FUNGHI AFLATOSSIGENI CONDIZIONI DI CRESCITA TOSSINOGENESI. T= C Topt=28 C Aw minimo= 0,85

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1 EARLY DETECTION DI CONTAMINANTI FUNGINI TOSSIGENI SU SEMI DI CEREALI E LORO PRODOTTI DERIVATI ATTRAVERSO LA SPETTROSCOPIA DI IMMAGINE E ATTRAVERSO TECNICHE MOLECOLARI Antonella Del Fiore

2 FUNGHI AFLATOSSIGENI!APPARTENENTI QUASI ESCLUSIVAMENTE AL GENERE ASPERGILLUS SEZ. FLAVI Aspergillus flavus. Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius! CONTAMINANTI PREFERENZIALI DI POST RACCOLTA CONDIZIONI DI CRESCITA Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus T= C Topt=32 C U= 15-30% Aw minimo= 0,78 TOSSINOGENESI T= C Topt=28 C Aw minimo= 0,85

3 "ISOLATE PER LA PRIMA VOLTA DA A.FLAVUS (1963) " COMPOSTI ETEROCICLICI ALTAMENTE OSSIGENATI (Difurocumarociclopentenoni e difurocumarolattoni) " ELEVATA ATTIVITA BIOLOGICA 17 AFLATOSSINE AD OGGI ISOLATE " 4 PRINCIPALI AFLATOSSINE AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 e AFM1 (derivante dalla AB 1 ) CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE " Basso peso molecolare " Alto punto di fusione " Stabilità alle alte temperature " Scarsa idrosolubilità " Fluorescenza naturale

4 FEGATO ORGANO BERSAGLIO PRINCIPALE!EPATOTOSSICITA!IMMUNOTOSSICITA, GENOTOSSICITÀ AFM1!PROBABILE CANCEROGENICITA AGENTE CANCEROGENO GRUPPO 2 AFB1!EPATOCANCEROGENICITA AGENTE CANCEROGENO GRUPPO 1 (AIRC, 1993) SOGLIA MASSIMA DI ASSUNZIONE CON LA DIETA LIVELLO PIÙ BASSO POSSIBILE (AS LOW AS REASONABLE ACHIEVABLE, ALARA).

5 !MATRICI AD ALTO TENORE IN CARBOIDRATI O LIPIDI (SEMI OLEAGINOSI, SPEZIE, FRUTTA ESSICCATA E CEREALI)!MAIS CEREALE CONTAMINATO CON MAGGIORE FREQUENZA!FILIERA MAIDICOLA: NEL 2003 GRAVE PROBLEMA DI CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE ELEVATO GRADO DI CONTAMINAZIONE AFB1 IN GRANELLA DI MAIS ELEVATO GRADO DI CONTAMINAZIONE AFM1 IN LATTE E DERIVATI CARRY OVER

6 Reg.to CE 1881/2006 Tenori massimi di micotossine nei prodotti alimentari METODI DI ANALISI UFFICIALI AFLATOSSINE TOTALI AFLATOSSINA B1 AOAC /97 ISTISAN n.10 09/06/1999 METODI CROMATOGRAFICI (HPLC) SISTEMA DI RILEVAZIONE FLUORIMETRICO (! emissione = 440 nm)

7 INDIVIDUAZIONE PRECOCE DELLE SPECIE FUNGINE AFLATOSSIGENE RAPPRESENTA SVILUPPO DI UNA METODICHE DELLE STRATEGIE ANALITICHE PIU PER EFFICACI IL RILEVAMENTO PER LA PREVENZIONE PRECOCE ED IL CONTROLLO DELLA DI FUNGHI CONTAMINAZIONE AFLATOSSIGENI DA AFLATOSSINE (Aspergillus spp. Sezione Flavi) IN MAIS! MEDIANTE SPETTROSCOPIA D IMMAGINE! MEDIANTE PCR (CLASSICA E REAL-TIME q-pcr)

8 IBRIDI DI MAIS Zea mays L. FARINE COMMERCIALI CARATTERIZZAZIONE DEGLI ISOLATI A LIVELLO DI SPECIE CON CRITERI MORFOLOGICI E CON APPROCCIO SPETTRALE

9 TECNICA ANALITICA NON DISTRUTTIVA IMAGING TECNICA ANALITICA SPETTROSCOPIA COMBINATA, CARATTERIZZAZIONE PROPRIETA DI SUPERFICIE CARATTERIZZAZIONE PROPRIETA SPETTRALI

10 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, L u n g h e z z a d ' o n d a ( n m ) TIPICA CONFIGURAZIONE DI UN SISTEMA PER LA SPETTROSCOPIA D IMMAGINE ROI 1 ROI 2 Pagina del software Spectral Scanner v. 2.0 DV s.r.l. (2003) per l acquisizione e l elaborazione delle immagini di riflettanza spettrale. PROVE SPERIMENTALI DESKTOP SPECTRAL SCANNER IMSPECTOR V10 -SPECIMTM, INTERVALLO SPETTRALE nm

11 ACQUISIZIONE ED ARCHIVIAZIONE IMMAGINE SPETTRALE DEL CAMPIONE SELEZIONE SULL IMMAGINE DELLA REGIONE DI INTERESSE (ROI) ELABORAZIONE SPETTRI DI RIFLETTANZA PER TUTTI I PUNTI DELL AREA SELEZIONATA RIFLETTANZA RELATIVA DEL CAMPIONE: RAPPORTO, IN OGNI PUNTO TRA IMMAGINE SPETTRALE DEL CAMPIONE E IMMAGINE SPETTRALE DEL BIANCO

12 ARTICOLAZIONE DELLE FASI DI RICERCA #$ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE IMMAGINI SPETTRALI SPECIE FUNGINE VERIFICARE SE IL METODO ANALITICO RENDE POSSIBILE RILEVARE LA PRESENZA DI FUNGHI AFLATOSSIGENI IN MAIS SULLA BASE DI DIFFERENZE SPETTRALI SIN DALLE PRIMISSIME FASI DELLA CONTAMINAZIONE %$ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE IMMAGINI SPETTRALI DA MAIS NON CONTAMINATO CONTAMINATO ARTIFICIALMENTE NATURALMENTE CONTAMINATO &$ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI SPETTRALI

13 ACQUISIZIONE IMMAGINI SPETTRALI SPECIE FUNGINE CONTAMINANTI DEL MAIS ACQUISIZIONE DELLE IMMAGINI SPETTRALI DA MAIS PROFILI SPETTRALI DIFFERENTI TRA SPECIE FUNGINE DIFFERENTI Spettri PROFILI registrati SPETTRALI dopo 7 giorni DIFFERENTI di crescita a 30 C DI DIFFERENTI SPECIE FUNGINE IBRIDI DI MAIS DIFFERENTI CARATTERIZZATI DA UGUALE PROFILO SPETTRALE

14 VALUTAZIONE DELL INFLUENZA SUL PROFILO SPETTRALE DEL MAIS DI: " COLORAZIONE CARIOSSIDI ' MICROFLORA NATURALE CARIOSSIDI! GRADO DI UMIDITA (UA) DELLE CARIOSSIDI "DIFFERENZE SPETTRALI SIGNIFICATIVE TRA MAIS AD ELEVATA DIFFERENZA DI COLORAZIONE (CECILIA/RED) (ANOVA -Fisher s LSD test ) INDIPENDENZA DEL SEGNALE SPETTRALE 'dalla microflora naturale delle cariossidi! dal grado di umidita (UA) delle cariossidi CECILIA CORNIOLA RED FIRMA SPETTRALE UNICA DEL MAIS

15 ANALISI DELLE VARIAZIONI SPETTRALI DETERMINATE DALLO SVILUPPO FUNGINO SULLA SUPERFICIE DEL MAIS ATTRAVERSO ACQUISIZIONE ED ANALISI SPETTRI DI MAIS CONTAMINATO ARTIFICIALMENTE IN CONDIZIONI DI INOCULO CONTROLLATO A.flavus A.niger 24 h 72h MAIS C.V. CECILIA 30% UA, 0,99 A W INOCULO SOSPENSIONE CONIDICA FUNGHI (100 conidi *g- 1 mais) ACQUISIZIONE GIORNALIERA "t 10 GIORNI

16 Spettri medi di assorbanza apparente di mais inoculato con singole specie fungine a 1, 2, 3 e 7 giorni dall inoculo su mais. Spettri medi di assorbanza apparentedi mais inoculato con singole specie fungine, a 1, 2, 3 e 7 giorni dall inoculo su mais. DUE INTERVALLI Per tutti DI i LUNGHEZZA campioni analizzati, D ONDA, RISULTATI e per tutte le nm specie e fungine nm testate (Pearson et al., 2006)

17 A (log1/r) norm A (log1/r) norm 2,4 1,6 0,8 0,0-0,8-0,2-0,6-1,0-1,4 Mais inoculato con Aspergillus flavus ! (nm) Bianco 1 g 2 g 3 g 7 g Mais inoculato con Aspergillus flavus A (log 1/R) norm A (log 1/R) norm 2,4 1,6 0,8 0,0-0,8-0,2-0,6-1,0-1,4 Mais inoculato con Aspergillus parasiticus ! (nm) Bianco 1g 2g 3g 7g Mais inoculato con Aspergillus parasiticus ! (nm) Bianco 1g 2g 3g 7g A (log 1/R) norm A (log 1/R) norm 2,4 1,6 0,8 0,0-0,8-0,2-0,6-1,0-1,4 Mais inoculato con Aspergillus niger ! (nm) Bianco 1 g 2 g 3 g 7 g "! nm: ASSORBANZA MAIS INOCULATO > RISPETTO AL MAIS NON INOCULATO ! (nm) Bianco 1 g 2 g 3 g 7 g Mais inoculato con Aspergillus niger ! (nm) Bianco 1 g 2 g 3 g 7 g "! nm: ASSORBANZA MAIS INOCULATO < RISPETTO AL MAIS NON INOCULATO

18 535 nm!variazioni spettrali in mais contaminato con Aspergillus niger maggiori rispetto a quello contaminato con Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus!andamento caratteristico mais inoculato con Aspergillus niger con punto di flesso a 535 nm Spettri medi di assorbanza apparente di mais inoculato con differenti specie fungine registrati a 3 giorni dall inoculo su mais

19 ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI SPETTRALI DIFFERENZE SPETTTRALI STATISTICAMENTE SIGNIFICATIVE TRA IL MAIS NON CONTAMINATO ED IL MAIS CONTAMINATO CON ASPERGILLUS FLAVUS A PARTIRE DA: 72 h di infezione (PCA+ DA, livello di confidenza del 95%)!48 h di infezione a! 410 nm e 470 nm (PCA+ ANOVA, Fisher s LSD test, livello di confidenza del 95%) Il metodo permette di rilevare la presenza di Aspergillus flavus a 48 h dall inoculo su mais, prima che il fungo diventi evidente ad osservazione visiva

20 METODO ANALITICO BASATO SULLA SPETTROSCOPIA D IMMAGINE!METODO RAPIDO E SUFFICIENTEMENTE SENSIBILE PERMETTE DI RILEVARE LA CONTAMINAZIONE FUNGINA A 48 h dall infezione! UTILIZZABILE COME METODO DI RICONOSCIMENTO FUNGINO SPECTRAL MATCHING TRA SPECIE FUNGINE CON PROFILI SPETTRALI NOTI E SPECIE FUNGINE INCOGNITE

21 SVILUPPATE METODICHE BIOMOLECOLARI BASATE SULLA PCR PER IL RILEVAMENTO DI FUNGHI AFLATOSSIGENI " Metodica semiquantitativa basata sulla PCR CLASSICA " Metodica quantitativa basata sulla REAL-TIME qpcr IMPIEGO DI MARCATORI MOLECOLARI SPECIFICI GENI TARGET COINVOLTI NELLA VIA BIOSINTETICA DELLE AFLATOSSINE Afl R PERMETTONO DI RILEVARE LA PRESENZA DI SPECIE FUNGINE POTENZIALMENTE AFLATOSSIGENE Afl M Afl P

22 SVILUPPO DEL METODO MOLECOLARE PCR E REAL TIME qpcr 1. SVILUPPO DEL PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE CON DNA FUNGINO PURO!VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA E DELLA SENSIBILITA DEL METODO SPECIFICITA SENSIBILITA Verificata testando la coppia di primer Quantita minima di DNA fungino rilevabile 2. VERIFICA scelta DELLA per l amplificazione SPECIFICITA, SENSIBILITA E FATTIBILITA Determinata DEL amplificando METODO con SU MATRICE i primer selezionati REALE del frammento genico di interesse con DNA diluizioni seriali di DNA genomico della specie fungina estratto da differenti specie fungine di interesse Curva standard per analisi semiquantitativa 2.a. DNA TOTALE ESTRATTO DA MATRICE CONTAMINATA ARTIFICIALMENTE IN CONDIZIONI DI INOCULO CONTROLLATO VERIFICA DELLE Amplificazione PROPRIETA PCR di DI DNA EARLY estratto, DETECTION a tempi differenti DEL METODO di infezione, da matrice DETERMINAZIONE contaminata DELLA artificialmente CAPACITA DEL METODO DI MONITORARE LO SVILUPPO DEL FUNGO SU MATRICE E con inoculo minimo di una sospensione PERMETTERNE LA RILEVAZIONE FIN DALLE PRIME FASI conidica DELLA del CONTAMINAZIONE fungo di interesse 2.b. DNA TOTALE ESTRATTO DA MATRICE NATURALMENTE CONTAMINATA APPLICAZIONE DEL PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE A MATRICE NON CONTAMINATA ARTIFICIALMENTE (MATRICE T.Q) CONFERMA DELLA EFFICACIA DEL METODO ATRAVERSO PROVE DI ISOLAMENTO MICOTICO TRADIZIONALI

23 VERIFICATA SOTTOPONENDO AD AMPLIFICAZIONE PER PCR DNA ESTRATTO DA:!FUNGHI ASPERGILLUS SEZIONE FLAVI (Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus)!altri FUNGHI ASPERGILLUS (Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger)!funghi NON ASPERGILLUS (Fusarium sp., Rhizopus sp.)!biomasse FUNGINE MISTE A. flavus A. parasiticus AMPLIFICAZIONE ESCLUSIVA CON DNA DI A. FLAVUS E A. PARASITICUS Gel Agarosio 1% PCR di DNA estratto da micelio fungino da colture pure

24 CURVA STANDARD DNA GENOMICO DI A.FLAVUS 3357 MONITORAGGIO DELLO SVILUPPO DI A. FLAVUS SU MAIS GENE TARGET Afl M INTERVALLO (100 ng-5pg) LIMITE DI RILEVABILITA : 12 h dopo inoculo con 100 conidi QUANTITA MINIMA RILEVABILE DI DNA DI A.FLAVUS 10 pg IL METODO PERMETTE QUINDI IL IL FUNGO A 12 h DALL INOCULO SU MAIS RILEVAMENTO PRECOCE DI ASPERGILLUS FLAVUS NON E ANCORA RILEVABILE AD OSSERVAZIONE ALLO SU MAIS STEREOMICROSOPIO

25 SVILUPPATO UN METODO PER IL RILEVAMENTO QUANTITATIVO DI FUNGHI ASPERGILLUS spp. SEZIONE FLAVI SU MAIS ATTRAVERSO REAL-TIME qpcr (Colorante Sybr-green) Gene target: Afl R Frammento amplificato: 352 bp AMPLIFICAZIONE SEQUENZA TARGET E CONTEMPORANEA QUANTIFICAZIONE PER MEZZO DI UN DETECTOR A FLUORESCENZA IDENTIFICAZIONE CERTA DELLA SEQUENZA TARGET RISPETTO A PRODOTTI ASPECIFICI (Curve di melting)

26 CURVA STANDARD DNA PLASMIDICO A. FLAVUS Gene target Afl R MONITORAGGIO DELLO SVILUPPO FUNGINO SU MAIS DNA DNA DILUIZIONI SERIALI STANDARD DNA PLASMIDICO GENE aflr INTERVALLO ( ) pg, LIMITE DI RILEVABILITA 6 h QUANTITA MINIMA DNA FUNGINO RILEVABILE 10-3 pg IL DNA FUNGINO SU MAIS E RILEVATO E QUANTIFICATO DOPO SOLE 6 h DALL INOCULO RISPETTO ALLE 12 h DELLA PCR CLASSICA! IL METODO PERMETTE DI RILEVARE QUANTITA DI DNA DI FUNGHI AFLATOSSIGENI 10 4 VOLTE INFERIORI A QUELLE DELLA PCR TRADIZIONALE

27 DETERMINAZIONE E QUANTIFICAZIONE DI DNA DI ASPERGILLUS CONFERMA FLAVUS IN MAIS DEL E METODO FARINE COMMERCIALI SU MATRICE NON NATURALMENTE CONTAMINATI ARTIFICIALMENTE CONTAMINATA!Min: (0,122 pg/gmais) CAMPIONI DNA mg (pg/g.mais) mic. DKC 6843!Max: (180297pg/g mais) LATINA 89,45±0,27 <0,001 SIV DK ,65 ±0,16 0,007 DKC ,122±0,007 <0,001 ARSANO 10,95±0,20 <0,001 COSTANZA 28,23±0,27 <0,001 CECILIA 13,70±0,18 <0,001 NK-CRISO 175,64 ±0,25 0,001 CORNIOLA 7,75±0,12 <0,001 DUENDE 293,65 ±0,37 <0,007 DKC ,59±0,22 <0,001 SIV ±248,55 4, ±77,78 1,87 SIV 6450 MITIC DK 537 FARINA 3 CONTROLLO (CECILIA) nd nd p g/g.mais FARINA p 1g/g.mais 70,96±0,35 494,65 p g/g.mais <0, , FARINA 2 79,37±0,29 <0,001 FARINA 3 104,08 ±0,68 <0,001 FARINA 4 5,43±0,20 nd SVILUPPO EVIDENTE MICELIO A. FLAVUS DOPO 4 GIORNI SU IBRIDI A PIU ALTA CONCENTRAZIONE IN DNA FUNGINO < 0,001mg micelio 4,12 mg micelio p g/g.farina GLI IBRIDI A MINORE CONCENTRAZIONE DI DNA FUNGINO NON HANNO INVECE EVIDENZIATO SVILUPPO DI A.FLAVUS NEI PRIMI 7 GIORNI DKC 6843

28 METODO DI EARLY DETECTION MOLECOLARE!ELEVATA SPECIFICITA E SENSIBILITA!METODICA SEMIQUANTITATIVA MEDIANTE PCR CLASSICA Primer per afl P e afl M ' rilevabilità della contaminazione da Aspergillus flavus dopo 12 h! METODICA QUANTITATIVA MEDIANTE REAL-TIME qpcr Primer per afl R ' rilevabilità della contaminazione da Aspergillus flavus dopo 6 h

29 !METODI ANALITICI AFFIDABILI E SENSIBILI!RILEVAZIONE PRECOCE DI BASSI LIVELLI DI CONTAMINAZIONE FUNGINA!RAPIDITA DI ESECUZIONE!SVILUPPO DI SISTEMI PORTATILI O AUTOMATIZZATI PER DETERMINAZONI IN SITU O ON-LINE (SPETTROSCOPIA D IMMAGINE)!RIDUZIONE DELL IMMISSIONE NELLE FILIERE AGROALIMENTARI DI SOSTANZE CARCINOGENE

30 LABORATORI DI RIFERIMENTO! Università La Sapienza di Roma Dipartimento di Biologia vegetale - Laboratorio di micologia e patologia vegetale;!università La Sapienza di Roma - Facoltà Ingegneria - Polo di Latina Laboratorio per la caratterizzazione dei materiali particolati (Prof. Bonifazi);! ENEA Centro Ricerche Casaccia, Unità Tecnico Scientifica BIOTEC.! TUTOR Dipartimento Biologia Vegetale: Prof. Corrado Fanelli;! Referente ENEA: Dott. Roberto Balducchi RESPONSABILE SEZIONE SVILUPPO SOSTENIBILE - UNITA TECNICO SCIENTIFICA BIOTEC ENEA, Centro Ricerche Casaccia.

31 RINGRAZIAMENTI Ringrazio il Dottor Roberto Balducchi, Responsabile della Sezione BIOTEC-AGRO del Centro ENEA Casaccia (Roma) e Tutor per le attività del mio Dottorato, il Dottor Gennaro Di Giorgio ed il Dottor Stefano Canese del Centro ENEA Casaccia (Roma), per l opportunità offertami di conseguire il Dottorato in Scienze Botaniche nell ambito delle attività svolte in questi anni. Ringrazio anche il Prof. Corrado Fanelli, il Dottor Massimo Reverberi, la Dottoressa Anna Adele Fabbri, la Dottoressa Alessandra Ricelli, ricercatori presso il Laboratorio di micologia e patologia vegetale -Dipartimento di Biologia Vegetale -Università La Sapienza di Roma, per la competenza GRAZIE con la quale PER mi L ATTENZIONE hanno assistita e guidata nel corso delle attività di ricerca sperimentali condotte nell ambito della tesi. Infine un ringraziamento al Prof. Giuseppe Bonifazi, alla Dottoressa Silvia Serranti ed alla Dottoressa Laura D Aniello del Laboratorio per la caratterizzazione dei materiali particolati dell Università La Sapienza di Roma, Facoltà Ingegneria - Polo di Latina, presso cui ho svolto la parte dell attività di ricerca relativa alla Spettroscopia d Immagine.