TRASCRIZIONE. TESTO: LEWIN s GENES X, CAPITOLO 19 LEWIN IL GENE VIII, CAPITOLO 9

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1 TRASCRIZIONE TESTO: LEWIN s GENES X, CAPITOLO 19 LEWIN IL GENE VIII, CAPITOLO 9

2 processo mediante il quale l informazione contenuta nel DNA (geni) viene trasferita all RNA

3 CLASSI DI RNA UNIVERSALI mrna: codifica le proteine trna: trasporto di aminoacidi per traduzione rrna: costituenti del Ribosoma SPECIFICI DI EUCARIOTI snrna: (piccoli RNA nucleari): assistono durante lo splicing (spliceosoma) altri snrna modificano gli rrna small RNA: microrna, piwirna, sirna RNA non codificante a funzione regolatoria (Nobel medicina 2006)

4 la TRASCRIZIONE è operata dalla RNA polimerasi stessa funzione dai batteri all uomo: caratteristiche e logica comune tipicamente proteine multisubunità alcune RNA pol. fagiche (T7 e SP6) e mitocondriali sono a singola subunità batteri: singola RNA pol; RNA è instabile (mrna degradato rapidamente, rrna, trna processati eucarioti: 3 RNA polimerasi Pol I, Pol II e Pol III; RNA viene modificato al 5' e al 3', complessato a proteine, sottoposto a taglio (rrna, trna e SPLICING), esportato dal nucleo

5 DNA RNA filamento CODIFICANTE: -orientamento 5-3 -stessa sequenza nel TRASCRITTO di RNA (U al posto di T) filamento STAMPO o TEMPLATE -costituisce lo STAMPO (viene usato per appaiare le basi) -è complementare al trascritto

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7 Ripasso della chimica degli acidi nucleici la trascrizione e unidirezionale: da 5 -->3, per aggiunta di nucleosidi 5 trifosfati al 3 OH della catena crescente con formazione di legame fosfodiesterico

8 osservando la struttura di un GENE: nucleotide +1 del DNA (del gene): corrisponde al primo ribonucleotide presente nel trascritto (start point) porzione a monte (upstream): contiene, quasi sempre, il promotore porzione a valle (downstream): si trova la regione codificante (in eucarioti introni ed esoni) ed il terminatore unità trascrizionale: tratto di DNA compreso tra punto di inizio e terminatore per la RNA polimerasi (può comprendere più geni)

9 TRASCRIZIONE processo diviso in più tappe riconoscimento legame complesso binario chiuso melting del DNA complesso binario aperto (isomerizzazione) polimerizzazione primi nt complesso ternario inizio allungamento 50 nt/s, 1 errore/10 4 nt incorporati terminazione

10 RNA polimerasi -utilizza ribonucleosidi 5 -trifosfato (ATP, GTP, UTP e CTP) richiede Mg++ -inizia da singolo nt (non ha bisogno di innesco) -(NMP)n+ NTP (NMP)n+1+ PP i ; PP i 2P i -ogni nucleotide è selezionato in base alle regole della complementarietà A:U e G:C e alla geometria della coppia di basi -usa come stampo il filamento template del DNA

11 RNA polimerasi batterica la macchina molecolare enzima dotato di struttura quaternaria (multisubunità) a 2 bb ws 460 kda 155 kda 151 kda 18/70 kda 37 kda 10 kda w

12 RNA polimerasi batterica struttura cristallografica (core enzima)

13 il nucleo o core enzima: è in grado, in linea di principio, di iniziare la Tx da qualsiasi punto della molecola di DNA l enzima (basico) ha affinità generale per qualunque sequenza casuale di DNA (acido), ove si lega con bassa stabilità (emivita minuti) in vivo nella cellula batterica: la polimerasi inizia la tx solo da particolari sequenze localizzate a monte dello start point dette PROMOTORI. come si spiega questo paradosso?

14 è l aggiunta del fattore di inizio, detto SIGMA, che converte il core enzima nella forma, OLOENZIMA, in grado di iniziare SOLO DAI PROMOTORI. sigma destabilizza i legami aspecifici del core enzima e conferisce specificità per i promotori l oloenzima ha una affinità per i promotori 1000 volte superiore a quella del core (emivita ore)

15 in una cellula di E.coli circa 7000 molecole di RNA polimerasi 1/3 delle RNA polimerasi sono sotto forma di oloenzima in parte legati a siti aspecifici in parte ai promotori 1/2 dei core enzima sono impegnati nella trascrizione sigma è in eccesso rispetto ai core enzima

16 come studiare le sequenze di DNA coinvolte nel legame con la polimerasi DNA footprinting allineamento sequenze a monte start point (sequenza consenso)

17 DNA DNA footprinting + DNAsi DNA + proteina + DNAsi * * * * * * * * * * tagli in tutte le possibili posizioni * * * * * * * * * tagli solo dove non è legata la proteina impronta

18 come sono i promotori? l allineamento delle sequenze geniche a monte dello start point hanno permesso di evidenziare delle corte regioni conservate (circa 6 bp)

19 SEQUENZA CONSENSO sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si trova con maggior frequenza (più spesso) quando vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali

20 SEQUENZA CONSENSO sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si trova con maggior frequenza (più spesso) quando vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali T 77 A 100 T 77 A 61 A 84 T 100 Pur

21 SEQUENZA CONSENSO sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si trova con maggior frequenza (più spesso) quando vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A 45 T 7780 A T A A T Pur struttura di un promotore batterico ideale/forza del promotore

22 Mutare a -35 o a -10 ha la stesse consequenze? Risposta: NO, perchè a) Esistono sia mutazioni favorenti (UP) che inibenti (DOWN b) Sperimentalmente, si e' visto che le mutazioni in -35 influenzano l'attacco iniziale della RNA polimerasi (formazione complesso chiuso). Mentre le mutazioni a -10 non hanno alcuna conseguenza per la formazione complesso chiuso ma rallentano la conversione a complesso aperto

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24 cosa sono i promotori? IL PROMOTORE E LASEQUENZA DI DNA GENOMICO RICHIESTA PER IL CORRETTO AGGANCIO DELLA RNA POLIMERASI E PER IL COMPIMENTO DELLA REAZIONE DI INIZIO

25 CARATTERISTICHE GENERALI DELLE SEQUENZE REGOLATORIE IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI MANCANZA di una ESTESA conservazione di sequenza PRESENZA di BREVI TRATTI CONSERVATI CRITICI PER LA FUNZIONE (sequenza -35, sequenza -10 e lo spacing tra esse nei batteri)

26 promotore procariotico esteso elemento UP (aumento della trascrizione): -non presente in tutti i promotori -aumenta l efficienza di trascrizione di circa 30 volte -è importante la posizione ( dal sito di inizio)

27 rrna

28 TRASCRIZIONE INIZIO

29 come avviene il contatto tra RNA polimerasi oloenzima e DNA è mediato dal fattore sigma

30 ALLINEAMENTO DI SEQUENZA TRA DIVERSI FATTORI SIGMA RIVELA REGIONI CODIFICANTI MOTIVI PROTEICI CONSERVATI

31 la struttura di sigma nel contesto dell oloenzima motivi helix turn helix

32 motivi helix turn helix (elica giro elica)

33 interazioni DNA proteine solco maggiore e solco minore dell elica del DNA il DNA ha una scanalatura principale e una secondaria. Le proteine che interagiscono con esso devono riconoscere sequenze specifiche. il "bordo" di ciascuna coppia di basi è esposto in superficie, con un suo preciso pattern di accettori/donatori di ponti H e di zone idrofobiche riconoscibile da proteine. particolarmente vero per scanalatura principale, che non a caso è il sito di legame generalmente più usato dalle proteine che interagiscono con il DNA come i fattori di trascrizione.

34 interazioni DNA - proteina codice di riconoscimento sul DNA dalla scanalatura principale ciascuna delle 4 configurazione proietta uno schema unico dalla scanalatura secondaria il quadro è più monotono

35 interazioni DNA - proteina codice di riconoscimento sul DNA dalla scanalatura principale ciascuna delle 4 configurazione proietta uno schema unico dalla scanalatura secondaria il quadro è più monotono

36 una proteina si lega al DNA perché RICONOSCE UNA SEQUENZA: la SUPERFICIE DELLA PROTEINA E COMPLEMENTARE ALLE CARATTERISTICHE DI SUPERFICIE DELLA DOPPIA ELICA NB: ci sono tanti contatti, ognuno debole per se, ma, sommati assicurano una interazione specifica e stabile

37 regione 4.2 di sigma interagisce con regione -35 regione 2.4 di sigma interagisce con regione -10

38 sigma solo (separato dal core) è incapace di legare il DNA, questa sua proprietà è inibita (autoinibita-frenata)

39 il fattore sigma (in rosa) nella struttura tridimensionale della RNA polimerasi di T.aquaticus

40 strutturalmente SIGMA si estende oltre il sito attivo, quasi come un'"antenna" che "cattura" il DNA e lo sistema "in fondo" al core enzyme nella tasca catalitica complesso binario chiuso complesso binario aperto

41 SIGMA CORE

42 come funziona sigma? RNA polimerasi incontra un dilemma nel conciliare inizio e allungamento. inizio richiede un legame FORTE e SPECIFICO esclusivamente ai PROMOTORI; allungamento un legame STABILE A TUTTE le SEQUENZE incontrate dall enzima durante la Tx. SOLUZIONE: SIGMA che garantisce il riconoscimento promotoriale serve SOLO all INIZIO; dopo aver passato la fase di inizio abortiva, si stacca e viene riciclato Sigma accelera questo passaggio l avidità per il DNA/RNA nascente (indipendentemente dalla sequenza) da parte della core Pol è sufficiente a mantenere il legame durante l allungamento

43 complesso terziario inizi abortivi: la polimerasi è ferma sul promotore sigma legato ostruisce il canale di uscita dell RNA il DNA viene tirato dentro la polimerasi, vengono polimerizzati alcuni nt (2-9) e poi rilasciati DNA e RNA (nuovo ciclo) solo quando sigma viene rilasciato la polimerasi lascia il promotore

44 la sintesi di RNA avviene nella bolla di trascrizione è la RNA pol (sigma) che crea la bolla di Tx quando si lega ad un promotore. il duplex di DNA e parzialmente (14 nt) e transitoriamente denaturato la bolla è sempre racchiusa nella RNA polimerasi

45 l RNA polimerasi cambia dimensione durante le fasi di inizio e protegge porzioni più o meno ampie della regione intorno allo start point

46 TRASCRIZIONE ALLUNGAMENTO

47 complesso di elengazione: macchina enzimatica complessa: svolge (DNA da tx) riavvolge (DNA già tx) stampa RNA funziona da correttore di bozze stacca l ibrido DNA/RNA

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49 Le subunita' beta sono il cuore catalitico della RNA pol procariotica alcuni farmaci, per es. Rifampicina, si attaccano a b in una posizione che impedisce l'allungamento perché impedisce la fuoriuscita dell RNA.

50 correzione RNA neosintetizzato (errore: 1 ogni ) quando viene incorporato un nucleotide sbagliato, viene sentito il mismatch e l RNA polimerasi corregge l errore mediante: editing pirofosfolitico reazione inversa della formazione legame fosfodiestereo il pirofosfato viene rilegato al nucleotide appena incorporato editing idrolitico RNA-pol torna indietro di 1 o più nucleotidi e taglia l RNA prodotto rimuovendo la sequenza errata è stimolato da fattori proteici (Gre)

51 una RNA polimerasi bloccata può riprendere la trascrizione quando il DNA è danneggiato quando mancano i nucleotidi l enzima (la bolla tx) fa retromarcia e rimane bloccata fino alla risoluzione del problema assistita da alcuni fattori proteici (GreA e GreB) taglia la regione 3 dell RNA il filamento stampo si trova quindi in posizione corretta e l allungamento può riprendere

52 la polimerasi svolgendo il DNA introduce superavvolgimenti positivi nella regione a valle (da trascrivere) che se non corretti, intralcerebbero la Tx il DNA che si riappaia a monte presenta dei superavvolgimenti negativi

53 due enzimi: girasi e topoisomerasi intervengono per ripristinare il normale stato di avvolgimento nel DNA girasi = enzimi che tolgono i superavvolgimenti positivi topoisomerasi = enzimi che introducono superavvolgimenti positivi

54 topoisomerasi I taglia un filamento e fa passare filamento complementare, ligazione

55 girasi (topoisomerasi II) taglia entrambi i filamenti incrocia il DNA e ricuce usa ATP per energia

56 riassumendo..

57 3 fasi della tx inizio: 3 passaggi. A) formazione complesso chiuso legame della polimerasi ad una speciale sequenza di dsdna, cioe al promotore. B) fase di complesso APERTO, in cui il duplex si separa per circa 14 basi= si libera il filamento stampo; i primi 2 nucleotidi vengono allineati nel sito attivo con il filamento stampo e polimerizzati; la polimerasi comincia polimerizzare in direzione 3, fino a fare un frammento di 10 basi; in questa fase la polimerasi va avanti ed indietro = inizi abortivi (rilasciando i piccoli frammenti trascritti e ripartendo dal +1) C) formazione di un complesso ternario (DNA RNA e Polimerasi) stabile. Fino a questo stadio la polimerasi non ha lasciato il promotore Allungamento la polimerasi volge e svolge il DNA e sintetizza il trascritto (problema topologico, next slide). C e un cambio conformazionale che ancora stabilmente la pol al DNA. Terminazione. Fine della Tx e rilascio del trascritto primario In batteri, esistono ben precise sequenze di terminazione (terminatore) In eucarioti non c e un vero e proprio terminatore. Vedremo più avanti

58 espressione genica

59 la trascrizione copia selettivamente discrete porzioni di genoma, e ne fa anche migliaia di copie ma non tutti i geni vengono utilizzati nello stesso momento e non tutti con la stessa intensità controllo dell espressione genica

60 1) l'espressione genica è energicamente costosa (fare RNA e proteine richiede molto dispendio energetico per la cellula) 2) l espressione contemporanea di tutti i geni causerebbe una tale cacofonia regolatoria e strutturale da risultare incompatibile con la vita (per es. differenziamento, sporulazione etc) CONTROLLO DELL'ESPRESSIONE GENICA E' CENTRALE ALLA VITA (e quindi anche nella malattia)

61 la regolazione è dettata dal contesto cellulare, da molteplici stimoli, dalle necessità la regolazione è qualitativa (questo gene SI e l altro NO) ma è anche profondamente quantitativa (accendo un gene e lo trascrivo oppure milioni di volte... e come dove e quando mi fermo???) l espressione genica è differenziale

62 cosa significa espressione genica differenziale? capacità di esprimere una parte del proprio repertorio genico nella giusta combinazione, in momenti diversi ed in siti diversi. lo sviluppo embrionale e la omeostasi (capacità di mantenere un equilibrio) dei tessuti degli organismi pluricellulari, o la capacità di rispondere alle variazioni ambientali e la capacità di differenziare (sporulazione) nei batteri sono straordinari esempi di differential gene expression

63 controllo dell espressione genica

64 controllo dell espressione genica l espressione può essere regolata a vari livelli pre trascrizionale (negli eucarioti) trascrizionale (il più importante e diffuso) post-trascrizionale (soprattutto negli eucarioti) traduzionale co e post-traduzionale (il più veloce e dispendioso)

65 elementi trans attivi - elementi cis attivi un regolatore è elemento trans attivo (diffusibile): RNA pol, fattori di trascrizione, mirna ecc. agisce su qualunque copia del suo bersaglio il sito di legame (bersaglio) sul DNA/RNA è elemento cis attivo (promotore, operatore, enhancer ecc.) ha effetto solo sul DNA adiacente