Analisi dell intero trascrittoma (WTA)

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1 Analisi dell intero trascrittoma (WTA) Obiettivi Questa procedura ha l obiettivo di esplorare, tramite sequenziamento, in modo quantitativo e senza ipotesi a priori l intera popolazione dei lunghi RNA trascritti, codificanti e non, presenti in un dato campione. I dati che si ottengono permettono l identificazione e, se sufficientemente numerosi, la quantificazione delle differenti specie di RNA presenti nel campione. Questa tecnica è caratterizzata da un alta sensibilità e specificità e da una risposta dinamica più ampia di quella che si ottiene con la tecnologia dei microarrays divenendo quindi una valida alternativa per ottenere profili di espressione genica a livello dell intero genoma. Il sequenziamento massivo offerto della piattaforma SOLiD permette non solo la rilevazione e la quantificazione dei trascritti noti ma anche la scoperta di nuovi esoni trascritti, giunzioni di splicing e di nuovi trascritti non processati. Grazie ad una accurata analisi bioinformatica, si possono anche identificare e contare gli SNPs espressi, valutando quindi l espressione genica allele-specifica, e scoprire trascritti di fusione. Il metodo usato per la preparazione della libreria (Ligase-Enhanced Genome Detection) preserva l informazione relativa alla elica trascritta (strandeness) delle molecole, facilitando la rilevazione di trascritti dall elica opposta e parzialmente o totalmente sovrapposti (antisenso). Procedura La metodica sviluppata permette di partire sia con quantità standard di RNA poliadenilato (purificato) o depleto da RNA ribosomiale che con quantità ridotte di campione (vedi tabella). I protocolli di entrambe le applicazioni sono simili e prevedono un iniziale frammentazione del campione a dimensioni di paia di basi mediante RNAse III o per idrolisi chimica. La prima tecnica sfrutta le caratteristiche di questo enzima, una endoribonucleasi specifica per il doppio filamento di RNA (dsrna), che taglia l RNA in un range bp a seconda del tempo di incubazione. La seconda, invece, sfruttando l azione combinata di cationi (Mg ++ e Zn ++ ) e calore (tra C), produce dei frammenti di lunghezza variabile a seconda della durata del trattamento, che devono essere però riparati usando una T4 chinasi prima del successivo processo di ligazione. Si noti che viene suggerito l utilizzo di questo ultimo procedimento solo con quantità standard di campione. Dal punto di vista della quantificazione dei trascritti, le due tecniche sono paragonabili, ma la prima ha il vantaggio di ridurre il numero di sequenze di rrna presenti nella libreria. L idrolisi chimica, invece, ha il grosso vantaggio di produrre librerie più complesse, fornendo un campionamento più uniforme dei trascritti sul genoma. Di conseguenza, il suo utilizzo è preferito in studi incentrati sulla quantificazione degli esoni, identificazione di nuovi splicing e SNP detection. I frammenti di RNA sono convertiti in una libreria finale di cdna a doppia elica attraverso diversi passaggi sperimentali: le molecole di RNA sono prima ibridate e quindi ligate, utilizzando una RNA ligasi, ad una miscela di adattatori costruiti in modo tale da permettere il sequenziamento a partire sempre e solo dall estremità 5 del filamento senso. L RNA legato agli adattatori viene convertito in cdna a singola elica tramite trascrittasi inversa e purificato utilizzando le biglie Agencourt AMPure XP oppure su gel TBE-urea per selezionare la dimensione corretta di bp. Per ottenere la quantità di campione necessaria per il sequenziamento con la piattaforma SOLiD e per attaccare a ciascuna molecola le sequenze terminali necessarie, la libreria di cdna è quindi amplificata usando un numero minimo di cicli di PCR (12 18). Durante l amplificazione in PCR è possibile aggiungere all estremità 3 della molecola corte sequenze di DNA che agiscono come codici a barre per identificare i differenti campioni: ad oggi sono disponibili 96 codici a barre. Il prodotto finale consiste in molecole di dsdna della lunghezza media di paia di basi che contengono le copie degli RNA presenti nel campione originale inserite fra gli adattatori SOLiD P1 e P2. Queste molecole sono quindi pronte per il legame alle biglie, per la loro amplificazione tramite PCR in emulsione e il successivo sequenziamento.

2 Nelle prime fasi di processamento è possibile aggiungere al campione un set di RNA trascritti in vitro usati come controlli interni (Ambion ERCC RNA Spike-in Control Mixes) per disporre di controlli quantitativi, che aiutano a calcolare l efficienza del sistema in termini di intervallo dinamico, limite inferiore di rilevamento e proporzionalità della misura. Tipo e quantità dei campioni di RNA Come indicato in precedenza, due diverse specie di preparazioni di RNA possono essere usate come materiale di partenza, RNA poly(a) o RNA totale depleto di rrna. In entrambi i casi è necessario partire con un campione che abbia un RIN 7, preferibilmente 8, misurato con lo strumento 2100 Bioanalyzer della Agilent (RNA 6000 Nano o Pico Kit). L RNA totale deve essere sottoposto a uno o piu cicli di selezione per il Poly(A) con oligo(dt) utilizzando, ad esempio, dei kit con biglie o cellulosa che catturano l acido nucleico di interesse. Stessa cosa dicasi per l RNA totale depleto di rrna che viene tendenzialmente preparato usando un kit di cattura della parte rrna con biglie, differente a seconda della specie del campione in esame. In entrambi i casi, dopo la purificazione, l assenza di rrna 18S e 28S deve essere di nuovo controllata usando il Bioanalyzer e il kit Agilent RNA 6000 Pico. La quantità standard di RNA, da tessuti o cellule, richiesta per questa procedura deve essere completamente priva di DNA contaminante ed è indicata nella tabella sottostante. Le quantità minime sono riportate solo come indicazione del limite più basso raggiunto dalla tecnica e come base di discussione per ottimizzare condizioni sperimentali particolarmente critiche. Materiale di partenza Quantità Standard (µg) Quantità Minima (µg) RNA totale, Poly(A) purificazione > 2 RNA totale, rrna deplezione 2-5 > 2 Quantità Standard (ng) Quantità Minima (ng) RNA Poly(A) RNA totale depleto di rrna Analisi Bioinformatica L analisi bioinformatica dei risultati degli esperimenti di Analisi del Trascrittoma Intero (WTA-BF01) parte dalla correzione ab initio degli errori di sequenza, dove applicabile, e relativo mappaggio sul genoma di riferimento. Se si sceglie di utilizzare il modulo di Exact Call Chemistry (ACCUSEQ) la correzione degli errori ab initio e superflua. Questo tipo di applicazione e interessante particolarmente per le call di variazione sul trascrittoma. Le relative statistiche in termini di read utilizzabili, qualita degli allineamenti, qualita delle sequenze costituiscono una prima metrica utile per valutare inizialmente la natura dei campioni e dell esperimento (vd. Fig 1). Figura 1 Metriche di mappaggio da esperimenti WTA condotti in Genomnia, analizzati con il programma Samstat. (A) grafico a torta della percentuale degli allineamenti nelle varie categorie di qualita. (B) distribuzione dei valori di allineamento in funzione della lunghezza della sequenza.

3 Analisi successive correlano la distribuzione delle sequenze mappate con l annotazione genica (CDS, regioni intra ed extra geniche, TSS, UTR..) del genoma di riferimento. Questa analisi è molto utile per avere una visione globale del trascrittoma sotto esame, dell eventuale arricchimento in ncrna, in trascritti intragenici o al contrario in trascritti codificanti (a seguito di procedimenti di cattura specifica) e così via. Un esempio di questa classificazione su un campione sequenziato ed analizzato in Genomnia è riportato in Figura 2. Figura 2 Distribuzione delle sequenze di un esperimento di trascrittoma intero rispetto all annotazione categorica di base (5 o 3 UTR; CDS; esoni; intragenico; introne; esone; trascritto) dell insieme RefSeq di trascritti di riferimento. Organismo: Homo sapiens. Altre tecniche di analisi esplorativa dei dati forniscono informazioni precise sulla distribuzione delle read nel primo esone dei trascritti, in quelli centrali, in prossimità di siti di splicing e così via. Successivamente a questa fase viene eseguita l analisi statistica dell espressione differenziale a partire dai tag di sequenza, utilizzando approcci basati sui tag come il programma Bioconductor edger. Un esempio di output primario di analisi di espressione differenziale è riportato in Figura 3. E importante tener presente, nel disegno sperimentale iniziale, che i sistemi analitici utilizzati per il calcolo dell espressione differenziale a partire da dati di trascrittoma intero restituiscono un valore che può risultare statisticamente significativo anche in assenza di replicati biologici. La validità effettiva di queste stime è tuttavia bassa dato il componente importante di variazione tecnica tra campioni associato al Deep Sequencing. E quindi prioritario considerare sempre diversi replicati biologici nella pianificazione degli esperimenti di trascrittoma intero (Liu 2014). Supporto per valutare analiticamente questi prerequisiti e disponibile in Genomnia. Gene_ID logconc logfc P.Value adj.p.val A2LD A2M AAA AADAT AAGAB AAMP AARS AARS AARSD AATF ABAT ABCA ABCA ABCA11P ABCA Figura 3 Analisi differenziale (approccio basato sui tag) di quattro campioni di trascrittoma intero - due replicati biologici per due condizioni differenti. Il P-value corretto per campioni multipli (Bonferroni, adj.p.val) è il valore più importante da considerare per valutare la significatività dell espressione differenziale. In questo caso i geni con espressione differenziale significativa sono riportati con sfondo azzurro. I geni che mostrano una espressione differenziale significativa vengono riportati in una tabella Excel assieme agli appropriati indicatori statistici, alle conte delle tag, alle conte per milione normalizzate e ad un annotazione funzionale (nomi e descrizione dei geni; analisi di arricchimento di pathway Reactome; analisi Gene Ontology) che si applica sia ai geni sovra- che sotto- espressi rispetto al controllo. L analisi bioinformatica di secondo livello [BF-WTA02] include tutti i passaggi riportati sopra ed estende l analisi di espressione differenziale con l intersezione di due algoritimi diversi. Infatti ricerche interne Genomnia ed i primi

4 risultati del lavoro di un progetto Europeo in cui Genomnia e partner ( hanno evidenziato che in diversi sistemi biologici l utilizzo di una sola metodica fornisce risultati statistici potenzialmente inesatti. Una esemplificazione e riportata in Figura 4. Vengono restituite al cliente le liste di geni differenzialmente espressi ottenute dall intersezione dei Log2 Fold Change dei sistemi analitici che hanno la correlazione migliore. In questa fase si utilizzano sistemi basati sui tag (edger,deseq), sulla ricostruzione dei trascritti (TopHat/Cufflinks). Figura 4 - (Sinistra) Statistica sui risultati di espressione differenziale di trascritti (sequenziamento trascrittoma intero) calcolata dall intersezione di due approcci diversi (A e B), liste di geni ordinate e comparate sulla base del Log2 Fold Change, quindi senza nessuna soglia per FDR. (Destra) Le stesse statistiche sugli stessi esperimenti, realizzate utilizzando i metodi A e C. La differenza molto rilevante tra le due intersezioni indica che in questo sistema biologico uno dei due algoritmi, se utilizzato da solo, ha scarsa consistenza, come si evince anche dalla differenza notevole dei valori di correlazione. L analisi di secondo livello [BF-WTA02] include anche all analisi differenziale delle isoforme (programmi AltAnalyze o TopHat/Cufflinks) e dei putativi trascritti nuovi, cioe assemblati de novo, generalmente non codificanti e non corrispondenti a trascritti annotati (TopHat/Cufflinks). Le liste di geni differenzialmente espressi derivate dall analisi statistica riportata sopra vengono infine sottoposte ad un analisi di interazione funzionale con il software Cytoscape (separatamente per i geni con Fold Change positivo o negativo), che esita in rappresentazioni di moduli discreti di interazioni funzionali, e ad un calcolo di arricchimento di pathway per ogni modulo identificato. La Figura 5 riporta dei risultati di questa analisi funzionale integrata. Questa analisi e disponibile solo per Homo sapiens. Figura 5 Modulo di interazione funzionale identificato a partire dall analisi di network di liste di geni differenzialmente espressi, caratterizzati da un FC negativo (rete di geni corepressi). I segmenti a forma di freccia o di T rappresentano rispettivamente interazioni funzionali positive o negative; segmenti di connessione tratteggiati indicano relazioni funzionali inferite. Il colore interno di ogni nodo della rete (gene) corrisponde al modulo funzionale isolato da reti piu grandi; il colore del bordo esterno corrisponde con il valore di Fold Change, in questo caso negativo (colore piu scuro corrisponde a valori assoluti piu elevati).

5 Informazioni per gli ordini Prodotto Controllo di qualità di preparazioni di RNA ricevuto Purificazione di RNA Poly(A)+ da RNA totale Deplezione di rrna da RNA totale Preparazione di libreria WTA Preparazione di libreria WTA con codice a barre Aggiunta di ERCC alla preparazione di libreria Sequenziamento forward con codice a barre 50 bp tags Sequenziamento forward con codice a barre 75 bp tags Sequenziamento Paired-end con codice a barre 50bp + 25 bp tag Sequenziamento Paired-end con codice a barre 75bp + 35 bp tags Exact Call Chemistry Module Analisi Bioinformatica Livello I Analisi Bioinformatica Livello II Numero di catalogo RNA03 RNA06 RNA10 LB30 LB30B ERCC SEQ50B SEQ75B SEQ50.25B SEQ110B ACCUSEQ WTA-BF01 WTA-BF02 Referenze Bibliografiche Genome-wide analysis of histone marks identifying an epigenetic signature of promoters and enhancers underlying cardiac hypertrophy Papait R, Cattaneo P, Kunderfranco P, Greco C, Carullo P, Guffanti A, Viganò V, Stirparo GG, Latronico MV, Hasenfuss G, Chen J, Condorelli G. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110: A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. Guffanti A., Iacono M., Pelucchi P *, Kim N., Soldà G., Croft L.J., Taft R.J., Rizzi E., Askarian-Amiri M., Bonnal R.J., Callari M., Mignone F., Pesole G., Bertalot G., Rossi Bernardi L., Albertini A., Lee C., Mattick J.S., Zucchi I., de Bellis G. BMC Genomics 2009, 10:163. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication? Liu Y, Zhou J, White KP. Bioinformatics 2014 Feb 1;30(3): WTA Rev. 2 01/2014