Micotossine aspetti introduttivi

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1 Micotossine aspetti introduttivi A. Ricelli,, A.A. Fabbri, M. Reverberi, S. Zjalic,, C. Fanelli

2 La crescita di microfunghi (muffe) provoca diverse alterazioni del substrato Nelle derrate alimentari: odori sgradevoli causati da diversi enzimi quali lipasi, proteasi ecc., alterazione del colore, produzione di tossine Una delle più importanti alterazioni è la formazione di MICTSSINE

3 Alcune specie fungine contaminano le derrate in campo, altre durante lo stoccaggio Funghi di stoccaggio Funghi di campo Fusarium culmorum F. graminearum F. avenaceum Alternaria alternata A.infectoria Cladosporium herbarum Claviceps purpurea P. cyclopium P.freii P. hordeii P. polonicum P. verrucosum P. aurantiogriseum P. viridicatum Aspergillus flavus, A.parasiticus Eurotium sp.

4 A. parasiticus Penicillium A. carbonarius verrucosum P. expansum A. ochraceus

5 Micotossine Metaboliti secondari prodotti da alcuni generi fungini (Aspergillus, Penicillium, Fusarium per es.) tossici in basse concentrazioni per i vertebrati (Samson, 1996) Il ruolo ecologico di molte di esse è ancora poco chiaro

6 Le micotossine possono avere un effetto dannoso a breve e/o a lungo termine sulle strutture cellulari e quindi sugli organi e sugli apparati Tra gli effetti tossici più importanti figurano: l induzione di alcuni tipi di tumore, l indebolimento del sistema immunitario Si calcola che il 40% dei decessi nei paesi in via di sviluppo può essere collegato al consumo di derrate contaminate da micotossine

7 Una derrata può essere contaminata da più specie fungine con presenza simultanea di diverse micotossine L effetto cumulativo può essere diverso da quello osservato per ciascuna tossina singolarmente

8 Alcune micotossine possono essere prodotte da specie diverse appartenenti allo stesso genere: AFLATSSINE Aspergillus flavus, A. parasiticus Altre vengono prodotte da funghi appartenenti a diversi generi CRATSSINA A Aspergillus ochraceus, A. carbonarius Penicillium verrucosum Una singola specie fungina può produrre diverse micotossine P. griseofulvum PATULINA GRISEFULVINA ACID CICLPIAZNIC

9 Le micotossine sintetizzate dai funghi tossigeni vengono normalmente rilasciate all esterno del micelio fungino e si ritrovano nell alimento contaminato A causa della loro persistenza queste possono diffondersi indipendentemente dall organismo fungino che le ha sintetizzate

10 Persistenza Dopo essere state sintetizzate, le micotossine normalmente rimangono nella derrata anche durante l immagazzinamento e il processing

11 Ci sono diversi punti critici per l ingresso di infezioni ungine e quindi per una possibile contaminazione da micotossine in una catena alimentare tipo: Micotossicosi primarie Micotossicosi secondarie Piante o loro prodotti (semi) fezione fungina ntesi di micotossine Consumo da parte di animali allevati Presenza nei tessuti Secrezione con il latte Prodotti carnei Formaggi Consumo da parte dell uomo e degli animali Consumo da parte dell uomo

12 Nelle matrici liquide la diffusione di micotossine è veloce e non lascia nessuna parte della derrata incontaminata Nelle matrici solide la diffusione è più lenta e non omogenea: contaminazione a spot

13 Contaminazione non omogenea Il campionamento offre particolari difficoltà Distribuzione non omogenea Distribuzione omogenea

14 Principali micotossine presenti negli alimenti AFB1 CH 3 AFM1 H CH 3 C H CH2 TA C N H H Cl H H H CH3 CH 3 H FB1 H H T-2 C CH2 CH3 C CH 3 C CH 3 NH 2 H H H CH3 CH3 H 3 H H CH 3 H N H CH 2 CH 3 H H ZEA

15 Inquinamento da aflatossine Problema mondiale, contaminazione in campo e/o nel post raccolta Presente in molte derrate alimentari (semi oleosi, mais, frutta secca, caffè) e mangimi

16 Negli ultimi 40 anni sono stati effettuati numerosi studi sulla sintesi di aflatossine ggi si conosce l intero cluster genico che presiede la loro sintesi, anche se la regolazione della sua espressione non è stata completamente compresa

17 Dopo l ingestione, viene attivata dal citocromo P450 formando un epossido in grado di legarsi alle basi puriniche, inducendo in questo modo genotossicità e citotossicità Cancerogeno per gli animali e l uomo, organo target: fegato AFB1 CH3

18 cratossina A Prodotta da alcune specie di Aspergillus e Penicillium Rilevata in semi di mais, orzo, grano, in diversi paesi Europei e in USA Rilevata anche nella birra e nel vino La crescita di Aspergillus tossigeni sembra legata alle condizioni di alta umidità e temperatura Alcune specie di Penicillium si sviluppano però anche a basse temperature (5 C)

19 Inibitore competitivo della sintesi proteica attraverso la soppressione della fenilalanina RNA sintetasi Incrementa la perossidazione lipidica. Nefrotossico, incluso nella lista di composti potenzialmente cancerogeni

20 Zearalenone Metabolita secondario prodotto da diverse specie di Fusarium Contaminante di vari cereali in particolare mais

21 Micoestrogeno capace di legare i recettori cellulari in luogo dell estrogeno provocando così una sintomatologia tipica negli animali da allevamento (sterilità e ridotta produzione di latte) Zearalenone

22 Fumonisine Prodotte da diverse specie di Fusarium La Fumonisina B 1 è la più frequente e la più tossica Possono causare la leukoencephalomalacia (gravi danni cerebrali) nei cavalli

23 Queste molecole inibiscono la sintesi degli sfingolipidi attraverso l inibizione dell enzima ceramide sintetasi. Questa attività porta all accumulo di alcuni precursori tossici degli sfingolipidi: le sfinganine. Le Fumonisine possono inoltre indurre perossidazione lipidica e alterazioni nel DNA

24 Tricoteceni Gruppo di composti chimici correlato, prodotto da alcuni Fusarium spp, Cephalosporium spp e Trichoderma spp Inibitori della sintesi proteica La più diffusa, e meno tossica, è la vomitossina (DN)

25 La tossina T-2 considerata responsabile di Aleukia alimentare che in Russia tra il 1942 e 1947 provocò la morte di persone Malattia caratterizzata da macchie sulla pelle, emorragie interne multiple, consumo di midollo osseo

26 Patulina Prodotta da alcune specie di Aspergillus e Penicillium che crescono sui frutti e si ritrovano nei succhi di frutta (in particolare succo di mela) Ha proprietà antibiotiche

27 Causa emorragie cerebrali, gastriche e polmonari Patulina Sospetto cancerogeno

28 Incubazione a 28 C Produzione di aflatossine da parte di A. parasiticus su sementi aflatossine (g/kg) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, grano mais arachidi girasole giorni

29 Limiti di legge per la presenza di alcune micotossine negli alimenti

30 AFLATSSINE ommission regulation n Dec. 2003) pezie (peperoncino, pepe, paprika) 5 µg/kg (B 1 ); 0 µg/kg (B +B +G +G ). ereali e loro prodotti destinati al consumo umano µg/kg (Solo B 1 ); 4 µg/kg (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ). rachidi: 2 µg/kg (Solo B 1 ); 4 µg/kg B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) se destinate al consumo umano iretto. ais da sottoporsi a cernita o altro trattamento sico prima del consumo umano diretto o del suo tilizzo come ingrediente: 5 µg/kg (Solo B 1 ); 0 µg/kg (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ).

31 CRATSSINA A Commission regulation n Jan 2005 Cereali grezzi: 5 µg/kg. Vino, prodotti derivati e succo d uva: 2µg/Kg Caffè: 5 µg/kg; Caffè solubile: 10 µg/kg; Prodotti per l infanzia: 0.5 µg/kg PATULINA Commission regulation n Aug Succo di frutta 50µg/Kg; Prodotti per l infanzia a base di mele: 10µg/Kg

32 DESSINIVALENL ommission regulation n June 2005 rano duro e avena non trasformati: 1750 µg/kg; asta secca: 750 µg/kg; ane e paste secche o biscotti: 500 µg/kg. ZEARALENNE ereali grezzi diversi dal mais: 100 µg/kg; ane, biscotti e cereali da colazione: 50 µg/kg; rodotti per l infanzia a base di cereali: 20 µg/kg.

33 TLC Rilevamento della contaminazione fungina da micotossine orfologia DNA ngerprinting Profilo degli Isoenzimi Profilo dei metaboliti secondari fronte del solvente ELISA HPLC C B A

34 Cromatografia su strato sottile (TLC) TLC fronte del solvente C B A Corsa cromatografica con opportuna fase mobile La freccia indica la direzione di flusso della fase mobile

35 Cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC) Schema del sistema HPLC costituito da: Pompa Sistema di iniezione Colonna Detector (rivelatore) Data system

36 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Principio dell ELISA competitiva (CD-ELISA) 1 1. Anticorpi (monoclonali o policlonali) adsorbiti sulla superficie del pozzetto 2 2. Aggiunta del coniugato antigene-enzima e competizione con l antigene in soluzione (campione reale) 3 3. Risultato della reazione di competizione

37 La tecnologia dei sensori Particolare tecnologia (electronic nose) che utilizza i composti odorosi e volatili prodotti dai funghi come indicatori del biodeterioramento dei materiali Il naso elettronico è stato già messo a punto per l analisi della qualità dei cereali stoccati e di processi industriali in campo alimentare (vino, latte)

38 Scopo: sviluppo di un sistema di rilevamento della crescita di funghi tale da individuare le infezioni molto prima che l olfatto umano percepisca il caratteristico odore di muffa

39 Smart Glass Array di sensori in silicio amorfo idrogenato (a:si-h) integrato con una lastrina cromatografica RADIAZINE UV campione Gel di silice 150 µm VETR 1mm VETR 1mm TC a-si:h fotodiodo 1µm Metallo Deposizione: 2 µl di solvente contenente il campione

40 Camera cromatografica Costruita in TEFLN Sviluppo orizzontale rray di sensori con ntatti elettrici Connessioni

41 Controllo della produzione di micotossine Prevenzione Detossificazione Tecniche di breeding Uso di composti di sintesi Buone pratiche agronomiche Metodi fisici Metodi chimici Uso di sostanze adsorbenti

42 Principali linee di ricerca Aflatossine -Aspergillus parasiticus, A. flavus Ruolo dello stress ossidativo (RS) nel differenziamento e nella sintesi di aflatossine Controllo della produzione di aflatossine da parte di antiossidanti di diverso tipo e attraverso alcuni metaboliti prodotti da basidiomiceti eduli con proprietà medicinali

43 Lo stress ossidativo stimola la produzione di aflatossine nei funghi tossigeni La biosintesi delle aflatossine è indotta da epossidi, aldeidi, chetoni, ergosterolo perossidato, tetracloruro di carbonio e altri alogenometani I lipoperossidi prodotti da mais in risposta all infezione con A. flavus e A. parasiticus stimolano la produzione di aflatossine Diversi antiossidanti ne bloccano la sintesi in vitro e in vivo

44 Basidiomiceti e farmacologia In oriente la medicina tradizionale utilizza sia funghi basidiomiceti che piante medicinali Quasi ad ogni specie è stato attribuito qualche potere curativo Dal 1960 anche la scienza ufficiale effettua ricerche in questo settore Individuati molti composti con azione farmacologica, spesso antiossidante

45 Tra i composti maggiormente studiati polisaccaridi e glicoproteine Documentate proprietà antivirali e anticancerogene, stimolazione del sistema immunitario in animali e uomo Proteggono le cellule del sangue dalle conseguenze dello stress ossidativo Possono prevenire i danni da aflatossicosi

46 Trametes versicolor Lentinula edodes omposti attivi: SK glicoproteina ntiossidante, stimola il stema immunitario, antivirale) SP glicoproteina ntitumorale, stimola il sistema munitario) Composti attivi: Lentinano β1-4 glucomannano Ep3 piccola molecola di lignina (stimola il sistema immunitario) Tioprolina aminoacido (antiossidante)

47 Effetto dei filtrati colturali (2%) di L. edodes e T. versicolor sulla produzione di aflatossine da parte di A.parasiticus % aflatossine Lentinula edodes cont CF 21 CF 23 CF 42 CF 43 3 g 6 g 9 g % aflatossine Trametes versicolor cont CF 74 SMR 117 CF 227 CF 261

48 cratossina A (TA) Aspergillus ochraceus, A. carbonarius, Penicillium verrucosum Correlazione tra la produzione di questi metaboliti e lo status perossidativo cellulare. Studio della possibilità di utilizzo di un sensore al silicio amorfo per l analisi di TA in diverse matrici complesse di tipo alimentare

49 Butil idrossianisolo (BHA) Composto fenolico food grade dotato di proprietà antiossidanti e antimicrobiche. Contrasta le reazioni a catena che portano alla propagazione della cascata radicalica e quindi alla diffusione dei fenomeni perossidativi.

50 Resveratrolo Composto polifenolico con attività antiossidante sintetizzato da diverse specie di piante (Vitis vinifera, Polygonum cuspidatum) Fitoalessina Inibitore della lipossigenasi e della cicloossigenasi Agente chelante degli ioni Cu ++ Scavenger di radicali liberi Utilizzato in campo medico per le sue proprietà di antiaggregante piastrinico, antiossidante e antinfiammatoria

51 BHA e resveratrolo inibiscono la produzione di TA in cereali Erg ppm 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ,95 0,85 0,95 0,85 0,95 0,85 0,95 0,85 0,95 0,85 Ctr BHA 0.02% Resv 230 Resv 23 ppm Lf 4% TA ppb Erg TA

52 Patulina-Penicillium expansum Isolamento di microorganismi capaci di crescere in presenza di questa micotossina Ricerca di microorganismi capaci di controllare la contaminazione fungina e da patulina

53 Identificazione dei lieviti isolati da mela ATCC: American Type Culture Collection, USA; NRRL: Agricultural Research Service Culture ollection, USA; CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands. Cifra sottolineata: numero di ccesso a GenBank per il ceppo indicato. Percentuale di nucleotidi simili delle sequenze nel dominio D1/D2 tra gli isolati e un ceppo in GeneBank. PCR dominio D1/D2 del 26S rdna - Kurtzman e Robnett (1998) Cepp o Lunghezza della sequenza (bp) Ceppo più simile a Similarità (%) b Nome L1 586 NRRL Y-7686 U ,8 Pichia nakasei L2 587 CBS 9683 AJ ,0 Debaryomyces hansenii L3 591 ATCC AF ,0 Rhodotorula glutinis L4 581 CBS 5740 AY ,5 Candida sake L5 593 CBS AY ,5 Discosphaerina fagi

54 rasformazione e degradazione della patulina da parte d C. sake isolato da mele con sintomi di marciume. Prova effettuata in succo di mela commerciale. 15 Pat Ascl 10 mg/l 5 0 C. sake (L4) Controllo Bianco

55 Una alimentazione sana è indispensabile per il mantenimento della salute. L informazione e la consapevolezza aiutano a realizzarla