Applicazione di tecnologie innovative per il monitoraggio dell esposizione ambientale. Bologna, 25 Giugno 2009

Transcript

1 Applicazione di tecnologie innovative per il monitoraggio dell esposizione ambientale Bologna, 25 Giugno 2009

2 Perché innovative? Tecnologie che trovano le loro basi dal sequenziamento del genoma umano/altri organismi Studiano il comportamento di tutto il genoma in un singolo esperimento Integrano competenze di scienze biologiche, informatica ed ingegneria TECNOLOGIE

3 Spazi omici 1%-2% del nostro DNA è funzionalmente attivo mrna Profilo metabolico + Tutti i geni di una cellula o di un tessuto

4 Tossicogenomica Applicazione delle tecnologie genomiche alla tossicologia l effetto avverso di molecole presenti nell ambiente o di principi attivi farmaceutici Valutare l effetto in termini di pericolosità e meccanismo d azione Analizzare la risposta a dosi differenti Monitorare e classificare composti tossici Studiare la variabilità individuale

5 Interesse verso tecnologie tossicogenomiche Genomics task force white paper USA EUROPA Regolamento (CE) 1907/2006 (REACH) Punto 40. La Commissione, gli Stati membri, l'industria e gli altri soggetti interessati dovrebbero continuare a contribuire alla promozione, a livello internazionale e nazionale, di metodi di prova alternativi, tra cui metodologie assistite da computer, appropriate metodologie in vitro, metodologie basate sulla tossicogenomica e altre metodologie pertinenti.

6 Trascrittomica Tra i vari approcci di tossicogenomica l analisi dei profili trascrizionali è lo spazio omico piu studiato ed attualmente anche il piu promettente per l individuazione di biomarcatori da utilizzare nello screening dei cancerogeni e nel monitoraggio ambientale Perchè? mrna si può copiare/amplificare Diverse tecnologie per depositare su supporto solido le sequenze che riconoscono l mrna di un gene (collezioni miniaurizzate) Avanzamento della microscopia in fluorescenza Sviluppo di sistemi di analisi statistica ed interpretazione biologica dei dati

7

8 Modelli cellulari Umani Murini Batterici Mammella PBMC Polmone Colon Fegato Cervello BALB/c 3T3 V. fisheri

9 Analisi trascrizionale:microarray Esposizione della cellula al composto in esame Estrazione RNA Retrotrascrizione e marcatura con sonde fluorescenti ANALISI della VARIAZIONE di ATTIVITA GENICA

10 CTP-Cianina Le cianine presentano una struttura data da 2 indocianine eterocicliche unite da un ponte polimetinico: Cy 5 e Cy3 differiscono per la struttura di questo ponte. Cy3 e Cy5 sono più fotostabili di altri marcatori fluorescenti. Mostrano una buona separazione spettrale quindi sono eccitate a λ differenti e la loro emissione può essere rilevata separatamente. Questo richiede 2 laser separati e filtri ottici opportuni. Cy3 e Cy5 danno un forte segnale fluorescente e possono sopportare le temperature e le condizioni normalmente presenti in laboratorio.

11 La slide da microarray Migliaia di geni spottati (probes) su un unico supporto (slide o chip)

12 Piattaforma Agilent Un laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elio-neon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5. Carosello a 48 posizioni Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione Software di Feature Extraction: calcolo della log(ratio) dei segnali nel rosso e nel verde associando, ad ogni valore, un errore che verrà utilizzato per calcolare un p-value finale, PVlog(ratio)

13 LABORATORIO MATER ARPA Bologna O 3 : 5µg/m 3

14 Analisi dei dati di microarray I dati ottenuti dalle singole slide vengono sottoposti ad analisi statistica: Gene Spring GX Reference design Dose 1 Dose 2 NT Dose 3 Dose 4 Interpretazione biologica dei dati: meccanismo d azione

15 Validazione. Diverse piattaforme/protocolli Molteplici sistemi di analisi statistica dei dati di microarray Differenti tool di interpretazione biologica La standardizzazione dei protocolli è un requisito fondamentale per definire la qualità dei dati di microarray Procedure operative standard, con sistemi di controllo intermedi: dalla manipolazione dei campioni fino all output dello scanner. Punti critici: Disegno sperimentale/numero di repliche Analisi statistica Interpretazione biologica convalida dei dati

16 MIAME guidelines by the Microarray Gene Expression Data Society La conformità alle linee guida MIAME può essere verificata tramite riportando i dati di microarray in data-base MIAME compatibili ( es. Array Express, European Bioinformatic Institute, Cambridge). La maggior parte delle riviste scientifiche richiede il soddisfacimento delle linee guida MIAME

17 Gene expression changes in radioexposed workers: a human in vivo study. Radiation Research, in pubblicazione Esposti professionalmente a radiazioni X and γ Non esposti Possiamo evidenziare dei marcatori trascrizionali di esposizione cronica frazionata alle basse dosi di radiazione ionizzanti nel dominio < 25 msv?

18 Risposta Prelievo sangue Anello linfomonocitario Blocco bilanciato: ibridazione simultanea su una slide di un campione di ogni classe (esposto non esposto) con una distribuzione equivalente dei 2 fluorocromi tra le classi. mrna Analisi trascrizionale in microarray

19 28 slide Analisi statistica: 256 geni Tutte le informazioni relative al campione in esame e i nostri dati grezzi sono stati depositati in Array Express il data-base pubblico del European Bioinformatic Institute e sono consultabili ( accession number: E-MEXP-1277). Interpretazione biologica (EASE, NIH, USA) 4 geni sono stati confermati mediante real-time PCR

20 Esposizione professionale Effetto sull impacchettamento del DNA dovuto all inibizione di diversi istoni nuclesomici struttura cromatinica meno condensata Disturbo del trasporto elettronico NADHubiquinone aumento ROS Induzione di geni per le metallotioneine con funzione antiossidante

21 OECD SERIES ON TESTING AND ASSESSMENT, 29-Apr Number 50, REPORT OF THE OECD/IPCS WORKSHOP ON TOXICOGENOMICS, Kyoto, October 2004 The term ecotoxicogenomics describes the integration of genomics into ecotoxicology. The Population and Molecular Stress Responses of Daphnia magna Slide per lo studio dell espressione genica (3000 geni) Risposta al cadmio Environ Sci Technol Mar, Linking molecular and population stress responses in Daphnia magna exposed to cadmium. Descrivono una slide con spots

22 Microtox toxicity test system Test di tossicità acuta in vitro che utilizza un batterio marino naturalmente luminescente Vibrio fisheri (ceppo NRRL B11177). Gli effetti tossici sul batterio si manifestano tramite un calo della luminescenza. Metodo APAT CNR IRSA 8030

23 Disegno di una slide per V. fischeri Software per il disegno degli oligonucleotidi dedicati alla espressione genica di Agilent : Nearest Neighbour - SantaLucia 98 Il ceppo di cui è stato pubblicato l intero genoma è il V.fischeri ES114, isolato dall organo luminoso della seppia Euprymna scolopes Il formato della slide è 8X15K e include: Tre repliche dell intero genoma di V. fisheri (3747 probe 60mer) Controlli positivi e negativi 371 probe contro V. cholerae (controllo addizionale di specificità)

24 Risultati prima titolazione: V. Fisheri/E. coli 100% V. fisheri 75% V. fisheri 50% V. fisheri 0% V. fisheri

25 La trascrittomica Tossicologia Ecotossicologia preparano la loro rivoluzione e noi stiamo partecipando