesista L. Caracciolo - Tesista F. Giorno - Contrattista F. Mourgues - Borsista C. Rosati - Ricercatore Trisaia Trisaia Trisaia Trisaia Trisaia Collaborazioni: G. Giuliano Casaccia W. Faedi I.S.F. Forlì
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