MICRORGANISMI ANTAGONISTI DEI FUNGHI MICOTOSSIGENI

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1 Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura MICRORGANISMI ANTAGONISTI DEI FUNGHI MICOTOSSIGENI Stefania Galletti Centro di Ricerca per le Colture Industriali (CRA-CIN) Bologna Roma, 29 ottobre

2 INTRODUZIONE -Le malattie delle piante influenzano la quantità e la qualità e delle produzioni agricole. -In particolare le infezioni da parte di funghi micotossigeni rappresentano un rischio per la salute dell uomo. Occorre intervenire: Buone pratiche agricole (influenza fattori ambientali) Varietà resistenti (non sempre disponibili) Lotta chimica (non sempre ammessa) IPM Microrganismi antagonisti o Agenti di controllo biologico (BCA)

3 AGENTI DI CONTROLLO BIOLOGICO (BCA) BCA: In patologia vegetale il termine si riferisce all uso di microrganismi residenti o introdotti allo scopo di combattere le malattie delle piante. Saprofiti competitivi (viventi su residui vegetali morti); simbionti facoltativi di piante (viventi su tessuti vegetali); iperparassiti facoltativi (di patogeni vegetali) Funghi Ampelomyces Coniothyrium Gliocladium Trichoderma Mycorrhyzae Batteri Bacillus Burkholderia Lysobacter Pseudomonas Streptomyces Trichoderma sono funghi filamentosi comuni nel suolo, considerati simbionti opportunisti avirulenti.

4 AGENTI DI CONTROLLO BIOLOGICO (BCA) Formulati commerciali a base di BCA e specialmente di Trichoderma sviluppati per l uso verso diversi patogeni della rizoo fillosfera, con varia efficacia L uso efficace di BCA dipende dalla conoscenza: - del pato-sistema; - dei meccanismi d azione del BCA; - delle interazioni complesse tra BCA, pianta, patogeno e ambiente.

5 COLLEZIONE CRA-CIN Al CRA-CIN è mantenuta una collezione di funghi saprofiti, tra cui oltre 300 isolati di Trichoderma spp., utilizzata in diversi settori di studio Biocontrollo Gli isolati differiscono per capacità antagonistiche vs patogeni o benefiche vs pianta: necessità di selezione per problematiche specifiche Pretrattamento biomasse per energia Produzione cellulasi, xilanasi x industria

6 TRICHODERMA - ANTAGONISMO 1) Antagonismo Inibizione della crescita di F. verticillioides Colonizzazione di radici di bietola Trichoderma può inibire la crescita del patogeno nella rizo- o fillosfera per mezzo di meccanismi: -diretti (micoparassitismo, produzione di metaboliti tossici, enzimi litici vs la parete cellulare del patogeno); -indiretti (competizione per spazio e nutrienti, colonizzazione del sito di infezione).

7 TRICHODERMA AZIONI BENEFICHE 2) Azioni benefiche fattore chiave nella difesa dalle malattie - promozione crescita - > efficienza d uso di N - induzione di resistenza sistemica - priming - riduzione tossicità da ROS - riduzione stress abiotici Trichoderma è considerato un simbionte delle piante, capace di colonizzare e penetrare nelle radici (epibiotic/endophytic) e interagire con la pianta, rilasciando molecole bioattive e inducendo variazioni dell espressione genica anche nella parte aerea.

8 TRICHODERMA - INDUZIONE DI RESISTENZA SISTEMICA Considerata uno dei meccanismi prevalenti esercitati da Trichoderma. Capacità di indurre una risposta sistemica di difesa dopo applicazione localizzata. In base all elicitore e al percorso metabolico coinvolto: Resistenza Sistemica Acquisita (SAR) Patogeni necrotrofici Via dell acido salicilico (SA) Proteine PR (perossidasi, chitinasi, glucanasi) Resistenza Sistemica Indotta (ISR) Rizobatteri promotori crescita (Pseudomonas) Via dell acido jasmonico (JA) No proteine PR

9 CANADAIR Project CANADAIR Gemellaggio Italia Canada nel settore della ricerca scientifica e innovazione in campo agro-alimentare WP1 - Miglioramento avanzato della resistenza a funghi tossigeni in specie di interesse, diagnosi precoce e controllo delle infezioni CRA-CIN: studiare il possibile ruolo del Trichoderma nel contenimento delle infezioni di Fusarium verticillioides in mais attraverso applicazioni al seme. 9

10 CANADAIR Nell Italia del Nord le cariossidi di mais sono spesso contaminate da micotossine (fumonisine) prodotte da F. verticillioides, agente del marciume rosa della spiga. Anche cariossidi apparentemente sane possono ospitare il patogeno endofiticamente e trasmettere l infezione alla nuova pianta. Altre vie di infezione: - Infezione delle radichette da residui infetti nel suolo - Conidi trasportati e inoculati dalla piralide - Conidi trasportati sulle sete dal vento o dalla pioggia Ruolo BCA: 1) Come antagonisti per ridurre infezioni delle radichette e diminuire il potenziale d inoculo dei residui infetti nel suolo; 2) Come induttori di resistenza per contrastare infezioni più tardive 10

11 ANTAGONISMO- SCREENING IN VITRO E IN VIVO Screening in vitro per antagonismo vs F. verticillioides: su 238 isolati di Trichoderma, 11 sono stati selezionati e utilizzati come sospensione di spore per trattare cariossidi di mais. I semi trattati sono stati seminati in terreno inoculato con il patogeno per saggiare la capacità di ridurre infezioni radicali in vivo. Culture duali : Fusarium a sinistra, Trichoderma a destra Control promozione della crescita!

12 ANTAGONISMO - SCREENING IN VIVO Le radici sono state espiantate e piastrate 3 degli 11 isolati saggiati hanno ridotto significativamente l infezione radicale (70%). Infezione % Efficace Controllo Non efficace Controllo Isolati Trichoderma Trattamento al seme: efficacia nel proteggere radichetta da infezioni dal terreno

13 INDUZIONE DI RESISTENZA - ESPERIMENTO IN SERRA Al fine di studiare possibili effetti di induzione di resistenza sistemica, semi trattati con la coltura liquida dei 3 isolati di Trichoderma sono stati seminati in serra e lo stelo inoculato con il patogeno dopo 15 gg

14 INDUZIONE DI RESISTENZA - ESPERIMENTO IN SERRA 1) Campioni fogliari sono stati raccolti 24, 48 e 96 h dopo l inoculazione del patogeno per valutare l espressione di geni coinvolti in meccanismi di SAR e ISR, tramite analisi del RNA (Real time PCR). Analisi RNA SAR: PAL, PR1, PR5, OPR2. ISR: HPL, AOS, CTR1, LOX. 2) Campioni di stelo sono stati prelevati 15 gg dopo l inoculazione per valutare lo sviluppo del patogeno all interno dei tessuti tramite analisi quantitativa del DNA di F. verticillioides (Real time PCR). Inoculazione Analisi DNA Inoculazione

15 RISULTATI FENOTIPICI - Uno degli isolati ha promosso significativamente la crescita delle piantine di mais. NT NT IMO5 I B75 Trichoderma - Le radici apparivano ben colonizzate dal Trichoderma (spore verdi).

16 ANALISI QUANTITATIVA DNA PATOGENO pg DNA Fv /12,5ng DNA totale Prima dell analisi di espressione genica è stato verificato l effetto di contenimento del patogeno nello stelo water NT/FV- NT/FV+ B21/FV+ B75/FV+ IMO5/FV+ Tutti e 3 gli isolati di Trichoderma hanno inibito significativamente lo sviluppo del patogeno all interno dello stelo rispetto al controllo non trattato (NT). Trattamento al seme: efficace nel ridurre lo sviluppo endofitico del patogeno.

17 ANALISI DI ESPRESSIONE GENICA (RNA) in corso Espressione genica di idroperossido liasi (HPL), marker di ISR, relativo alla produzione di composti volatili (GLV) h 96 h 9 48 h NT: grigio Trichoderma: nero Quantificazione relativa 8 water 7 6 NT IMO h/FV- 24h/FV+ 48h/FV- 48h/FV+ 96h/FV- 96h/FV+ Già dopo 24 h dall inoculazione col patogeno, HPL risulta più indotto nelle piante trattate con Trichoderma, rispetto a NT. Trattamento al seme: induzione di resistenza sistemica del tipo ISR

18 CONCLUSIONI - Il trattamento alle cariossidi di mais con Trichoderma selezionato ad hoc può contrastare le infezioni da F. verticillioides attraverso meccanismi di antagonismo (infezioni da suolo) e di induzione di resistenza sistemica (infezioni aeree). - Necessario verifica in campo in condizioni reali di infezione. - L utilizzo di BCA rappresenta un approccio interessante per la gestione anche integrata di malattie per le quali non è consentita o non esiste un alternativa chimica, come nel caso del marciume rosa da F. verticillioides. -La concia del seme può avvenire secondo modalità già in essere presso le aziende sementiere, previa verifica della formulazione e concentrazione più opportuna, già implementata presso il nostro Centro. - I risultati ottenuti dimostrano che la ricerca è la base per applicazioni efficaci.