Micotossine. Introduzione

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1 Micotossine Le micotossine sono molecole prodotte dal metabolismo secondario di funghi microscopici e filamentosi (muffe), che possono causare manifestazioni di tossicità acuta e cronica negli animali e nell uomo (Piva et al., 2002). La formazione di queste sostanze molto tossiche e a basso peso molecolare, subordinata alla presenza di un ceppo di muffe tossigene, dipende da condizioni di squilibrio nutrizionale che portano a vie metaboliche secondarie (Miraglia e Brera, 1999). Le micotossicosi sono pertanto riconducibili solo alla presenza di miceti tossigeni e legate principalmente all ingestione di alimenti contaminati, prive quindi di contagiosità e trasmissibilità (Hussein e Brasel, 2001). Tuttavia la presenza di muffe in una derrata alimentare non implica necessariamente la presenza di micotossine, mentre derrate apparentemente integre possono risultare contaminate (Miraglia, 2001). Sono stati isolati e caratterizzati chimicamente oltre 300 tipi di micotossine (Betina, 1984; Galvano et al., 2001), delle quali solo per alcune sono chiari gli effetti tossici, in particolare per quelle responsabili di patologie rilevanti nell uomo e negli animali, sia di interesse zootecnico che da compagnia. Rivestono particolare importanza da questo punto di vista le aflatossine (AF), le ocratossine (O), i tricoteceni, lo zearalenone (ZEA), le fumonisine (F) e gli alcaloidi della Claviceps. Occasionalmente possono essere prese in considerazione anche altre molecole prodotte dal metabolismo secondario dei funghi filamentosi, quali la sterigmatocistina, la citrinina e la patulina. I più importanti generi di funghi produttori di micotossine sono Aspergillus, Penicillium, Fusarium e Claviceps, (Tabella 1) (Piva et al., 2002). 2

2 FUNGHI Genere Aspergillus A. flavus MICOTOSSINE PRODOTTE Aflatossine B 1, B 2, acido ciclopiazonico A. parasiticus Aflatossine B 1, B 2, G 1, G 2 A. versicolor Sterigmatocistina A. alutaceus (A. ochraceus) Ocratossina A, citrinina, acido penicillio A. clavatus Patulina, altre neurotossine Genere Penicillium P. verrucosum Ocratossina A, citrinina P. expansum Patulina Genere Fusarium F. graminerarum (deossinivalenolo,nivalenolo,diacetossisciperolo, tossina T-2), zearalenone F.culmorum (deossinivalenolo,nivalenolo,diacetossisciperolo, tossina T-2), zearalenone F. poae (deossinivalenolo,nivalenolo,diacetossisciperolo, tossina T-2), zearalenone F. sporotrichioides (deossinivalenolo,nivalenolo,diacetossisciperolo, tossina T-2), zearalenone F. moniliforme Fumonisine F. proliferatum Fumonisine Genere Claviceps C. purpurea Alcaloidi (ergotine) Tabella 1 Funghi tossigeni più comunemente responsabili della produzione di micotossine negli alimenti e nei mangimi. 3

3 Gli alimenti maggiormente esposti alla contaminazione diretta sono soprattutto i prodotti vegetali quali cereali (mais, orzo, riso, avena e sorgo), semi oleaginosi (arachidi, girasole e cotone), frutta secca e fresca, legumi, spezie, caffè e cacao. E stata inoltre documentata la possibilità di sviluppo fungino e la relativa produzione di micotossine su formaggi ed insaccati durante le fasi di maturazione (Miraglia e Brera, 1999); in particolare è stato visto che in opportune condizioni climatiche il genere Fusarium può sviluppare su prodotti carnei salati (Zamborelli et al., 1992). I prodotti di origine animale subiscono con maggior frequenza una contaminazione di tipo indiretto, dovuta all ingestione da parte del bestiame di mangimi contaminati (Miraglia, 2001). La contaminazione fungina e la produzione di micotossine può avvenire in campo, durante la coltivazione, oppure durante lo stoccaggio delle derrate alimentari. La contaminazione e la produzione di micotossine da Fusarium avviene prevalentemente durante la coltivazione, mentre quelle da Aspergillus e Penicillium si verificano soprattutto durante lo stoccaggio degli alimenti (Borreani et al., 2003). I fattori che influenzano lo sviluppo fungino sono molteplici (Tabella 2): a W (attività dell acqua), competizione microbica, ph, temperatura, ossigeno, pratiche di coltivazione e conservazione delle derrate (Aureli, 1996; Miraglia e Brera, 1999). Il parametro di maggior rilievo è l a W. La colonizzazione fungina degli alimenti avviene generalmente a livelli di a W inferiori a 0,85 poiché con valori superiori, pur essendo i miceti in grado di replicare, sono i batteri presenti sulle derrate a divenire la microflora dominante inibendo così l accrescimento fungino. Altro fattore molto importante è rappresentato dalla temperatura: la maggior parte delle muffe si sviluppa tra i 15 ed i 30 C anche se sono state ritrovate colonie di Penicillium su pesce congelato a -20 C ed è noto che l Aspergillus 4

4 fumigantus è in grado di infestare le prime vie aeree alla temperatura corporea. Per quanto riguarda gli altri fattori è possibile affermare che le muffe sono organismi aerobi che si sviluppano sulla superficie dei substrati a valori di ph solitamente compresi tra 4 ed 8, nonostante si possano riscontrare germinazioni micotiche anche a valori sia superiori che inferiori (Haouet e Altissimi, 2003a). Sulla base di queste affermazioni appare evidente che la contaminazione fungina varia di anno in anno in relazione alle condizioni climatiche; è stato accertato che nelle annate fredde ed umide è maggiore la contaminazione da Fusarium mentre in quelle più calde e secche prevale quella da Aspergillus e Penicillium (Borreani et al., 2003). Fattore Minimo Ottimo Massimo Attività dell acqua (a W ) 0,61 0,80-0,95 1,00 Temperatura ph 2,0 4,5-6,5 8,0 Ossigeno 0,14 >2,0 - Anidride carbonica - <10,0 >15,0 Tabella 2 Valori ottimali per lo sviluppo fungino. La formazione di micotossine è strettamente correlata alla crescita fungina anche se la presenza di muffe su una derrata alimentare non implica necessariamente la presenza di micotossine; viceversa, derrate apparentemente integre possono essere contaminate da micotossine in modo considerevole (Miraglia e Brera, 1999; Haouet e Altissimi, 2003b) Se sussistono le condizioni descritte, lo sviluppo delle muffe appare poco influenzato dalla natura del substrato mentre per la produzione di micotossine il tipo di substrato e le condizioni ambientali acquistano dei limiti più marcati; infatti per la tossinogenesi è necessaria un umidità del substrato superiore a quella richiesta per lo sviluppo micotico ed è sempre vicina a valori di a w di 5

5 0,90. Per la loro produzione è comunque necessario il verificarsi di una condizione di squilibrio nutrizionale che porti all attuazione di vie metaboliche secondarie (Miraglia e Brera, 1999; Haouet e Altissimi, 2003a). La sintesi di micotossine si inquadra nel metabolismo secondario nel quale sono inclusi vari prodotti: antibiotici, inibitori enzimatici, alcaloidi e gibberelline (Tabella 3). Con il termine di metabolita secondario si intende il prodotto finale di una via metabolica che non esplica alcun ruolo nell economia dell organismo produttore (Picci, 1996). Intermedio Prodotto primario Prodotto secondario Fenilalanina Ocratossina A Piocianina Acido Scichimico Alcaloidi ergot Triptofano Cloramfenicolo Paxillina Malonil Co A Acidi grassi Patulina Aflatossine Tetracicline Acido Mevalonico Steroli Gibberelline Tossina T-2 Alcaloidi ergot Acetolattato Valina Penicillina, Cefalosporine Tabella 3 Esempi di intermedi metabolici producenti metaboliti primari e secondari. L importanza di queste molecole in ambito tossicologico ed ispettivo è dovuta al fatto che la loro ingestione, con mangimi, cereali e foraggi, da parte degli animali in produzione zootecnica è seguita da accumulo in vari organi e tessuti (fegato, rene, muscolo) o da eliminazione con il latte e le uova con conseguenze nocive per l uomo, abituale consumatore di alimenti di origine animale, come mostrato in Figura 1 (Tiecco, 2001). Un altra via d esposizione per l uomo, anche se statisticamente meno importante, è rappresentata dall inalazione di spore di funghi tossigeni presenti in elevate quantità in particolari ambienti di lavoro, nei quali si generano polveri di cereali contaminati, oppure in ambienti domestici umidi e poco aerati (Visconti, 1997). 6

6 Prodotti di scarto Ceppo fungino Mangimi Animali destinati all alimentazione umana Micotossine Cereali e semi oleaginosi Latte Carne Uova ALIMENTAZIONE UMANA Figura 1 Interazione tra micotossine e uomo. E da sottolineare il fatto che il maggior rischio di ingestione di micotossine è rappresentato dal consumo di quei prodotti che hanno ricevuto un minor numero di trattamenti fitosanitari, che, se da un lato riduce il rischio di residui chimici negli alimenti e nei mangimi, dall altro può favorire le condizioni adatte allo sviluppo di funghi produttori di micotossine (Visconti, 1997). D altra parte nemmeno i trattamenti tecnologici come la caseificazione, la cottura, la pastorizzazione o la sterilizzazione riducono la pericolosità delle micotossine, la maggior parte delle quali risulta termostabile (Miraglia e Brera, 1999). L impatto delle micotossine sulla salute dipende dalla quantità assunta con gli alimenti, dalla tossicità del composto, dal peso corporeo dell individuo, dalla presenza di altre micotossine (effetti sinergici), da fattori dietetici (Carratù e Cuomo, 2001) nonché dalla specie animale. I ruminanti infatti sono generalmente più resistenti rispetto ai monogastrici (Hussein e Brasel, 2001). 7

7 L assunzione di micotossine può causare intossicazioni acute o croniche. Le prime sono conseguenti all ingestione di una singola dose o di più dosi ingerite in un breve periodo di tempo e non coinvolgono mai i prodotti di origine animale in quanto solo nei prodotti vegetali è possibile raggiungere dosaggi così elevati di micotossine (Tabella 4); le seconde sono dovute all ingestione di piccole dosi ripetute nel tempo (Tiecco, 2001). Micotossine mg/kg Aflatossina B 1 9,0 Tricotecina 300 Fusarenone 3,4 Tossina T2 5,2 Ocratossina A 2,1-4,6 (suino) Tabella 4 DL 50 del topo per alcune micotossine. Fra le più importanti micotossicosi di tipo acuto che hanno colpito l uomo in passato, vengono ricordate l Ergotismo, responsabile della morte di moltissime persone nel Medioevo (Smith e Moss, 1985), e l Aluechia Alimentare Tossica (ATA), che colpì le popolazioni della Russia fra il 1942 ed il 1948 causando la morte di oltre centomila persone (Joffe, 1978). Altre due importanti micotossicosi sono l Aflatossicosi acuta, che ha interessato le popolazioni dell Asia sud-orientale, ed il Carcinoma Epatico Primario (PLC), tuttora presente nelle popolazioni dell Africa e dell Asia (Carratù e Cuomo, 2001). Importanti micotossicosi hanno colpito in passato anche animali di interesse zootecnico. Si ricordano la Stachibotrititossicosi, che causò la morte di decine di migliaia di cavalli in Russia nel 1930 (Moreau, 1979) e la Malattia X del tacchino. Non molto tempo fa è stato dimostrato che l ocratossina A (OTA) è implicata nell eziologia della Nefropatia Endemica dei Balcani (BEN) e nella Nefrite Cronica Interstiziale (CIN) (Carratù e Cuomo, 2001). 8

8 Le micotossine mostrano una notevole varietà di effetti biologici (Tabella 5) e possono essere responsabili di varie sindromi morbose quali lo sviluppo di importanti effetti gastrointestinali, nefrotossici, ematopoietici, teratogeni, mutageni, immunosopressivi e di quadri distrofici cronici con calo dell incremento ponderale, della produzione lattea e dell ovodeposizione (Tiecco, 2001; Brera, 2001). Alcune interferiscono con la cariocinesi causandone il blocco in telofase o in metafase determinando così leucopenia ed aplasia midollare; queste possono legarsi al DNA e determinare la comparsa di fenomeni oncogeni. Le micotossine possono danneggiare vari organi e tessuti; tuttavia la maggior parte di esse ha uno o due organi bersaglio anche se si possono riscontrare effetti secondari su altri distretti (Tiecco, 2001). Nel 1993 l Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha valutato l effetto cancerogeno di alcune micotossine, classificandole in tre gruppi (Peraica et al., 1999): Gruppo 1: cancerogene per l uomo (aflatossine B 1, B 2, G 1, G 2 ) Gruppo 2: potezialmente cancerogene per l uomo (Ocratossina A, Fumonisine B 1 e B 2, Fusarina C, Aflatossina M1) Gruppo 3: non classificabili come cancerogene per l uomo (Zearalenone, Nivalenolo, Deossinivalenolo, Tossina T-2, Fusarenone) Tipo di sindrome Epatotossiche Irritanti dermici Teratogene Cancerogene Nefrotossiche Neurotossiche Mutagene Endocrinomimetiche Radiomimetiche Necrotiche Micotossine Aflatossine, Ocratossina A Aflatossine, Ocratossina A, Patulina, Aflatossine,, Sterigmatocistina Ocratossina A, Aflatossine Alcaloidi ergot, Roquefortina Patulina, Aflatossine, Sterigmatocistina Zearalenone, Penitrem Stachibotriotossina Tabella 5 Micotossine e loro tossicità. 9

9 L elevata tossicità e diffusione di questi composti pone a rischio la salute umana ed animale e determina perdite economiche causate da un più basso rendimento. Per combattere la contaminazione in campo e in magazzino risulta pertanto necessario l attuazione di piani di prevenzione e la ricerca di metodi per detossificare le derrate contaminate (Carratù e Cuomo, 2001). Per quanto riguarda i piani di prevenzione, questi si basano sulla selezione di prodotti resistenti all attecchimento delle muffe, sul rispetto di buone norme di conservazione e sull utilizzo di composti in grado di inibire la produzione di micotossine. Quando non è possibile la prevenzione è necessario ricorrere alla decontaminazione e qualunque sia il mezzo con cui questa viene attuata deve rispondere ad alcuni criteri: il costo della decontaminazione non deve superare il valore economico delle derrate contaminate; i prodotti alimentari devono conservare il valore nutritivo e la palatabilità; le spore fungine devono essere distrutte per impedire la formazione di nuove tossine; le micotossine devono essere trasformate in composti non tossici. Tra i metodi di decontaminazione rientrano la selezione e la separazione manuale del prodotto contaminato, la pulitura a secco e il frazionamento; il trattamento con alcali ossidanti e adsorbenti è risultato inappropriato per l elevato costo e la limitata efficacia; la biodegradazione basata sull impiego di microrganismi quali Flavobacterium auratiacum B-184 si è dimostrata in grado di rimuovere in modo inreversibile l aflatossina dal latte determinando però la comparsa di una colorazione arancione dell alimento che ne limita il reale utilizzo; infine per la birra ed il vino viene adoperato il metodo della fermentazione (Carratù e Cuomo, 2001). Recenti studi hanno evidenziato la capacità di alcuni ceppi di Rhizophus oryzae di degradare l ocratossina A, lo zearalenone e la patulina; sono 10

10 comunque necessari ulteriori studi per individuare gli enzimi coinvolti in tale processo ed applicare queste scoperte nella pratica (Varga et al., 2004). Viste le problematiche legate alle contaminazione da micotossine la Comunità Europea ha fissato per le principali specie dei limiti legislativi sia per l alimentazione umana che per quella animale. Di seguito vengono presentate tre tabelle riassuntive: nella Tabella 6 si indicano i limiti massimi di aflatossine, in diverse matrici, come da Regolamento (CE) 466/2001 della commissione del 8 marzo 2001 e sue modifiche: Regolamento (CE) 472/2002 della commissione del 12 marzo 2002; Regolamento (CE) 2174/2003 della commissione, del 12 dicembre 2003; Regolamento (CE) 683/2004 della commissione del 13 aprile 2004; Regolamento (CE) 123/2005 della commissione del 26 gennaio Nella Tabella 7 si riportano i valori guida indicati da: a) Circolare del Ministero della Sanità del 9 giugno 1999 (pubblicata sulla Gazzetta Ufficiale del 11/6/99 serie generale N 135); b) Circolare del Ministero della Sanità del 28 novembre 2003 (pubblicata sulla Gazzetta Ufficiale del 10/12/2003 serie generale N 286) per le stesse aflatossine ed altre micotossine in una serie di prodotti alimentari. Nella Tabella 8 si indicano i limiti massimi delle Fusarium-tossine (deossinivalenolo, zearalenone e fumonisine) in diverse matrici come da Regolamento (CE) 856/2005 della commissione del 6 giugno Prodotto Arachidi, frutta a guscio, frutta secca e relativi prodotti derivati destinati al consumo umano diretto, ovvero all'utilizzazione quali ingredienti di derrate alimentari Arachidi da sottoporre a cernita o ad altri trattamenti fisici, prima del consumo umano o dell'impiego come ingredienti di derrate alimentari B1 B1+B2+G1+G2 M1 Ocratossina A Frutta a guscio e frutta secca da sottoporre a