Applicazione di tecniche innovative di RNA-Seq per lo studio dei meccanismi di azione di un biofungicida

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1 Applicazione di tecniche innovative di RNA-Seq per lo studio dei meccanismi di azione di un biofungicida R.M. De Miccolis Angelini, D. Digiaro, C. Rotolo, S. Pollastro, F. Faretra Dipartimento di Scienze del Suolo, della Piante e degli Alimenti

2 Studiare nel complesso i meccanismi di riposta della pianta attivati a seguito dell esposizione ad un induttore di resistenza e studiarne l evoluzione temporale al fine di comprenderne i meccanismi di azione e migliorarne l efficacia

3 Allestimento della prova

4 Esperimento di RNA-Seq Campionamenti: 1, 3 e 7 giorni dopo 1 e 3 trattamento n. 5 foglie/campione Estrazione di RNA totale Purificazione dell mrna Frammentazione dell mrna Sintesi della prima elica di cdna Sintesi della seconda elica di cdna Riparo e adenilazione delle estremità 3 Preparazione di librerie di cdna Legame degli adattatori Amplificazione in PCR Validazione delle librerie St N T St

5 Sequenziamento e analisi dei dati Sequenziamento (Illumina, Single Reads 50 cicli) Analisi bioinformatica

6 Analisi RNA-Seq Allineamento su genoma di riferimento Quantificazione dei valori di espressione (RPKM) Vitis vinifera (12x) PN40024 genoma: bp geni annotati (V1): Analisi di espressione genica differenziale Analisi funzionale dei geni selezionati 6

7 Dati RNA-Seq Giunzioni esone-esone 13,2% Regioni introniche 5,7% Regioni intergeniche 5,8% Sequenze non allineate 3,5% Regioni esoniche 71,8% % Allineate Specifiche Non specifiche Corte sequenze (Read) totali 344 M (17,2 Gb) Read per libreria M Coverage 31x Trascritti rilevati (95,6%)

8 Isoforme di trascritti Cromosoma 4 Gene LOC Sequence-specific DNA binding transcriprion factor mrna Myb/SANT-like DNA-binding domain 1 2 Variante 1 Variante 2 1 trattamento 3 trattamento 1 trattamento 3 trattamento Livello di espressione (RPKM) Livello di espressione (RPKM) Controllo Trattato

9 Analisi dell espressione differenziale RPKM = 0 nel controllo e 20 nel trattato trattamento 3 trattamento trattamento 3 trattamento RPKM = 0 nel trattato e 20 nel controllo

10 Analisi dell espressione differenziale trattamento FC 8 up trattamento trattamento trattamento FC 8 down 562

11 Geni differenzialmente espressi N. geni totali Inibiti Indotti FC FC Inibiti Indotti 1 giorno 3 giorni I (156) IJ (32) J (109) 1 giorno 3 giorni IJK (14) LM (23) IK (80) JK (46) L (179) M (103) LMN (14) K (615) MN (27) 7 giorni LN (28) N (115) 7 giorni Totale geni Totale 489 geni

12 Up-regulated (FC 8) and induced genes GO: biological processes Stress and stimulus responses Oxidation-reduction processes Regulation Transport Cellular processes Metabolic processes

13 Proteine PR FC 140,7 1 trattamento 3 trattamento via di segnale dell SA

14 Proteine PR FC 12,6 FC 4,3 1 trattamento 1 via di segnale dell SA trattamento 1 3 7

15 Proteine PR via di segnale dell JA FC 15,9 FC 12,6 1 trattamento trattamento 1 3 7

16 Livelli di espressione (RPKM) Proteine PR Taumatine (PR-5) 1 trattamento 3 trattamento Controllo Trattato

17 Livelli di espressione (RPKM) Proteine PR Proteine SRG1 (PR-10) 1 trattamento 3 trattamento Controllo Trattato

18 Categorie funzionali Proteine di difesa Stilbene sintasi Osmotine Lipossigenasi (LOX) Salicilato O-metiltransferasi Ricezione e trasduzione del segnale Proteine LRR (Leucine-Rich Repeat) Serina/treonina protein chinasi Protein-chinasi dipendente da Ca 2+ /calmodulina Diacilglicerolo chinasi (DGK) Fosfoinositide fosfolipasi C Stress ossidativo Superossido dismutasi Xantina deidrogenasi/ossidasi Perossidasi Glutatione-S-transferasi (GST) Transaldolasi Biosintesi dell acido jasmonico (JA) Linoleato 13S-lipossigenasi Acyl-coenzyme A oxidase 4 Metabolismo dell etilene (ET) 1-aminociclopropano-1-carbossilato ossidasi (ACO) Fattori di risposta ad etilene (ERF) Metabolismo dell auxina Proteine indotte e di risposta all auxina (AUX/IAA; ARF1; PCNT115) Trasportatore di auxina (Auxin Efflux Carrier) Trasporto Trasportatori di membrana di ioni, amminoacidi/oligopeptidi, ABC/PDR, Proteina non specifica di trasferimento dei lipidi (nsltps) (PR-14)

19 Categorie funzionali Biosintesi dei terpenoidi 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfato sintasi Ent-copalil difosfato sintasi (E)-beta-ocimene sintasi Mircene e terpineol sintasi (3S,6E)-nerolidol sintasi 1 (E,E)-α-farnesene sintasi S-linalolo sintasi Valencene sintasi Metabolismo dei fenilpropanoidi e della lignina Fenilalanina ammonio liasi (PAL) Perossidasi 4-Cumarato-CoA ligasi Diidroflavonol 4-reduttasi/flavonone 4- reduttasi Laccasi Biosintesi di alcaloidi Strictosidina sintasi Iosciamine 6-diossigenasi Biosintesi di flavonoidi e carotenoidi Caffeoil-CoA O-metiltransferasi Miricetina O-metiltransferasi Tabersonina 16-O-metiltransferasi Fitoene sintasi Carotenoide diossigenasi Regolazione Fattori di trascrizione (Myc, Myb, bhlh, SPT5) Ubiquitine Fotosintesi Proteina che lega clorofilla a/b (CABbinding protein) Fotosistema I Fotosistema II

20 Proteina che lega clorofilla a/b (CAB-binding protein) Controllo Trattato 1 trattamento 3 trattamento Livello di espressione (RPKM)

21 Conclusioni 1) ~ 340 milioni di sequenze (17 Gb) complessivamente generate; ~27,5 milioni di sequenze/libreria allineate sul genoma di riferimento (12X Vitis vinifera) 2) Elevato grado di sensibilità e risoluzione della metodica di analisi adottata: trascritti poco espressi e discriminazione tra isoforme di trascritti 3) Numerosi geni differenzialmente espressi (7.269 geni FC 2; geni FC 8) nei campioni di foglie a confronto (trattate/non trattate) correlati con meccanismi di difesa della pianta 4) Attivazione della via di segnale dipendente da SA e di dipendenti da JA/ET. Induzione di altri segnali di difesa, ad esempio mediati da auxina o fitocromo A 5) L analisi RNA-Seq può contribuire a comprendere i meccanismi d azione degli induttori di resistenza e a razionalizzare il loro impiego