MONITORAGGIO DI CORPI IDRICI SUPERFICIALI MEDIANTE TEST ECOTOSSICOLOGICI MULTISPECIE SU ACQUE E SEDIMENTI M.A.Pasini, M. Gazzola, A. Secondi, M.

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1 MONITORAGGIO DI CORPI IDRICI SUPERFICIALI MEDIANTE TEST ECOTOSSICOLOGICI MULTISPECIE SU ACQUE E SEDIMENTI M.A.Pasini, M. Gazzola, A. Secondi, M. Villa Riassunto In questo studio la caratterizzazione dei principali corsi d acqua superficiali della Provincia di Pavia è stata condotta mediante saggi tossicologici sull acqua, sui sedimenti e sulla miscela di entrambi. I saggi tossicologici impiegati sono : test di tossicità acuta con Daphnia magna e Vibrio fischeri sull acqua superficiale, test di fitotossicità con Lactuca sativa, Cucumis sativus e Lepidium sativum sui sedimenti in toto, test di tossicità cronica con Ceriodaphnia dubia su miscela di sedimenti ed acqua superficiale e test di genotossicità con Vicia faba su sedimenti. I saggi utilizzati rappresentano un utile ed economico strumento per la caratterizzazione delle acque e dei sedimenti,in linea con quanto previsto dal D.L. 152/99. Le analisi delle caratteristiche chimico fisiche dell acqua e del sedimento permettono di identificare e quantificare gli inquinanti più diffusi; tuttavia per predire il destino di un inquinante nell ambiente occorre conoscere anche come agisce sull ecosistema (Baudo e Muntau, 1985). Indicazioni necessarie ad un appropriata caratterizzazione della qualità ambientale, non possono prescindere dallo studio degli effetti diretti, delle interazioni e della biodisponibiltà dei tossici nell ambiente acquatico. Poiché generalmente sono sconosciute sia la miscela delle sostanze tossiche presenti, che la loro tossicità, la valutazione del rischio per la vita acquatica deve prevedere una serie di test basati su specie sia animali, che vegetali in modo tale da aumentare la rappresentatività delle informazioni ottenute. Infatti, se estrapolazioni tra specie appartenenti alla stessa famiglia sono ragionevolmente sicure, estrapolazioni tra classi ed ordini sono molto approssimative. E inoltre dimostrato che non esiste una specie universalmente sensibile, ma che le risposte agli inquinanti sono quanto mai variabili tra una specie e l altra (Wang e Freemark, 1995). Queste valutazioni suggeriscono una caratterizzazione ecotossicologica basata su saggi di tossicità che impiegano organismi appartenenti a diversi livelli trofici (Filipic,1995; Nielsen e Ranck, 1994; Dell Orto et al.,1997). Le specie più comunemente impiegate allo scopo sono rappresentate da alghe, batteri,crostacei e pesci. Tradizionalmente si rilevano solo gli effetti acuti, tuttavia tale valutazione non esclude che possano verificarsi effetti genotossici oppure sub-cronici e cronici conseguenti ad un esposizione a lungo termine. In molte situazioni infatti, la diluizione o la limitata biodisponibilità degli inquinanti ne fanno fonti di stress che perdurano nel tempo ma che raramente originano effetti di tipo acuto. In questo studio sono state monitorate le condizioni dei maggiori fiumi della provincia di Pavia prima della loro immissione nel fiume Po. Quest ultimo è stato invece campionato all ingresso ed all uscita dal territorio provinciale. Le stazioni per gli affluenti del Po sono state collocate a chiusura di bacino. La caratterizzazione della qualità del corpo idrico è stata condotta mediante saggi tossicologici sull acqua superficiale, sui sedimenti e sulla miscela di entrambi. Attraverso le informazioni ricavate dall insieme dei comparti che costituiscono l ambiente indagato si è cercato di ottenere un quadro il più possibile completo, utile alla quantificazione della qualità ambientale. Sulle acque superficiali, campione rappresentativo per una valutazione puntiforme atta a cogliere prevalentemente effetti immediati, sono stati condotti test di tossicità acuta con Vibrio fischeri e Daphnia magna. Sui sedimenti, comparto in cui convergono i processi di concentrazione degli inquinanti organici ed inorganici, si è scelto di condurre saggi di fitotossicità (germinazione ed allungamento radicale con

2 Lactuca sativa, Cucumis sativus e Lepidium sativum) e di genotossicità (test del micronucleo con Vicia faba). Nei sedimenti gli inquinanti, associati al particolato o in soluzione nell acqua interstiziale, possono raggiungere concentrazioni superiori a quelle della colonna d acqua sovrastante; tutto ciò evidenzia la necessità di non trascurare questo comparto (Burton, 1991). Infine sono stati condotti saggi anche sulla miscela dei due comparti, al fine lavorare in condizioni che cercano di riprodurre quelle naturali. In quest ultimo caso, esclusi preventivamente effetti di tipo acuto, si è proceduto all esecuzione di un saggio di tipo cronico con Ceriodaphnia dubia. MATERIALI E METODI Raccolta campioni I campioni costituti dalle acque superficiali e dai sedimenti sono stati raccolti nell arco di circa 30 giorni ed in due campagne, una invernale dal al ed una estiva dal al Sono stati conservati a 4 C al buio per tutto il periodo dell utilizzo. Per l esecuzione del test di tossicità acuta con Vibrio fischeri, i campioni di acqua superficiale sono stati filtrati su filtri di cellulosa del diametro di 0.45 µm. Saggi biologici Test di tossicità acuta a 24 h con Daphnia magna Sono stati utilizzati organismi di età inferiore alle 24 h. Il test è stato condotto a 20 C su campioni di acqua tal quale con fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio (IRSA, 1993). Alla fine della prova è stata valutata la mortalità delle dafnie espressa come percentuale di organismi immobili. Test di tossicità acuta a 15 con Vibrio fischeri La bioluminescenza emessa da una popolazione monospecifica di batteri Gram-negativi appartenenti alla specie Vibrio fischeri è stata utilizzata per un saggio a 15 minuti per la determinazione della percentuale di effetto rispetto al controllo (Sistema Microtox: comparison test). La prova è stata effettuata su campioni di acqua di superficie filtrata su membrana di cellulosa da 0.45 µm. Test di fitotossicità a 72 h con Lactuca sativa, Cucumis sativus e Lepidium sativum. Il test di fitotossicità ( germinazione ed allungamento radicale) è stato effettuato con tre semi, lattuga cetriolo e crescione sui sedimenti. I campioni sono stati utilizzati in toto al fine di ridurre al minimo la manipolazione (Baudo, comunicazione personale). Il saggio (IRSA,1983) è stato condotto per 72 ore al buio ed a 25 C. Alla fine della prova sono stati registrati il numero dei semi germinati e la lunghezza radicale; i due valori sono stati combinati in Indice di Germinazione. Test di tossicità cronica a 7 giorni con Ceriodaphnia dubia Giovani individui di Ceriodaphnia dubia sono stati esposti per 7 giorni ai campioni costituiti da una miscela di acqua superficiale e sedimento (1:1) alle condizioni standardizzate del metodo IRSA (Vigano, 1998)

3 Sono stati considerati tre end point: mortalità a lungo termine, accrescimento (lunghezza corporea dell adulto a fine saggio) e fertilità (numero di piccoli prodotto da ciascuna femmina nelle tre schiuse). Test di genotossicità a 96 ore con Vicia faba I semi di Vicia faba, conservati in ambiente fresco e ben areato, sono stati fatti germinare in 500 grammi di sedimento e, per il controllo, in 500 grammi di sabbia. La germinazione è avvenuta al buio ed a una temperatura di 20 C per un periodo di 96 ore (Pasini, 1994). Per ciascun campione sono stati utilizzati 4 semi. Per ciascun apice radicale sono state lette 1000 cellule ed i risultati vengono espressi come numero delle mitosi e dei micronuclei su 1000 cellule. Espressione dei risultati L immobilizzazione di Daphnia magna a 24 ore, la riduzione della bioluminescenza di Vibrio fischeri a 15 e la mortalità di Ceriodaphnia dubia nel test cronico a 7 giorni vengono espressi come percentuale di effetto rispetto al controllo. In base a quanto definito dalle metodiche di riferimento ed alla variabilità dei controlli (che si attesta intorno al 20%), valori che si discostano dal controllo più del 20% sono stati considerati differenti da quest ultimo. Per i test di fitotossicità, i due end-point valutati, germinazione ed allungamento radicale, vengono combinati in un Indice di Germinazione % (IRSA,1983): IG % = 100 (GsLs)/(GcLc) Gs=germinazione campione Gc=germinazione controllo Ls=lunghezza campione Lc=lunghezza controllo Dato che la variabilità dei controlli si attesta intorno al 20%, i dati vengono suddivisi nei seguenti intervalli cui corrispondono altrettanti colori: >120 stimolazione (colore azzurro) nessun effetto (colore verde) inibizione (colore giallo) <40 marcata inibizione (colore rosso) Per l analisi delle differenze rispetto al controllo degli end-point (accrescimento e fertilità) misurati nel test cronico a 7 giorni con Ceriodaphnia dubia, viene impiegato il test di Wilcoxon per dati non appaiati per p<0.05. Per quanto riguarda il test di genotossicità, il numero limitato di osservazioni non ha permesso la valutazione statistica dei dati. RISULTATI I risultati vengono presentati separatamente a seconda della matrice sulla quale sono stati eseguiti i test. In tabella 1 compaiono i dati dei saggi di tossicità acuta a 24h con Daphnia magna e a 15 con Vibrio fischeri. Sia in inverno, che in estate, non è stata riscontrata tossicità acuta su nessuno dei due organismi test. Per quanto riguarda i batteri bioluminescenti, si osserva sempre stimolazione che in soli tre casi (campagna estiva, Staffora, Terdoppio e Ticino) supera il limite convenzionale del 20% di effetto.

4 In tabella 2 vengono riassunti gli indici di germinazione ed allungamento radicale relativi alle prove di fitotossicità a 72 h con lattuga, cetriolo e crescione. Tali indici, inseriti nelle 4 fasce convenzionalmente introdotte per rappresentare gli effetti, evidenziano parecchi casi di stimolazione per i tre semi utilizzati (36 % ) ed alcuni casi di inibizione (16,6% ) con un caso solo di marcata inibizione. In un caso si osserva concordanza nelle risposte dei semi (tossicità in estate del Sesia). Il Po in inverno risulta tossico a Pieve ed a Spessa per lattuga e cetriolo, mentre stimola il crescione; in estate stimola la lattuga e non provoca effetti a cetriolo e crescione a Pieve, a Spessa risulta tossico per cetriolo e crescione. Gli altri corsi d acqua principalmente stimolano i tre semi. Il seme più sensibile alla stimolazione risulta essere i crescione; il seme meno sensibile sia alla stimolazione, sia all inibizione, il cetriolo. In tabella 3 si riportano gli end-point rilevati con il test di tossicità cronica a 7 giorni con Ceriodaphnia dubia. Sono stati esclusi effetti di tipo acuto dal momento che gli organismi erano tutti in vita dopo 24 h di esposizione. La morte degli adulti successiva alle 24 h è da considerare perciò un effetto subcronico. Tale evento (con un incidenza superiore al 20%) occorre nel 46% dei campioni in inverno e nel 33% in estate. Per il parametro accrescimento, in inverno si osservano valori significativamente inferiori al controllo nel 46 % dei campioni, un solo campione risulta essere stimolante rispetto al controllo; in estate tutti i campioni (eccetto il Ticino) risultano significativamente inferiori al controllo. La fertilità in inverno risulta superiore al controllo nel 46 % dei campioni e in un solo caso significativamente inferiore; in estate tutti i campioni mostrano una fertilità significativamente inferiore al controllo ( Test di Wilcoxon p<0.05). In tabella 4 sono riportati i risultati del test di genotossicità con Vicia faba riscontrati sui sedimenti di alcuni corsi d acqua campionati nella campagna estiva. Questo test, per problemi operativi, è limitato ad un numero ridotto di campioni. Dal confronto tra il n di mitosi presenti nel controllo e nei campioni si possono escludere fenomeni di citotossicità. Nel conteggio dei micronuclei è stata registrata un altissima variabilità dei dati, peraltro tipica di questo tipo di test. L alta presenza di micronuclei in alcuni apici radicali cresciuti a contatto con i campioni, è chiaramente dovuta ad effetti genotossici, sebbene questi non possano essere debitamente evidenziati mediante analisi statistica a causa del basso numero di repliche e della variabilità elevata. I sedimenti che hanno generato il maggior numero di micronuclei sono quelli raccolti nell Agogna, nel Naviglio e nell Olona Meridionale. Tab.1-Risultati del test di tossicità acuta sulle acque superficiali. Daphnia magna 24 h (% immobilizzazione) Vibrio fischeri 15 (% di effetto) STAZIONI INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE Fiume Po Pieve Fiume Sesia Torrente Agogna Torente Erbognone Torrente Staffora Torrente Terdoppio Torrente Coppa Torrente Scuropasso Fiume Ticino Canale Naviglio Torrente Versa Fiume Olona Meridionale Fiume Po Spessa Azzurro: stimolazione > 20%

5 Tab. 2-Risultati del test di fitotossicità su sedimenti. Lactuca sativa 72 h (IG%) Cucumis sativus 72 h (IG%) Lepidium sativum 72 h (IG%) STAZIONI INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE Fiume Po Pieve Fiume Sesia Torrente Agogna Torente Erbognone Torrente Staffora Torrente Terdoppio Torrente Coppa Torrente Scuropasso Fiume Ticino Canale Naviglio Torrente Versa Fiume Olona Merid Fiume Po Spessa Azzurro = >120 stimolazione Verde = nessun effetto Giallo = inibizione Rosso = <40 marcata inibizione Tab.3- Risultati del test di tossicità cronica su miscela di acqua superficiale e sedimento. Ceriodaphnia dubia 7 giorni STAZIONI MORTALITA % ACCRESCIMENTO (mm) (mediana) FERTILITA (n piccoli) (mediana) INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE Controllo Fiume Po Pieve (+) 0.72 (-) 37 (+) 6 (-) Fiume Sesia (-) 0.71(-) 17 3(-) Torrente Agogna (-) 31(+) 19(-) Torrente Erbognone (-) 27(+) 11(-) Torrente Staffora (-) 0.81(-) 5 17(-) Torrente Terdoppio (-) 31(+) 18(-) Torrente Coppa (-) 0.86(-) 11 6(-) Torrente Scuropasso 40 secca 0.88 (-) secca 11 Secca Fiume Ticino (+) 18(-) Canale Naviglio (-) 20(+) 7(-) Torrente Versa (-) 0.82(-) 11 8(-) Fiume Olona Merid (-) 0.75(-) 4 (-) 6(-) Fiume Po Spessa (-) 13 10(-) (+) parametri superiori al controllo; Test di Wilcoxon p<0.05 (-) parametri inferiori al controllo; Test di Wilcoxon p<0.05 Mortalità: Verde <20% nessun effetto Giallo 20-60% tossicità Rosso % marcata tossicità

6 Accrescimento e fertilità: Azzurro = >120 stimolazione Verde = nessun effetto Giallo = inibizione Rosso = <40 marcata inibizione Tab. 4:Risultati del test di genotossicità (test del micronucleo) ESTATE Vicia faba (96 h) STAZIONI MITOSI (n./1000 cell) MICRONUCLEI (n./1000 cell) repliche Media repliche media Controllo ,0 Torrente Agogna Torrente Staffora Torrente Scuropasso Fiume Ticino Canale Naviglio Fiume Olona Merid DISCUSSIONE Dall analisi dei dati si possono fare alcune considerazioni: Si conferma quanto già noto relativamente alle acque superficiali che, se non in casi particolari e con scarichi tossici in atto, non provocano tossicità acuta. Nel caso delle acque qui saggiate infatti, si assiste unicamente a fenomeni di biostimolazione a carico dei batteri bioluminescenti. Questo fenomeno si rileva sui corsi d acqua Staffora, Terdoppio e Ticino dove, in estate, per problemi di irrigazione, si assiste ad un massiccio prelievo di acqua ed alla conseguente concentrazione di nutrienti apportati dagli scarichi civili più o meno depurati. Un riscontro più diversificato ed interessante si ha dall analisi tossicologica dei sedimenti, concentratori naturali delle sostanze organiche ed inorganiche disciolte nell acqua. Gli Indici di Germinazione ottenuti dai tre semi impiegati mostrano un quadro differenziato di risposte tossicologiche. Si osserva in alcuni casi biostimolazione, in altri tossicità, in altri nessuna differenza rispetto al controllo con risposte variabili a seconda dei semi e del campione in esame. Il crescione risulta il seme più frequentemente stimolato, il cetriolo è il seme in genere meno sensibile tuttavia rileva più casi di tossicità in inverno che in estate. La lattuga ed il crescione sono più frequentemente stimolati in inverno. Anche in questo caso la biostimolazione si può ascrivere ad eccesso di nutrienti presenti nei sedimenti, e pertanto viene considerata un indicatore di perturbazione del sistema.

7 Considerando i tre end point di tossicità cronica, con Ceriodaphnia dubia, valutata sulla miscela di acqua e sedimento, si osserva che l ambiente idrico appare globalmente più stressato in estate quando sia l accrescimento che la fertilità sono caratterizzate da valori significativamente inferiori al controllo. In inverno invece, le stazioni in cui l ambiente è verosimilmente meno compromesso mostrano una buona capacità di ripresa ed i due parametri considerati assumono valori superiori o simili al controllo. La stimolazione che si registra in certi campioni è ascrivibile presumibilmente alla combinazione di una bassa biodisponibilità dei tossici ed aumentata disponibilità di cibo. Questo risulta, in accordo con Viganò (Viganò, 2000), nelle situazioni in cui l apporto di carbonio organico è generalmente di origine naturale. Il numero di stazioni in cui la mortalità a lungo termine (successiva alle 24h) supera il 20% è più alto in inverno che in estate. Tuttavia in questa stagione, tale mortalità è mediamente assai più elevata. E interessante notare come i campioni per i quali è stata evidenziata mortalità invernale sono anche quelli in cui i parametri fertilità e accrescimento rimangono inferiori al controllo. Una lettura trasversale dell intera caratterizzazione tossicologica porta ad evidenziare alcuni casi in cui sarebbe consigliabile l estensione delle indagini all intero corso d acqua e l impiego mirato di analisi chimico fisiche. L ambiente maggiormente compromesso è quello dell Olona M. dove, sia in estate che in inverno, si osservano effetti cronici (mortalità a lungo termine, riduzione significativa dell accrescimento e della fertilità) e biostimolazione per tutti i semi impiegati nel test di germinazione ed allungamento radicale. Il test di genotossicità mostra inoltre un alto numero di micronuclei. Il Sesia invece, risulta molto compromesso in estate mostrando fitotossicità per tutti i semi, mortalità a lungo termine e riduzione dell accrescimento e della fertilità, fenomeni che si attenuano nella stagione invernale. Accanto a fenomeni di fitotossicità e di tossicità cronica, è apparsa preponderante la biostimolazione. Questo fenomeno, che internazionalmente è noto come Ormesi, recentemente ha destato parecchio interesse ed il dibattito è tutt ora aperto. E noto infatti come attività deboli di uno stressore possano determinare un incremento del livello metabolico (Calabrese, 1994). Questo fenomeno, di per sé innocuo, è considerato da alcuni autori (Cairns e Niederlehner, 1995) un segnale di incipiente tossicità. In questo lavoro la biostimolazione non è stata valutata in maniera univoca, ma le risposte degli organismi sono state interpretate e discusse sulla base del confronto con le esperienze reperite in bibliografia. CONCLUSIONE Il D.L. 152/99 individua una batteria di test di tossicità acuta e cronica con diversi organismi, da applicare a campioni acquosi e/o sedimenti per la classificazione dello stato di qualità dei corpi idrici. Questa valutazione tossicologica, pur precedente all uscita del D.L., è in linea con quanto previsto dallo stesso. L indagine è stata condotta volutamente a maglie molto larghe: 11 stazioni a chiusura dei più importanti bacini della Provincia di Pavia e 2 stazioni sul Po, in ingresso ed in uscita dalla provincia stessa. Il fine di questo studio non è tanto cogliere l impatto delle sorgenti puntiformi di inquinamento (singoli scarichi), quanto contribuire, con gli strumenti messi a disposizione dall ecotossicolgia, al quality assessment dei corsi d acqua superficiali di un area a scala provinciale. I risultati raccolti vanno a sostegno dell approccio impiegato, che è stato dettato dalla volontà di unire l utilizzo di organismi diversi con la praticità ed il basso costo di allestimento delle prove, nell ottica di un loro impiego rutinario per il controllo sistematico dei corsi d acqua. Infine l impiego delle diverse matrici ha permesso di individuare che i sedimenti rappresentano il comparto più significativo per una valutazione della qualità ambientale.

8 BIBLIOGRAFIA Baudo R., Mountau H Riflessioni sulle aree problematiche in ecotossicologia Acqua-Aria 4: Burton G.A Assessing the toxicity of freshwater sediments. Environ. Toxicol. Chem., 10 : Cairns J. Niederlehner B.R Predictive ecotoxicology. In Casarett L. and Doull s J. (Eds.). Toxicolgy. Mc-Graw-Hill, New York, USA: Calabrese E.J Biological effects of low level exposures. Lewis Publishers, Boca Raton, USA: 302. Dell Orto N., Ciccotelli M. Cantelli D. Camatini M Sviluppo di un sistema di biomonitoraggio a tre componenti per la valutazione della qualità delle acque. Acqua-Aria 5: Filipic M,1995 Mutagenicity and toxicity of water extracts from Sora river area. Mutation Research, 342:1-8. IRSA 1993 Saggi di tossicità con Daphnia magna- Atti della giornata di studio organizzata dall Istituto Superiore per la Ricerca sulle Acque- Quaderno: IRSA, 1983: Analisi della fitotossicità della sostanza organica in decomposizione mediante bioassaggio Lepidium sativum.- Metodi Analitici per i Fanghi: Parametri biochimici e biologici- Quaderno IRSA, 64: Nielsen M.H., e Ranck J.,1994 Screenig of toxicity and genotoxicity in wastewater by the use of Allium test. Hereditas 121: Pasini M.A. Garavani M.:Valutazione degli effetti tossici e genotossici indotti da acque e sedimenti di corsi d acqua superficiale su apici radicali di Vicia faba-atti Seminario di Studi Dalla tossicologia alla Ecotossicologia, Pordenone settembre Viganò L Assesment of the toxicity of River Po sediments with Ceriodaphnia dubia Aquatic Toxicology. 47: Vigano L.,1998: Test di tossicità cronica (7giorni) con Ceriodaphnia dubia.-notiz.metodi Anal.Acque maggio 1998: Wang W., Freemark K The use of plants for environmental monitoring and assesment. Ecotoxicology and environmental safety. 30: