L interazione gene-ambiente nello studio dei microinquinanti ambientali. Paola Silingardi

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1 L interazione gene-ambiente nello studio dei microinquinanti ambientali Paola Silingardi Convegno sul tema: BIOSENSORI E BIOMARCATORI NELLA VALUTAZIONE DEL RISCHIO AMBIENTALE E SANITARIO ASSOCIATO AI SUOLI CONTAMINATI Ferrara, 24 Settembre 2009

2 Per studiare interazioni gene-ambiente Si utilizzano tecnologie che trovano le loro basi nel sequenziamento del genoma umano/altri organismi Studiano il comportamento di tutto il genoma in un singolo esperimento Integrano competenze di scienze biologiche, informatica ed ingegneria TECNOLOGIE OMICHE

3 Spazi omici 1%-2% del nostro DNA è funzionalmente attivo mrna Tutti i geni di una cellula o di un tessuto Profilo metabolico

4 Trascrittomica L analisi dei profili trascrizionali è lo spazio omico piu studiato ed attualmente anche il piu promettente per l individuazione di biomarcatori da utilizzare nello screening dei cancerogeni e nel monitoraggio ambientale Perchè? mrna si può copiare/amplificare Diverse tecnologie per depositare su supporto solido le sequenze che riconoscono l mrna di un gene (collezioni miniaurizzate) Avanzamento della microscopia in fluorescenza Sviluppo di sistemi di analisi statistica ed interpretazione biologica dei dati

5 Modelli cellulari Umani Mammella Polmone Colon Fegato Cervello PBMC Murini BALB/c 3T3 Batterici V. fisheri

6 Analisi trascrizionale:microarray Esposizione della cellula al composto in esame Estrazione RNA Retrotrascrizione e marcatura con sonde fluorescenti Ibridizzo su supporto solido contente le informazione per migliaia di geni ANALISI della VARIAZIONE di ATTIVITA GENICA

7 CTP-Cianina La cianine presentano una struttura data da 2 indocianine eterocicliche unite da un ponte polimetinico: Cy 5 e Cy3 differiscono per la struttura di questo ponte. Cy3 è molto più fotostabili di altri marcatori fluorescenti. Cy3 dà un forte segnale fluorescente e possono sopportare le temperature e le condizioni normalmente presenti in laboratorio.

8 Supporto solido = slide da microarray Migliaia di geni spottati (probes) su un unico supporto (slide o chip)

9 Piattaforma Agilent Un laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elio-neon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5. Carosello a 48 posizioni Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione Software di Feature Extraction: calcolo della intensità dei segnali nel canale del verde associando, ad ogni valore, un errore

10 LABORATORIO MATER ARPA Bologna O 3 : 5µg/m 3

11 MIAME guidelines by the Microarray Gene Expression Data Society La conformità alle linee guida MIAME può essere verificata riportando i dati di microarray in data-base MIAME compatibili ( es. Array Express, European Bioinformatic Institute, Cambridge). La maggior parte delle riviste scientifiche richiede il soddisfacimento delle linee guida MIAME

12 CARATTERIZZAZIONE TOSSICOLOGICA DI MATRICI AMBIENTALI CONTAMINATE DA PCB PROGETTO ARCADE IDENTIFICAZIONE DEI RISCHI PER LA SALUTE UMANA CORRELATI ALL ESPOSIZIONE A MISCELE COMPLESSE AD ATTIVITÀ PSEUDO-ORMONALE IN MATRICI AMBIENTALI E ALIMENTARI Progetto finanziato da Fondazione del Monte di Bologna e Ravenna

13 CONTAMINAZIONI DA PCB Trasferimento per le vie d acqua e per via aerea dai punti di immissione nell ambiente Bioaccumulo e alla biomagnificazione nella fauna selvatica Arricchimento per selezione nella rete trofica dei congeneri con metabolismo più lento Allontanamento dei profili analitici rilevabili nei sedimenti e nella fauna selvatica da quelli caratteristici di specifici Aroclor Stima dell attività biologica totale del campione prelevato da un sito contaminato

14 CAMPIONI: SITO DI CREVALCORE Il Canale Collettore Acque Basse è individuato nel reticolo idrografico provinciale come canale di bonifica utilizzato a fini irrigui: le sue acque sono inoltre da sempre utilizzate anche per pesca. Nasce da Sud- Ovest in prossimità della Località Le Budrie di San Giovanni in Persiceto e termina il proprio corso confluendo nel Panaro in Comune di Finale Emilia (MO). In Comune di Crevalcore il canale attraversa l area su cui insiste lo stabilimento dell ex zuccherificio dividendone il corpo centrale di produzione da quelle che un tempo erano le vasche di trattamento delle acque produttive, oggi area di riequilibrio ecologico. Dr.ssa Biagi, ARPA-ER

15 18 Luglio 2002 : Episodio di contaminazione I segnalanti: Corpo Provinciale delle Guardie Ecologiche Volontarie (GEV) di Bologna Oggetto della segnalazione: presenza di morchie oleose nel Canale Collettore Acque Basse Intervento ARPA: verifica la presenza di oli minerali in superficie e lungo le sponde del canale in un tratto di circa 100 metri a valle del punto d'immissione di un condotto fognario proveniente dall ex Zuccherificio in cui erano in atto operazioni di dismissione impianti e vasche contenenti oli minerali. Misure di contenimento di emergenza: aspirazione e assorbimento degli olii sul canale e sul condotto dello stabilimento; chiusura con cemento del condotto fognario dello Zuccherificio. Ordinanza Sindacale di divieto d uso irriguo e pesca sul canale Nei giorni successivi nonostante i tempestivi ed accurati interventi di aspirazione ed assorbimento degli idrocarburi, il canale presenta un costante e marcato affioramento di oli dai sedimenti; la movimentazione del fondo del canale con benna lascia intravedere sotto uno strato di sedimento di colorazione normale, un ulteriore strato melmoso di intensa colorazione nera e di consistenza oleosa. Dr.ssa Biagi, ARPA-ER

16 Procedura di sito contaminato 18/07/2002: episodio di sversamento, interventi di emergenza Agosto/settembre 2002 : caratterizzazione interna allo zuccherificio icio e del canale Settembre 2002: dichiarazione di sito contaminato per l area dello stabilimento ex zuccherificio e per area canale Novembre 2003 :indagine integrativa di caratterizzazione Giugno 2004:approvazione del progetto di bonifica/messa in sicurezza Agosto/ottobre 2006: intervento di bonifica/messa in sicurezza con asportazione dei sedimenti nel tratto di canale interessato dalla contaminazione Novembre 2006 marzo 2007: controllo post bonifica/messa in sicurezza e relazione finale Arpa Giugno 2008 chiusura procedimento e ritiro Ordinanze di divieto d uso irriguo e ricreativo del canale Dr.ssa Biagi, ARPA-ER

17 Caratterizzazione sedimenti 100m a valle PCB totali campioni: valle centro 92.1ppb valle bordo ppb (Limiti PCB: 0.06 mg/kg, DL 152/2006) SEDIMENTO CR Pentaclorobifenili Esaclorobifenili Eptaclorobifenili

18 OBIETTIVI Applicazione della tecnologia microarray per la verifica delle modulazioni dei profili espressione genica dopo esposizione Identificazione di biomarker di esposizione Confrontare i profili di espressione delle miscele ambientale con quelli di Arochlor 1260 Comprensione dei meccanismi di azione a livello molecolare di sostanze o miscele complesse di origine ambientale

19 MODELLO BALB/c 3T3 Linea di fibroblasti murini Utilizzato lo studio della trasformazione in vitro di: cancerogeni chimici cancerogeni fisici promoventi (cancerogeni non mutageni con dose soglia stimabile) Concordanza con il test nell animale (IARC/NCI/EPA Working Group 1989, 1993, OECD Working Group 2006) Metodo per la determinazione della tossicità e degli altri effetti sulla salute riportato tra i metodi di prova del regolamento REACH Il protocollo sperimentale è attualmente sottoposto a uno studio di validazione coordinato dall ECVAM

20 MICROARRAY: disegno sperimentale Trattamenti (4 ore): A1260 ( ppb) SEDIMENTI Crevalcore Trattamenti microarray unendo i campioni valle centro e bordo : 170 ppb e 35 ppb Reference: DMSO Slide Agilent mouse whole genome 44K Single Colour hybridisation (Cy3) Analisi statistica con GENESPRING

21 Arochlor 1260 Analisi statistica: T test ppb vs DMSO P VALUE < 0.05 FOLD CHANGE > 1.5 A UP 284 DOWN 61

22 Estratti da sedimenti Crevalcore Analisi statistica: T test 2 dosi per ciascun sedimento vs DMSO P VALUE < 0.05 FOLD CHANGE > 1.5 Crevalcore 814 UP 556 DOWN 256

23 Intersezione Arochlor 1260/ sedimenti Crevalcore A U Crevalcore geni con lo stesso trend di modulazione: candidati per definire l esposizione a PCB

24 La trascrittomica Tossicologia Ecotossicologia preparano la loro rivoluzione e noi stiamo partecipando

25 CTR CANCEROGENESI AMBIENTALE e VALUTAZIONE DEL RISCHIO Annamaria Colacci Monica Vaccari Paola Silingardi Maria Grazia Mascolo Elena Morandi Stefania Perdichizzi Francesca Rotondo