FUNGHI TOSSIGENI E MICOTOSSINE IN MATRICI ALIMENTARI: SVILUPPO DI METODOLOGIE DIAGNOSTICHE INNOVATIVE E STRATEGIE DI BIOCONTROLLO

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1 FUNGHI TOSSIGENI E MICOTOSSINE IN MATRICI ALIMENTARI: SVILUPPO DI METODOLOGIE DIAGNOSTICHE INNOVATIVE E STRATEGIE DI BIOCONTROLLO C.R. Casaccia 8 aprile 2009 Tolaini Valentina

2 Contaminazioni fungine DIMINUZIONE QUALITA GLOBALE MATRICE ALIMENTARE SINTESI DI MICOTOSSINE, METABOLITI SECONDARI TOSSICI PER GLI ANIMALI SUPERIORI INIDONEITÀ AL CONSUMO E/O TRASFORMAZIONE RISCHIO PER LA SALUTE UMANA ED ANIMALE Tolaini V.

3 Principali contaminanti fungini delle matrici alimentari Fusarium F. graminearum, F. culmorum, F. verticilloides Zearalenone e Tricoteceni (DON, NIVALENOLO Fumonisina B1 Aspergillus A. flavus, A. parasiticus, A.carbonarius, A. ochraceus A. niger Aflatossine (B1, G1, B2, G2) Ocratossine (Ocratossina A) Penicillium P. Verrucosum P. expansum, Patulina All interno All interno dello dellostesso stessogenere specie specie fungine fungine diverse diverse producono producono micotossine micotossine diverse diverse Tolaini V.

4 Contaminazione e sviluppo del fungo IN CAMPO POST RACCOLTA All All interno di una specie fungina possono esistere ceppi altamente tossigeni, tossigeni, poco tossigeni o non tossigeni Lapresenza presenzadella dellaspecie speciefungina funginatossigena tossigenanon nonèèsempre sempre La indicedella dellapresenza presenzadella dellacorrispondente corrispondentetossina tossina indice Tolaini V.

5 Tossinogenesi Caratteristiche specie e ceppo fungino FATTORI INTRINSECI FATTORI ESTRINSECI Condizioni ambientali (substrato,t, umidità, a w, ossigeno, Luce, danni meccanici) Tolaini V.

6 Le Micotossine possono essere presenti nella nella matrice alimentare anche dopo dopo la la rimozione del del fungo fungo elevata stabilita chimico-fisica causano tossicità cronica sono sono classificate classificate a seconda seconda del del bersaglio bersaglio in: in: immunotossine, epatotossine, nefrotossine, neurotossine Tolaini V.

7 Strategie di intervento PREVENZIONE CONTROLLO PREVENZIONE DELLO SVILUPPO FUNGINO RILEVAMENTO CONTAMINAZIONE FUNGINA RILEVAMENTO TOSSINA Tolaini V.

8 Le tecniche in uso per la prevenzione ed il controllo del rischio tossico PREVENZIONE DELLO SVILUPPO FUNGINO Fungicidi chimici (in campo, post raccolta) Tecnologie di conservazione (atmosfera modificata, temperatura, ecc) Impatto ambientale, insorgenza di ceppi resistenti, alterazione sensoriale e fisiopatie RILEVAMENTO CONTAMINAZIONE FUNGINA Tecniche micologiche classiche (analisi delle caratteristiche morfologiche dei ceppi fungini) Metodo laborioso Tecniche molecolari (PCR classica) Metodo qualitativo RILEVAMENTO TOSSINA Tecniche cromatografiche (TLC, HPLC) Metodi sensibili ma laboriosi che richiedono lunghe e costose fasi estrattive ed analitiche Tolaini V.

9 Le tecniche innovative per la prevenzione ed il controllo del rischio tossi PREVENZIONE DELLO SVILUPPO FUNGINO Biocontrollo (uso di varietà naturalmente resistenti, uso di antagonisti, di antiossidanti naturali) Minor impatto ambientale, alimenti più naturali, alimenti funzionali RILEVAMENTO PRECOCE CONTAMINAZIONE FUNGINA Tecniche molecolari quantitative (REAL-TIME PCR) Tecniche spettroscopiche non distruttive (Spettroscopia d immagine) d Metodi di early detection RILEVAMENTO RAPIDO TOSSINA Tecniche sensoristiche (Sensore al silicio amorfo) Metodo rapido Tolaini V.

10 Prevenzione e biocontrollo di Penicillium expansum,, produttore di patulina in pomacee,, mediante agenti di lotta biologica e tecniche molecolari Valentina Tolaini C.R. Casaccia, 8 aprile 2009

11 DETERIORAMENTO POMACEE IN POST-RACCOLTA FATTORI ABIOTICI ferite danni da raccolta schiacciamento umidità temperatura FATTORI BIOTICI batteri funghi Penicillium expansum

12 Penicillium expansum Fungo mitosporico patogeno vive da saprofita su residui vegetali Penetra nel frutto attraverso ferite e lenticelle Condizioni ottimali: T=25 C a w 0.96 Agente eziologico del MARCIUME VERDE-AZZURRO delle pomacee in post-raccolta sulla superficie tacche marrone-giallo ricoperte da cuscinetto di muffa biancastra che vira poi al verdeazzurro (conidi) sintomi nella polpa area infetta deliquescente, brunastra, spiccato odore di muffa

13 Patulina Fungo tossigeno produttore della PATULINA effetti tossici: immunotossicità, neurotossicità, disturbi gastro-intestinali, non esistono evidenze sulla cancerogenicità si ritrova in vari prodotti della filiera ortofrutticola (succhi, spremute, concentrati), meno in quelli fermentati perché può essere degradata dai sistemi enzimatici del lievito Saccharomyces cerevisiae processi di chiarificazione dei succhi, aggiunta di acido ascorbico, anidride solforosa, idrossido di sodio, o di adsorbenti (carbone attivo) possono abbassare significativamente il livello di contaminazione Pericolo contaminazione prodotti alimentari destinati all infanzia

14 Normativa Tenori massimi di patulina negli alimenti: Reg. CE 466/2001 e Reg. CE 1425/2003 Succhi di frutta PRODOTTO Bevande spiritose, sidro e altre bevande fermentate derivate dalle mele Prodotti con mele allo stato solido Prodotti a base di mela per l infanzia PATULINA (µg/kg o ppb) Codice di prassi per la prevenzione e riduzione della contaminazione da patulina: Raccomandazione della Commissione 2866/2003 Metodi di campionamento e controllo: Direttiva CE 78/2003

15 Obiettivi della ricerca Testare lievito (Cryptococcus laurentii) e basidiomicete (Lentinula edodes) per il controllo di Penicillium expansum produttore di patulina Approfondire le interazioni fisiologiche ospitepatogeno-agente di biocontrollo PREVENZIONE DELLO SVILUPPO FUNGINO Valutare efficacia del sistema di biocontrollo a temperatura ambiente ed in condizioni di conservazione dei frutti a 4 C Sviluppare una tecnica biomolecolare di facile fruizione in campo commerciale per il rapido rilevamento di Penicillium expansum su pomacee RILEVAMENTO CONTAMINAZIONE FUNGINA

16 PREVENZIONE DELLO SVILUPPO FUNGINO Biocontrollo LIEVITO Cryptococcus laurentii presente nella naturale microflora di frutta e verdura (non patogeno) resiste allo stress ossidativo colonizza tessuti di mela nelle fasi iniziali di deterioramento BIOCONTROLLO: competizione per spazio e nutrienti Lentinula edodes BASIDIOMICETE EDULE attività antiossidante di per sé, inoltre stimola la risposta antiossidante dell ospite e del patogeno inibizione sintesi tossine produce sostanze ad attività antimicrobica e con proprietà farmacologiche BIOCONTROLLO: produzione β-glucani e glicoproteine

17 Biocontrollo - Risultati prove in vitro Estratti colturali liofilizzati di L. edodes CF23 (ricchi di sostanze antiossidanti): inibiscono germinazione conidi del patogeno fino alle 16 h, poi la rallentano significativamente antagonismo stimolano alcuni enzimi antiossidanti del patogeno (catalasi e glutatione perossidasi) riduzione patogenesi CAT U/mg proteina 3,5 3 2,5 2 1,5 1 CAT 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 GPX SOD ph 10.0 U/mg proteina SOD 0,4 0,5 0, tempo (ore) tempo (ore) tempo (ore) P.expansum P.expansum+LF23 riducono del 25% sintesi patulina riduzione patogenesi ppm patulina P.expansum P.expansum+LF23 7 gg 17 gg

18 Biocontrollo - Risultati prove in vitro Estratti colturali liofilizzati di L. edodes CF23 (ricchi di sostanze antiossidanti): stimolano crescita lievito C. laurentii del 10% stimolano gli enzimi antiossidanti del lievito aumento resistenza allo stato di ossidazione e competitività SOD citosolica SOD perossisomiale CAT GPX 80 GPX U mg -1 prot ore LS28 LS28+LF 23 2%

19 Trattamento di mele (cv Golden delicious da agricoltura biologica) con entrambi agenti di biocontrollo (LS28+LF23) determina: Quantità di patulina 6 gg 25 C 1 riduzione quantità specie reattive dell ossigeno 0,75 riduzione stress ossidativo ng patulina/ mg tessuto mela Biocontrollo - Risultati prove in vivo Inibizione sintesi 0,5 0,25 0 patulina P. expansum P.expansum+LS28 P.expansum+LF23 P.expansum+LS28+LF23 CAMPIONE CAMPIONE O 2 -. abs 470nm/mg tessuto P.expansum Mela 0,19 ±0,02 P.expansum P.expansum+LS28 0,33 ±0,03 P.exp+LS28+LF23 P.expansum+LF230,21 ±0,018 P.expansum+LS28+LF23 ROOH INIBIZIONE mm (%) 0 1,70 ±0, ,35 ±5 ±0,31 542,20 ±6 ±0,32 99 ±3 ng patulina/mg tessuto 0,600 0,400 0,200 0, C (dopo 4 C) P. expansum P. exp+ls28 P.exp+LF23 P.exp+LS28+LF23 3 g 6 g Mele a 4 C: no patulina Mele poste a 25 C (dopo 4 C) come prassi nell industria di trasformazione: patulina prodotta in anticipo, confermata azione biocontrollo del sistema LS28+LF3

20 Biocontrollo - Risultati prove in vivo Controllo marciume t=136 ore CAMPIONE P.expansum P.expansum+LS28 A.I. 0 87±4 25 C P.expansum+LF23 25±7 P.exp+LF23 P.exp+LS28 P.expansum+LS28+LF23 CAMPIONE 100±0 Abs 440 nm/g tessuto Mela 1,9 ±0,16 P.expansum 4,3 ±0,31 P.expansum+LS28 3 ±0,25 P.expansum P.exp+LS28+LF23 P.expansum+LF23 P.expansum+LS28+LF ±0, ±0,19 P.expansum P.expansum+ LS28+LF23 Bassa temperatura ha inibito crescita patogeno 4 C

21 Biocontrollo - Conclusioni Effetti di estratti colturali liofilizzati di L. edodes, dotati di attività antiossidante: inibizione germinazione conidi di P. expansum a tempi brevi, poi rallentamento germinazione stimolazione enzimi antiossidanti (CAT e GPX) del patogeno inibizione del 25% sintesi patulina in vitro stimolazione crescita e enzimi antiossidanti del lievito C. laurentii Individuato efficace sistema biocontrollo C. laurentii (LS28) + estratti colturali liofilizzati di L. edodes (LF23): inibizione in vivo, cioè su mele biologiche, di marciume e sintesi patulina

22 RILEVAMENTO CONTAMINAZIONE FUNGINA Risultati prove in vitro Gene target: pepg (poligalatturonasi) (Genebank, AF047713) Disegnate 2 coppie primer: Primer PG lunghezza frammento amplificato: 747 bp Primer PG1 lunghezza frammento amplificato: 135 bp Primer specifici P. expansum Aspergillus ochraceus Cladosporium sp Fusarium sp Alternaria sp P.expansum +Aspergillu s ochraceus +Fusarium sp Aspergillus ochraceus +Fusarium sp Primer sensibili 100 y = -0,9396Ln(x) + 36,996 R 2 = 0,9944 0,02 pg in PCR classica ct 0,0015 pg in Real Time PCR 10 1,00E+00 1,00E+02 1,00E+04 1,00E+06 1,00E+08 1,00E+10 pg DNA

23 Rilevamento precoce PCR - Risultati prove in vivo Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate con 15 µl di sospensione 10 4 conidi/ml (150 conidi) Incubate a 25 C per 6, 12, 24, 48, 72, 96, 136 h P. expansum rilevato dopo 12 ore dall inoculo. Limite rilevabilità: 3,9 pg Quantità DNA fungino rilevata 3,9 54 pg

24 PCR per monitorare P. expansum in mele in presenza di agenti di biocontrollo Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate alternativamente con il patogeno, con LS28, con LF23, con LS28+LF23 Incubate a 25 C per 6 gg 25 C campione ng DNA fungino estratto mg micelio mg micelio/ mg mela P.expansum 5,40E-02 3,19E-06 9,58E-07 P.exp+LS28 4,50E-03 2,66E-07 7,98E-08 P.exp+LF23 3,60E-02 2,13E-06 6,38E-07 P.exp+LS28+LF Analisi molecolare conferma azione di biocontrollo a temperatura ambiente: LS28+LF23 inibisce del 100% la crescita del patogeno

25 PCR per monitorare P. expansum in mele in presenza di agenti di biocontrollo Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate alternativamente con il patogeno, con LS28, con LF23, con LS28+LF23 Incubate a 4 C per 10, 25, 40 gg cont 10 gg 25 gg 40 gg trat cont trat cont trat 4 C La bassa temperatura rallenta notevolmente la crescita di Penicillium expansum, ulteriormente rallentata dalla presenza del sistema di biocontrollo P. expansum P. expansum+ LS28+LF23 ng DNA 1,08E-02 1,02E-02 mg micelio 6,38E-07 6,02E gg mg micelio/ mg 1,92E-07 1,81E-07 tessuto ng DNA 1,74E-02 1,17E-02 mg micelio 1,03E-06 6,91E gg mg micelio/ mg 3,09E-07 2,07E-07 tessuto ng DNA 2,37E-02 2,04E-02 mg micelio 1,40E-06 1,20E gg mg micelio/ mg 4,20E-07 3,62E-07 tessuto

26 Rilevamento precoce Real Time PCR - Risultati prove in vivo Mele (cv Golden Delicious) ferite sperimentalmente e inoculate con meno di 10 conidi del patogeno Incubate a 25 C per 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 ore pg DNA fungino/mg mela 6,0E-03 5,0E-03 4,0E-03 3,0E-03 2,0E-03 1,0E-03 campione 6 ore 12 ore pg di DNA fungino/mg tessuto 1,3E-04 2,6E-04 Mg micelio equivalenti / mg tessuto 7,7E-12 1,5E-11 0,0E ore 24 ore 48 ore 7,8E-04 1,1E-03 4,6E-11 6,3E-11 Quantità rilevata di DNA fungino/mg tessuto 0,00013 pg-0,0045 pg 72 ore 96 ore 120 ore 1,7E-03 2,6E-03 4,5E-03 1,0E-10 1,6E-10 2,6E-10 Rilevato DNA relativo a 5-10 conidi fungini già dopo 6 ore dall inoculo REAL TIME PCR PIU SENSIBILE DELLA PCR TRADIZIONALE (non ha rilevato DNA)

27 Rilevamento precoce Real Time PCR - Risultati prove in vivo Rilevato patogeno in tutti i campioni. Real Time PCR si conferma ottimo strumento di early detection di minimi inoculi del patogeno, potenziali inquinanti delle pomacee p g D N A fu n gin o / m g m e la 4,0E-01 3,5E-01 3,0E-01 2,5E-01 2,0E-01 1,5E-01 1,0E-01 5,0E-02 0,0E+00 Mele tradizionali Mele biologiche campioni Media 0,138 pg micelio/mg matrice Inoculo sufficiente a far sviluppare il patogeno dopo 10 giorni a 25 C

28 Rilevamento precoce - Conclusioni Individuate ottimali condizioni di PCR per monitorare crescita patogeno in vivo e per mettere in evidenza l azione di biocontrollo del sistema Cryptococcus laurentii + liofilizzato colturale di Lentinula edodes Individuate ottimali condizioni di Real Time PCR per early detection di Penicillium expansum su mele commerciali: tecnica più rapida e sensibile della tradizionale PCR

29 Conclusioni generali Individuato valido ed efficace sistema di biocontrollo del fungo patogeno Penicillium expansum su mela, rappresentato dal lievito Cryptococcus laurentii e dal filtrato colturale liofilizzato del basidiomicete edule Lentinula edodes. Tale sistema inibisce efficacemente sia la crescita fungina che la sintesi della patulina, grazie alla stimolazione del sistema antiossidante sia del patogeno che del lievito. Possibile utilizzo di un formulato naturale in celle di conservazione dei frutti. Messa a punto condizioni ottimali per tecniche molecolari (PCR e PCR real time) per l early detection del patogeno. Tecniche specifiche e sensibili, consentendo di rilevare quantità minime di P. expansum che rappresentano una fonte di rischio di inquinamento delle pomacee.