La Tecnologia dei Microarray. Tor Vergata Aprile 2011

Transcript

1 La Tecnologia dei Microarray Tor Vergata Aprile 2011

2 SH Friend and RB Stoughton, The Magic of Microarray, Scientific American, February. 2002, pp Vogliamo sapere velocemente se un potenziale farmaco è nocivo per il fegato Il farmaco provoca alterazioni nell espressione genica in cellule di fegato, in un modo simile ad altre sostanze note per essere nocive al fegato? Animazione sui cdna microarray

3

4

5

6

7

8 Ibridizzazione

9

10

11 Importanti fonti di errore sono: la cross hybridization Il target ibridizza con altri probe anche se sono match parziali la self hybridization Il target ibridizza con se stesso

12 Sia la cross che la self hybridization si evitano solo con un accurato progetto del chip

13

14 Gli spot verdi corrispondono a geni maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza verde (ad esempio nelle cellule tumorali prima del trattamento). Gli spot rossi corrispondono a geni che sono maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza rossa (ad esempio nelle cellule tumorali dopo il trattamento). Gli spot gialli corrispondono a geni che sono espressi in uguale quantità nei due campioni.

15 Cy5 Laser Channel Cy3 Laser Channel + =

16 In rosso i geni che sono più espressi del normale (assenza di farmaci); in verde i geni meno espressi Il candidato farmaco altera l espressione genica di vari geni in un modo simile a quella di altre sostanze tossiche per il fegato Quindi probabilmente anche il nostro candidato farmaco sarà tossico (guilt-by-association)

17 I microarrays si differenziano per: il tipo di supporto utilizzato per l array (vetro, nylon, silicio,..), il tipo di frammento di DNA sull array (cdna, oligonucleotide), la modalità di deposizione del frammento genico (presintetizzato e depositato; sintetizzato in situ), il tipo di macchinario utilizzato per depositare il frammento genico sull array (ink-jet printing spotting, mask o micromirror-based in situ synthesis) il numero di probes sul chip (low, medium or high density).

18 pingroup Slide spot subarray gene

19 Lettura immagini generate dallo Scanner - Gridding: assegnare coordinate precise ad ogni spot - Segmentation: classificare i pixels ed assegnarli al foreground o al background - Intensity extraction: Calcolare per ogni spot i valori di intensità di foreground e background dei due canali (rosso e verde).

20

21 Un cerchio potrebbe non essere adeguato a definire la regione di foreground nel caso di spot piccoli ed irregolari

22

23 Identificativo sequenza: - Sequenza - Codice (Unigene Refseq ecc..) Informazioni espressione: - Median Foreground (R e G) - Median Background (Rb e Gb) File dei dati (C-dna) Posizione sul vetrino: - Blocco - Riga e colonna sul vetrino - Riga e colonna nel blocco Qualità dello spot: - Flag (R e G)

24 L analisi dei dati Raw Data Quality Control Normalization Differential Gene Expression (Fold change)

25 Raw Data Quality Control Normalization Differential Gene Expression (Fold change)

26 Grafici 2D sulle intensità di espressione

27 Filtraggio - Spot flaggati dallo scanner - Spot che non superano la soglia S2N (tra 2 e 1,5): - foreground/background (vetrini con background) - foreground/empty (vetrini senza background) - Spot saturi (foreground molto alto )

28 Visualizzazione delle raw intensity

29 Grafici log 2 (R) vs log 2 (G)

30 Ratio vs Intensity plot (RI) (also called MA plot) M A M = log 2 (R / G) A = log 2 (R*G) / 2

31 Common problems diagnosed using RI plots A B High variation at the high intensity end (A) is from larger channel- specific multiplicative error. Truncation at the high intensity end (B) is caused by scanner saturation. The split RI plots in (C) come from heterogeneity. C

32 Sottrarre il background?

33 E necessario calcolare la correlazione fra M e Mb (M = log2(r / G) e Mb = log2(rb / Gb)), nel caso in cui questo valore sia maggiore di 0,3-0,4, allora attraverso la sottrazione del background si ottiene una diminuzione della distorsione. Scharpf RB, et al. (2006) When one should substract background fluorescence in two color microarrays? Biostatistics 2006 Dec 12

34 Raw Data Quality Control Normalization Differential Gene Expression (Fold change)

35 La normalizzazione è la procedura con la quale si eliminano dai dati di microarray le variazioni sistematiche dovute ad effetti quali la differente efficienza di marcatura, la differente efficienza fluorometrica, effetti spaziali sulla superficie del microarray,

36 La nuvola di punti viene centrata sottraendo il valore mediano della M da tutti i geni Median normalization

37 La nuvola di punti viene centrata sottraendo il valore della curva di lowess ai rispettivi valori locali di M Lowess normalization

38 Print-tip normalization Slide Spot Pingroup Subarray Gene

39 La normalizzazione print-tip consiste in una normalizzazione lowess localizzata sui dati di ogni blocco dell array

40

41 Dye-swap normalization Nel caso si voglia eliminare l effetto che ha l utilizzo di cianine diverse, l esperimento viene ripetuto con cianine inverse e la M e la A vengono così ricalcolate: M D = M M / 2 A D = A + A / 2

42 Raw Data Quality Control Normalization Differential Gene Expression (Fold change)

43

44 Significatività statistica e Fold-Change (FC) Al fine di calcolare quanto ogni gene sia differenzialmente espresso per prima cosa viene calcolata la media delle M delle sue repliche (Mmed). Per capire se il valore Mmed è affidabile viene poi effettuato un T-test. La soglia di p-value viene corretta per i test multipli. Alla fine, per avere una misura reale di quanto sia differenzialmente espresso un gene, viene calcolato il Fold-Change: FC=2^Mmed Per valori di FC minori di 1 il valore viene poi esplicitato applicando la trasformazione: FC*=(-1)/FC In modo da ottenere un valore concreto di quanto un gene sia sottoespresso.

45